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CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
I microRNA nella placca aterosclerotica
1,2
1
Emma Raitoharju1, Niku Oksala , Terho Lehtimäki
1Department of Clinical Chemistry, Pirkanmaa Hospital District, Fimlab Laboratories and University of Tampere, School of
Medicine, Finland
2
Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, Tampere University Hospital, Finland
Traduzione a cura di Rossella Tomaiuolo
ABSTRACT
MicroRNA (miRNA) are noncoding RNA that regulate gene expression by hindering translation. miRNA expression
profiles have been shown to differ in vivo and in vitro in many cellular processes associated with cardiovascular
disease (CVD). The progression of CVD has also been shown to alter the blood miRNA profile in humans. Content:
We summarize the results of animal and cell experiments concerning the miRNA profile in the atherosclerotic process
and the changes which occur in the blood miRNA profile of individuals with CVD. We also survey the relationship of
these CVD-related miRNA and their expression in the human advanced atherosclerotic plaque, thereby providing
more insight into miRNA function in human atherosclerotic lesions. The miRNA miR-126, -134, -145, -146a, -198, 210, -340*, and -92a were found to be expressed differently in the blood of individuals affected and unaffected by
CVD. These differences paralleled those seen in tissue comparisons of miRNA expression in advanced
atherosclerotic plaques and healthy arteries. Furthermore, several miRNA associated with atherosclerosis in in vitro
studies (such as miR-10a, -126, -145, -146a/b, -185, -210, and -326) were expressed in plaques in a similar pattern
as was predicted by the in vitro experiments. The clinical implications of miRNA in atherosclerosis as biomarkers and
as possible drug targets are also reviewed. miRNA profiles in in vitro and in vivo studies as well as in human
peripheral blood are quite representative of the miRNA expression in human atherosclerotic plaques. miRNA appear
promising in terms of future clinical applications.
INTRODUZIONE
Secondo l’OMS, le malattie cardiovascolari (CVD) di
origine aterosclerotica rappresentano la principale causa
di mortalità a livello globale, con il 26,8% dei decessi tra
gli uomini e il 31,5% tra le donne. Al giorno d’oggi si
registra,
inoltre,
un
aumento
generalizzato
dell’aterosclerosi tra i soggetti di mezza età. Sulla base
di studi autoptici si è osservato, in effetti, che >80% dei
giovani adulti deceduti per cause non cardiache
presentava una stenosi >25% in almeno una delle
principali coronarie (1). In quasi la metà dei pazienti, gli
eventi cardiovascolari maggiori, come infarto del
miocardio o ictus, insorgono senza una diagnosi
pregressa di CVD. L’arresto cardiaco improvviso è alla
base del 10% della mortalità totale e del 40% di quella
dovuta a malattia coronarica. Si conoscono molti fattori di
rischio per l’arresto cardiaco improvviso (caratteristiche
dei pazienti, fattori demografici, stile di vita, condizioni
cliniche), ma il loro valore predittivo combinato è basso.
L’aggiunta di fattori lipoproteici ai modelli statistici
contenenti i fattori di rischio classici ha portato solo a un
lieve miglioramento della capacità di predire la CVD (2).
Il riconoscimento di pazienti ad alto rischio
cardiovascolare rimane quindi uno dei principali problemi
irrisolti nella pratica clinica.
I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA non
codificante, con funzione regolatoria, di piccole
dimensioni [~18–24 nucleotidi (nt)]. Regolano
negativamente l’espressione genica del loro bersaglio a
livello post-trascrizionale inibendo la traduzione o
provocando la degradazione del RNA messaggero
(mRNA). La 18a versione del “MicroRNA database”
riporta che nell'Homo sapiens sono stati identificati 1527
*Questo articolo è stato tradotto con il permesso dell’American Association for Clinical Chemistry (AACC). AACC non è responsabile
della correttezza della traduzione. Le opinioni presentate sono esclusivamente quelle degli Autori e non necessariamente quelle
dell’AACC o di Clinical Chemistry. Tradotto da Clin Chem 2013;59:1708-21 su permesso dell’Editore.
