Isolamento e caratterizzazione di uno stipite di virus della peritonite

Isolamento e caratterizzazione di uno stipite
di virus della peritonite infettiva felina
CANIO BUONAVOGLIA,
PAOLA SAGAZIO,
FRANCESCO CIRONE,
MARIA TEMPESTA
Istituto di Malattie Infettive e Parassitarie
degli Animali
Università degli Studi di Bari
C.P.7 - 70042 Valenzano (BA)
FULVIO MARSILIO
Istituto di Malattie Infettive degli Animali
“M. Compagnucci”
Università degli Studi di Teramo
Loc. Piano d’Accio
64020 Nepezzano (TE)
INTRODUZIONE
La peritonite infettiva felina (FIP) è una malattia infettiva e contagiosa, con decorso solitamente fatale, che colpisce i gatti domestici e numerose specie di felidi selvatici,
tra cui ghepardi (eccezionalmente sensibili), linci, giaguari,
leopardi e puma1.
L’agente eziologico (FIPV), appartenente alla famiglia
Coronaviridae, fu isolato e descritto per la prima volta da
Ward nel 19702 e classificato come coronavirus nel 19793.
Sono noti nel gatto anche altri coronavirus a tropismo
enterico, Feline Enteric Coronavirus (FECV), che, al contrario di FIPV, causano una forma molto lieve di enterite,
ma possono rendere difficoltosa la diagnosi sierologica
della FIP in quanto gli anticorpi indotti da FECV crossreagiscono con FIPV.
Gli stipiti di FIPV e FECV possono presentare notevoli
variazioni del potere patogeno. Sono inoltre noti stipiti di
coronavirus felini che possono determinare sia enterite che
una fatale peritonite.
Per spiegare l’esistenza di tali ceppi intermedi e l’affinità antigenica tra FIPV e FECV sono state ipotizzate due
teorie: 1) i coronavirus felini potrebbero essere biotipi differenti di un unico virus4; 2) FIPV deriverebbe da FECV a
seguito di un processo di mutazione o di ricombinazione
nel tratto gastrointestinale di un gatto infetto5-6.
I coronavirus sono virus ad RNA monocatenario con
polarità positiva, hanno forma sferica/pleomorfa, dimensioni 60-200 nm, nucleocapside elicoidale, sono muniti di
envelope dal quale diparte una frangia di spikes o peplomeri, a forma di clava o di petalo, che nell’insieme ricorda
la corona del sole, da cui il nome dato alla famiglia.
Il virus coltiva nelle linee cellulari NL-FK (Norden line
feline kidney), Fcwf-4 (felis catus whole fetus) e CRFK
(Crandell feline kidney), determinando un effetto citopatico caratterizzato da cellule arrotondate e cellule giganti
multinucleate (8 -10 nuclei)7-8.
L’infezione si può trasmettere con l’ingestione o l’inalazione di materiale contenente il virus, presente nelle feci e
nelle secrezioni oro-nasali di gatti infetti.
Il periodo di incubazione della malattia varia da 2 settimane a mesi o anni4.
Una volta penetrato attraverso la via oro-nasale, FIPV
replica nelle cellule epiteliali faringee, respiratorie9-4 o intestinali10. A questa prima replicazione segue una viremia
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PATOLOGIA FELINA
Veterinaria, Anno 9, n. 1, Marzo 1995
Isolamento e caratterizzazione di uno stipite di virus della peritonite infettiva felina
associata prevalentemente ai monociti11, quindi il virus si
localizza nei macrofagi di organi reticoloendoteliali e a
livello perivascolare12. FIPV può determinare piogranulomi necrotizzanti, flebiti e trombosi12.
Jacobse-Geels et al. hanno dimostrato, in corso di infezione da FIPV, la deposizione di immunocomplessi e di
complemento13-14, la cui attivazione richiama mediatori
infiammatori quali IL1, IL6, leucotriene B4 e PgE2, che
assumono un ruolo fondamentale nella patogenesi della
malattia.
