dimeri di timina

LE MUTAZIONI POSSONO ESSERE SPONTANEE O INDOTTE
Avvengono in assenza
di uno specifico agente
Sono indotte
induttore
da agenti mutageni
• Cause della mutazione spontanea
- Tautomeria delle basi del DNA
- Errori della DNA polimerasi
- Difetti nei sistemi di riparazione
- Trasposoni o Retrotrasposoni attivi (es. linea di mais con trasposone Mu attivo)
Sostanze mutagene naturalmente presenti nell’ambiente
Condizioni genetiche particolari (cromosomi dicentrici, gene sticky di mais)
Sbalzi di temperatura  poliploidia, aneuploidia
TASSO DI MUTAZIONE SPONTANEA IN ALCUNI ORGANISMI
Tasso di mutazione spontanea di geni di organismi diversi.
Organismo
carattere
r -> r+
h+ -> h
*
tasso di
mutazione
1x10-8
3x10-9
fago
lisi
ambito d’ospite
Escherichia coli
resistenza alla penicillina
pens->penr
resistenza alla streptomicina strs->strr
istidina
his+->hishis-->his+
arginina
arg-->arg+
triptofano
trp-->trp+
1x10-7
4x10-10
2x10-6
4x10-8
4x10-9
6x10-8
Zea mays
cariosside porpora
colore dell’aleurone
cariosside grinzosa
Pr -> pr
C -> c
Sh -> sh
1x10-5
2x10-6
1x10-6
Drosophila melanogaster
corpo
corpo
occhi
occhi
e+ -> e
y+ -> y
w+ -> w
bw+ -> bw
2x10-5
1x10-4
4x10-5
3x10-5
Mus musculus
pelo bruno
albinismo
b+ -> b
c+ -> c
4x10-7
1x10-6
Homo sapiens
microftalmia
retinoblastoma
sordità
5x10-6
1x10-5
5x10-5
emofilia A
emofilia B
sordità
idrocefalo
morbo di Parkinson
1x10-5
5x10-7
5x10-6
3x10-6
1x10-7
dominanti
autosomici
legati al sesso
nero
giallo
bianchi
bruni
FORME TAUTOMERICHE DELLE BASI DEL DNA
LE FORME TAUTOMERICHE RARE DELLE BASI COMPIONO
APPAIAMENTI ERRATI
L’APPAIAMENTO ERRATO DELLE BASI PORTA ALLA MUTAZIONE
• Meccanismo che porta alla sostituzione di base: errore di appaiamento a causa
della tautomeria delle basi durante la replicazione
ORIGINE SPONTANEA DI MUTAZIONI PER INSERZIONE O DELEZIONE
GLI ELEMENTI TRASPONIBILI COME FONTE DI MUTAZIONI SPONTANEE
 la reazione di trasposizione/integrazione nella sequenza bersaglio
Retro
LTR
LTR
LTR
LTR
LTR
LTR
Si producono duplicazioni dirette di brevi sequenze nella sequenza
bersaglio
 L’inserimento di un Elemento trasponibile in un gene causa la
perdita di funzione del gene
UN ESEMPIO DI MUTAZIONE DOVUTA ALL’ INSERZIONE DI UN
ELEMENTO TRASPONIBILE
Mutazione da Pinot nero a Pinot bianco
GRET1 (GRAPE RETROTRASPOSON 1)
è un retrotrasposone di tipo Gypsy che
durante la domesticazione si è inserito nel
gene codificante un fattore di trascrizione
(VvMybA1) fondamentale nella regolazione
della biosintesi delle antocianine,
inattivandolo.
I girasoli mutanti di Van Gogh
Il fenotipo crisantemoide è causato dalla
inserzione di un trasposone CACTA nel
promotore del gene Ha CyC2c
(CYCLOIDEA)
che codifica un fattore di trascrizione che
controlla la formazione dei fiori esterni del
capolino
L’ inserimento del Trasposone impedisce che
il gene venga bloccato così funziona e si
formano fiori simili a quelli esterni nel centro
del capolino
L’ ARANCIO ROSSO SICILIANO
IL GENE RUBY codifica un fattore di trascrizione che attiva la espressione del
gene coinvolto nella sintesi degli antociani
IL FREDDO ATTIVA LA TRACRIZIONE DI UN RETRO DI TIPO COPIA E QUESTO FAVORISCE LA
TRASCRIZIONE DI RUBY QUANDO SI ABBASSA LA TEMPERATURA PERCHE’
NELLA LTR E’ PRESENTE UN PROMOTORE CHE RISPONDE AL FREDDO
L’ ARANCIO ROSSO SICILIANO
LA POLPA BIANCA O GIALLA DELLA PESCA
VIA DELLA BIOSINTESI DEI
CAROTENI
Gene CCD4
che degrada i
carotenoidi
LA POLPA BIANCA O GIALLA DELLA PESCA
Gene CCD4
Gene CCD4
L’inserimento di un Retro di tipo Copia in un introne
inattiva il gene forse rendendo instabile il messaggero che
viene prodotto
CARATTERIZZAZIONE DEL LOCUS LTP DI GIRASOLE
Il gene LTP codifica una lipid transfer protein
In girasole è una famiglia multigenica
composta da 5 geni, in due geni si sono inseriti
Retrotrasposoni
giallo : sequenza codificante
viola : introne
Le regioni a monte di ciascun gene LTP contengono diverse sequenze cis-promotrici, indicando che, dopo la
duplicazione genica, le varie copie hanno acquisito una specificità di regolazione.