Copyright originale © 2013 American Association for Clinical Chemistry, Inc. In caso di citazione dell’articolo, riferirsi alla pubblicazione
originale in Clinical Chemistry.
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biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
precursori di miRNA e 1921 miRNA maturi. La differenza
tra il numero dei precursori e quello dei miRNA maturi
deriva dal fatto che un precursore di miRNA,
caratterizzato da una struttura a forcina detta “hairpin”,
può dare luogo a diversi miRNA (-3p e -5p oppure, ad
es., miR-21 e miR-21*). D’altro canto, singoli precursori
di miRNA diversi tra loro possono dare luogo alla stessa
sequenza, cioè a un unico miRNA maturo.
Il numero di miRNA identificati nell’uomo è
aumentato costantemente da quando queste molecole
sono state scoperte agli inizi del 21° secolo. E’ stata
addirittura avanzata l’ipotesi che l’espressione di più di
un terzo dei geni umani sia regolata da uno o più miRNA
e anche il numero di geni bersaglio è in aumento man
mano che vengono identificati nuovi miRNA.
I miRNA possono essere paragonati a dei piccoli
manager dell’espressione dei singoli geni e dei
“pathway” biologici. Tipi diversi di cellule hanno diversi
profili di espressione di miRNA: alcuni sono espressi
nella maggior parte delle cellule, altri sono espressi, in
via preferenziale o esclusiva, in specifici tipi di cellule. I
miRNA svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo,
regolando la formazione di tessuti e organi (3). Inoltre,
poiché sono stati identificati profili di miRNA associati a
specifici stati patologici, questi potrebbero essere usati
come “marker” diagnostici e prognostici per molte
malattie: questo è possibile poichè possono essere
individuati in modo affidabile e perchè, contrariamente al
mRNA, non si degradano rapidamente nel plasma o
negli altri fluidi corporei; inoltre, potrebbero rivestire un
ruolo nel caso del trattamento di alcune malattie perché
il loro livello di espressione può essere modificato.
Sono state pubblicate molte rassegne sugli effetti dei
miRNA sul metabolismo del colesterolo e nelle malattie
cardiache. In questo lavoro ci siamo prefissi di valutare il
ruolo dei miRNA nello sviluppo delle lesioni
aterosclerotiche e i cambiamenti che l’aterosclerosi può
indurre nel profilo dei miRNA delle varie frazioni
ematiche. Tali informazioni derivano da una ricerca
eseguita su colture cellulari, topo e uomo, con un’enfasi
particolare sui risultati degli studi su campioni umani.
L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di chiarire il
ruolo dei miRNA, spesso studiati nell'ambito
dell’aterosclerosi solamente con esperimenti in vivo e in
vitro, correlando i loro livelli di espressione in situ in
placche aterosclerotiche avanzate e nel tessuto
arterioso istologicamente sano, usando i dati del
“Tampere Vascular Study” (TVS) (4).
ATEROSCLEROSI
L’aterosclerosi è una malattia sistemica che colpisce
l’intero albero arterioso umano. Può portare a una
malattia vascolare diffusa (polivasculopatia), sotto forma
di coronaropatia, arteriopatia periferica e malattia
cerebrovascolare. Sebbene la mortalità cardiovascolare
sia legata a eventi che possono verificarsi in differenti
distretti dell’albero arterioso, la sua causa più frequente
è la malattia coronarica (CAD). Oltre ai fattori
intravascolari, sono molti i fattori sistemici che
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
contribuiscono al rischio di eventi coronarici acuti. Un
tempo si riteneva che l’aterosclerosi fosse una malattia
da accumulo lipidico, ma studi più recenti hanno
dimostrato
che
anche
l’immunità
innata
e
l’infiammazione svolgono un ruolo importante in tutti gli
stadi dell’aterosclerosi, dalla lesione iniziale alla rottura
della placca in fase avanzata (5).