Fra i meccanismi patogenetici della FIP è stata anche
presa in considerazione una esaltazione anticorpo dipendente (ADE) dell’infezione dei macrofagi da parte di
FIPV15-16-17-18-19, probabilmente perché gli anticorpi riescono a potenziare l’interazione tra virus e recettore cellulare
20-21-22
.
Questo fenomeno potrebbe spiegare l’apparente “anomalia” per cui, a seguito di infezione con FIPV, gatti con
anticorpi verso i coronavirus sviluppano una forma di
malattia più grave rispetto a gatti sieronegativi.
La peritonite infettiva felina può manifestarsi clinicamente in una forma effusiva o umida, caratterizzata dalla
presenza di un essudato ricco di fibrina in cavità peritoneale, pleurica, pericardica e nello spazio subcapsulare
renale e in una forma non effusiva o secca, in cui sono presenti lesioni piogranulomatose nei vari parenchimi.
Talvolta può verificarsi una combinazione delle due
forme caratterizzata dalla presenza di granulomi multipli e
da un essudato limitato e localizzato.
Nella forma essudativa della malattia sono presenti sintomi di carattere generale riferibili a disidratazione, anoressia, perdita di peso, apatia e febbre.
I sintomi specifici, invece, sono in relazione al sito
dell’effusione: la distensione addominale, generalmente
non dolorosa, si manifesta in caso di versamento in cavità
peritoneale; la dispnea può conseguire ad una significativa
effusione pleurica; sintomi di cuore polmonare possono
accompagnare la effusione pericardica.
L’ittero e l’insufficienza pancreatica, esocrina ed endocrina, possono derivare dall’estensione del processo
infiammatorio dal peritoneo al parenchima epatico e pancreatico.
Nella forma non effusiva la febbre elevata può rappresentare l’unico sintomo clinico evidente. Sono frequentemente osservate patologie a carico dell’occhio (irite, uveite, corioretinite, emorragie, distacchi retinici e panoftalmite) e del SNC (paresi, atassia, nistagmo e alterazioni comportamentali).
Il decorso della malattia è rapido nella forma effusiva,
con morte del soggetto nel giro di alcune settimane o mesi,
mentre la forma non effusiva può protrarsi per diversi
mesi, soprattutto nei casi in cui vi è solo l’interessamento
oculare.
Nella presente nota viene riportato l’isolamento e la
caratterizzazione di uno stipite di FIPV da un gatto con
manifestazioni cliniche.
MATERIALI E METODI
Caso clinico e raccolta dei campioni
Gli esami virologici sono stati eseguiti su un gatto per92
siano di 15 mesi di età che da circa un mese presentava
ipertermia, depressione del sensorio, ascite ed ittero. Non
erano stati effettuati esami clinici di laboratorio.
Un campione di 10 ml di liquido peritoneale è stato
centrifugato a 800 g per 20’ e il sedimento cellulare è stato
utilizzato per l’infezione delle cellule.
È stato inoltre prelevato un campione di sangue per la
determinazione degli anticorpi verso FIPV utilizzando il
test di immunofluorescenza indiretta su cellule infette con
lo stipite FIPV isolato.
Cellule
È stata utilizata la linea cellulare Crandell feline kidney
(CRFK) sviluppata in terreno Eagle minimal essential
medium (E-MEM) con il 10% di siero fetale bovino.
Le cellule sono state cocoltivate con il sedimento del
liquido peritoneale in rapporto 1 : 5.
Dopo 7 giorni i monostrati cellulari sono stati tripsinizzati e nuovamente cocoltivati con cellule CRFK non infette.
Le cellule sono state osservate quotidianamente al
microscopio e, nel caso di comparsa di effetto citopatico
(ECP), sono state sottoposte a congelamento. Il criolisato
era poi utilizzato per effettuare i passaggi successivi.
Immunofluorescenza indiretta (IFI)
Sulle cellule inoculate con il criolisato è stato effettuato
il test di immunofluorescenza indiretta utilizzando il siero
del gatto da cui è stato prelevato il liquido ascitico e 4
anticorpi monoclonali (MoAbs) verso i coronavirus gentilmente forniti dal dr. Chappuis (Rhone-Merieux-Lione
Francia). Sono state inoltre saggiate anche cellule A72
infettate con uno stipite di coronavirus del cane (CCV).