ORIGINE DELLE MUTAZIONI CROMOSOMICHE SPONTANEE
Ricombinazione tra sequenze ripetute
Crossing over
intracromatidico
Crossing-over
ineguale
Crossing-over
tra cromosomi
non omologhi
MUTAZIONI CROMOSOMICHE I NDOTTE DAI TRASPOSONI
Ricombinazione omologa
ineguale
Il crossing over tra trasposoni
sullo stesso cromosoma
produce delezioni e inversioni
DELEZIONI
INVERSIONI
LE MUTAZONI INDOTTE DA AGENTI MUTAGENI
Gli agenti mutageni si dividono in due categorie:
MUTAGENI CHIMICI: sostanze chimiche ad azione mutagena
MUTAGENI FISICI: radiazioni ionizzanti come raggi x; ; neutroni
radiazioni non ionizzanti come raggi UV
MUTAGENI CHIMICI:
1° gruppo
analoghi di basi
2° gruppo
agenti alchilanti
idrossilammina
acido nitroso
3° gruppo
sostanze intercalanti
1° gruppo: ANALOGHI DI BASI
2-aminopurina (2A P) analogo della Adenina
(a) Nel suo stato normale la 2AP si lega alla timina; (b) nel suo stato raro la 2AP si lega alla citosina.
5-bromouracile (5BU) analogo della Timina
(a) Nel suo stato normale il 5BU si appaia con l'adenina; (b) nel suo stato raro il 5BU si appaia con la guanina
MECCANISMO DI AZIONE DELLA 2-AMMINOPURINA
MECCANISMO DI AZIONE DEL 5-BROMOURACILE
2° gruppo: MODIFICATORI DI BASI
Azione di tre agenti modificatori di basi e appaiamento nel DNA delle basi modificate
•
L’ etilmetansulfonato (EMS), è
un agente alchilante, alchila la
guanina e la timina.
•
L'acido nitroso (HNO2 ) modifica la
guanina, la citosina e l'adenina.
(Deamminazione)
La deamminazione della citosina e
dell'adenina causa mutazione, la
deamminazione della guanina non
causa mutazione.
•
L'idrossilamina (NH2OH)
reagisce solo con la citosina
(idrossilazione)
AGENTI ALCHILANTI
• semplici: alchil-solfati (dimetil-solfato, dietil-solfato, etilen-etan-solfato)
composti N-nitroso (dimetilnitroso-amina, metilnitrosourea, N-alchil-N’-nitroN-nitrosoguanidina)
• ciclici: epossidi (ossido di etilene), lattoni (-propiolattone),
iprite, azoto-iprite, etileneimmina
Etil Metansulfonato
Dietil Sulfonato
Etilenimina
SITI PREFERENZIALI DI ALCHILAZIONE
MUTAGENICITÀ DEGLI ALCHILANTI
• meccanismo n. 1 errore di appaiamento
MUTAGENICITÀ DEGLI ALCHILANTI
• meccanismo n. 2 depurinazione
La depurinazione è la perdita di una purina, (in questo caso una metil-guanina) di una singola elica
di DNA. Lo scheletro zucchero-fosfato non è rotto.
COME UN ALCHILANTE PUÒ INDURRE LA MUTAZIONE
• la base alchilata viene rimossa
Alla 1a duplicazione, in corrispondenza della guanina mancante si può inserire, sull’elica
neoformata, uno qualunque dei quattro nucleotidi
Alla 2a duplicazione del DNA, ognuno dei nuovi nucleotidi inseriti si appaia correttamente con
la base complementare. Di conseguenza, alla coppia GC si possono sostituire, con uguale
frequenza, le coppie GC, AT, CG, TA.
3° gruppo: INTERCALANTI
• Struttura di agenti intercalanti: proflavina e arancio di acridina.
• Le molecole di proflavina o arancio di acridina (viola) si intercalano tra due basi (giallo) della molecola di DNA.
MUTAZIONI FRAMESHIFT
(b) Mutazione frameshift per inserzione,
causata dall'inserimento dell'agente
intercalante nell'elica stampo.
(c) Mutazione frameshift per delezione,
causata dall'inserimento dell'agente
intercalante nell'elica di neosintesi.
MUTAGENI FISICI
radiazioni ionizzanti: elettroni, particelle , neutroni e protoni (di natura corpuscolata)
raggi X, raggi , raggi cosmici (di natura elettromagnetica)
radiazioni non ionizzanti: raggi ultravioletti.