La reattività dei MoAbs, in base alle informazioni del
dr. Chappuis, è la seguente:
n. 15 A 9-9
riconosce tutti i coronavirus
n. 24 H 6-4
riconosce i coronavirus di origine felina e
canina
n. 18 F 2 -11 riconosce i coronavirus felini
n. 19 E 8-4
riconosce solo i coronavirus della FIP.
Metodo delle placche
Monostrati cellulari di 24h sono stati inoculati con diluizioni logaritmiche del virus isolato partendo da 10-1 fino a
10-7. Dopo 60’ di contatto a 37°C è stato asportato il liquido in eccesso ed è stato aggiunto terreno E-MEM contenente 1% di metilcellulosa. Dopo 5 giorni di incubazione
a 37°C, le cellule sono state fissate con formalina al 10%
per 20’e poi colorate con una soluzione acquosa all’1% di
cristal violetto.
RISULTATI
Nei monostrati cellulari (cocolture), dopo 5 giorni di
incubazione, è stata notata la comparsa di un ECP caratterizzato da cellule arrotondate e picnotiche raggruppate a
focolai (Fig. 1).
Nei giorni successivi ECP è aumentato e si poteva osservare, in alcune zone, la rarefazione e successiva distruzione
del monostrato (Fig. 2).
FIGURA 1 - Cellule CRFK con iniziale effetto citopatico. 100x.
FIGURA 3 - Immunofluorescenza per FIPV su cellule CRFK. 200x.
isolato a formare sincizi.
In Italia sono state eseguite diverse ricerche sulla FIP da
Rosmini e Simoni 23, da Renzoni et al.24-25, da Abramo et
al.26, da Faravelli et al. 27 da Bechtle et al.28 e da Giordani e
Gerardi 29.
L’isolamento di uno stipite FIPV rappresenta una tappa
fondamentale per poter effettuare studi di patogenicità su
gatti, e, soprattutto, per poter confrontare il virus isolato
con gli altri stipiti noti isolati in altri Paesi.
Parole chiave
Gatto, peritonite infettiva, virus, isolamento.
FIGURA 2 - Cellule CRFK con avanzato effetto citopatico. 100x.
Key words
Cat, infectious peritonitis virus, isolation.
Nei passaggi successivi, il tempo di comparsa di ECP si
è accorciato e, in genere, a 48h si poteva osservare la completa distruzione del monostrato.
Nelle cellule infette sottoposte al test di immunofluorescenza indiretta con il siero del gatto è stata osservata una
tipica fluorescenza localizzata al citoplasma (Fig. 3).
La caratterizzazione con i MoAbs ha evidenziato reattività con tutti e quattro gli anticorpi utilizzati, mentre sulle
cellule A72 infettate con CCV è stata osservata reattività
solo con i monoclonali 15 A 9-9 e 24 H 6-4.
Le placche indotte dal virus isolato sono risultate
alquanto omogenee sul piano morfologico e, generalmente, di piccole dimensioni.
Il titolo del virus è risultato pari a 8 x 105 UFP /0,2 ml.
Il siero del gatto ha evidenziato un titolo anticorpale
pari a 1: 1280.
RIASSUNTO
Gli AA descrivono l’isolamento di uno stipite di virus
della peritonite infettiva felina da un gatto con ascite e ittero. Il virus è stato caratterizzato con anticorpi monoclonali.
SUMMARY
The isolation of a strain of feline infectious peritonitis
virus from a cat with ascites and icterus is reported. FIPV
strain was characterized with monoclonal antibodies.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
DISCUSSIONE
La cocoltura dei macrofagi peritoneali del gatto con cellule CRFK ha permesso l’isolamento di un coronavirus
che, alle prove di caratterizzazione con MoAbs, è risultato
essere uno stipite di FIPV.
Dopo la fase di adattamento al substrato colturale, lo
stipite isolato è stato in grado di indurre un rapido ECP
(entro 24-48 h) caratterizzato da una lisi completa del
monostrato cellulare.
È stata inoltre notata una scarsa attitudine dello stipite
3.
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