EFFETTO DIRETTO DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI
In alto: la radiazione ha provocato una lesione ai due bracci di un cromosoma (1): se le lesioni non sono
riparate, si può formare un anello più due frammenti (2) o lo scambio fra le estremità dei bracci
cromosomici (3).
In basso: due cromosomi hanno subìto una lesione in un braccio (4): se le lesioni non sono riparate, si può
avere scambio delle due estremità (5) o formazione di un dicentrico più due frammenti (6).
EFFETTO INDIRETTO DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI
• Attraverso il processo di ionizzazione cioè la formazione di elettroni e atomi ionizzati
A
A+ + e-
Gli ioni a loro volta collidono con altri atomi e producono il rilascio di altri elettroni
così si forma un cono di coppie di ioni lungo il percorso dei raggi X che attraversano la
materia vivente
Gli atomi ionizzati sono chimicamente molto reattivi e possono rompere i legami chimici
nel DNA
• Attraverso la formazione di radicali liberi, molecole molto reattive che rompono i legami
chimici nel DNA
EFFETTO DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI SUL DNA IN VITRO
Si possono avere rotture singole o doppie tra i legami fosfo-diesterici dell’elica, formazioni di
legami tra basi presenti sulla stessa elica ed alterazioni della struttura terziaria.
RELAZIONE TRA DOSE DI RAGGI X E FREQUENZA DI MUTAZIONI
INDOTTE
• La frequenza di mutazioni puntiformi è direttamente proporzionale alla dose utilizzata
(questo vale anche per le rotture cromosomiche singole)
Mutazioni recessive
letali legate all’X in
spermatozoi di
Drosophila
Non esiste un effetto soglia
1 Roengten di raggi X produce 2x109 coppie di ioni in 1 cc di
aria alla pressione atmosferica e alla T di 0°C
L’EFFETTO DELLE RADIAZIONI X È CUMULATIVO
In Drosophila la frequenza di mutazioni indotte è proporzionale alla dose sia che l’irraggiamento sia acuto che
cronico
C’è una relazione tra il tempo di esposizione alle radiazioni e la frequenza di mutazioni indotte
Nel topo si sono ottenuti risultati diversi
I RAGGI X SONO AGENTI MUTAGENI MOLTO UTILIZZATI
NEL MIGLIORAMENTO GENETICO
• I raggi X possono indurre sia mutazioni geniche ( inserzioni e delezioni e sostituzioni di basi)
che cromosomiche ( inversioni, delezioni, rotture cromosomiche e traslocazioni)
• Sono di facile utilizzazione pratica, gli apparecchi a raggi X non sono grandi attrezzature
• Sono utilizzati per l’irraggiamento di semi (o gemme) perché hanno capacità di penetrazione
attraverso i tessuti a differenza dei raggi UV che possono essere usati solo sul polline
RADIAZIONI NON IONIZZANTI
I raggi ultravioletti : non hanno energia sufficiente per produrre ionizzazioni però vengono assorbiti
dalle basi del DNA che diventano reattive e formano legami tra loro
DIMERI di TIMINA
• Fotoprodotti pirimidinici da radiazioni UV: La citosina idratata può dare appaiamenti errati
Molto più importante per l’induzione di mutazioni è la formazione dei dimeri di timina
I DIMERI DI TIMINA
I DIMERI DI TIMINA INDUCONO MUTAZIONI
• I dimeri perturbano la struttura a doppia elica del DNA
1) interferendo con una accurata replicazione
2) determinando l’intervento di enzimi per la riparazione che in certi casi (per es. in
E. coli) sono error-prone, cioè soggetti ad errore.
Sono quindi possibili sia delezioni che sostituzioni di basi.
Riparazione di un dimero di
timina per fotoriattivazione.
Riparazione per excisione di un dimero di timina e
di altri danni che inducono distorsione del DNA,
catalizzata dalla endonucleasi UvrABC.
Riepilogo dell’azione di alcuni agenti mutageni
agente
mutageno
effetto
sul DNA
a
transizioni
induzione di
transversioni
a
inserzioni
e delezioni
raggi X
radicali liberi inducono
rotture e cambiamenti di
basi
+
+
+
raggi UV
dimeri di pirimidine
GC->AT CG->TA
+/-
+
5-bromouracile
analogo della timina,raramente si appaia con G
AT->GC GC->AT
-
-
2-aminopurina
analogo dell’adenina,raramente sostituisce G
GC->AT AT->GC
-
-
acido
nitroso
deamina la citosina,la
adenina e la guanina
AT->GC GC->AT
-
-
idrossilammina
idrossila la citosina
-
-
GC->AT
etil-metan- alchila le basi;
sulfonato
errori di riparazione
+
+/-
-
NG
agisce sul punto di crescita, errori di replicazione
+
+
+
manganese
agisce sulla DNA
polimerasi
+
+/-
-
proflavina
si intercala fra le basi
-
-
+
arancio di
acridina
si intercala fra le basi
-
-
+
calore
depurinazione e
deaminazione
+
+/-
-