L’arteria in condizioni fisiologiche è costituita da 3
strati: dalla parte più interna a quella più esterna si
distinguono le tonache intima, media e avventizia. La
comparsa di striature grasse e di lesioni è stata
riscontrata soprattutto nelle arterie muscolari di
dimensioni medio-grandi, nelle aree in cui il flusso
ematico è turbolento o dove la sua velocità diminuisce,
con un conseguente minor “shear stress” (sollecitazione
tangenziale). Il livello di “shear stress” influenza
l’espressione genica, la trasmissione del segnale a
cascata e la secrezione di citochine. La riduzione dello
“shear stress” endoteliale comporta anche un aumento
dell’accumulo
(“intake”),
della
produzione
e
dell’ossidazione delle LDL nelle striature grasse della
parete arteriosa (6). Le LDL ossidate (oxLDL) sono
citotossiche, dando luogo a un processo infiammatorio
localizzato che porta all’infiammazione cronica propria
dell’aterosclerosi e all’attivazione delle cellule endoteliali.
Tale processo infiammatorio aumenta l’espressione delle
molecole di adesione e l’infiltrazione dei leucociti.
Nell’intima i monociti si trasformano in macrofagi, che
internalizzano le lipoproteine modificate attraverso un
processo di endocitosi mediato da recettori. A seguito
dell’accumulo del colesterolo, i macrofagi si trasformano
in cellule schiumose. Man mano che le striature grasse
degenerano in lesioni aterosclerotiche, nell’intima
ispessita aumenta il numero di cellule della muscolatura
liscia vascolare (VSMC) sotto lo strato di macrofagi e
cellule schiumose. Le VSMC attivate producono anche
dei componenti della matrice extracellulare coinvolti
nell’evoluzione delle striature grasse ricche in lipidi in
lesioni fibrotiche più avanzate. Quando la quantità di
lipidi extracellulari aumenta e si forma una membrana
fibrosa dai contorni definiti, la lesione diventa un
ateroma.
La membrana fibrosa svolge un ruolo chiave nel
mantenimento della stabilità meccanica della placca. La
crescita di un ateroma stabile, in genere, non comporta
eventi acuti finché la stenosi non diventa importante dal
punto di vista emodinamico. Nella maggior parte dei
casi, l’ischemia o l’infarto tissutali sono causati dalla
rottura fisica della membrana fibrosa, con conseguente
rilascio di costituenti trombogenici della placca e
formazione di un trombo, che può provocare l’ostruzione
del flusso ematico nell’arteria. Esiste un’estrema
variabilità nelle alterazioni della superficie della placca
(fessure e ulcerazioni) presenti tra un ateroma e l’altro
(7). Studi dimostrano che la rottura della placca non è un
evento raro nella progressione dell’aterosclerosi e che
solo nel 11% dei casi la rottura è nuova, mentre nella
maggior parte dei casi sussistono rotture precedenti,
passate inosservate.
Nel sito della rottura sono spesso presenti macrofagi
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
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IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
e linfociti T attivati. Le cellule infiammatorie
destabilizzano la placca secernendo citochine
proinfiammatorie, proteasi, fattori di coagulazione e
molecole vasoattive (5). Queste molecole inibiscono la
formazione di una membrana fibrosa stabile, degradano
il collagene presente nella membrana stessa e avviano
la formazione del coagulo. La stabilità della placca è
influenzata anche dalla velocità della crescita cellulare,
dall’apoptosi e dal metabolismo lipidico della parete
vascolare.
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
processati da un altro enzima RNasi III, il Dicer. Tale
enzima riconosce i nucleotidi al 3′ del pre-miRNA, li lega
con il suo dominio PAZ (Piwi, Argonauta e Zwille) e,
scindendoli, forma il miRNA maturo. Il miRNA
processato è costituito da sporgenze di RNA a doppio
miRNA: BIOGENESI, FUNZIONI E TRASPORTO
INTERCELLULARE
Biogenesi dei miRNA
I miRNA sono trascritti dal genoma cellullare. La
maggior parte dei geni dei mammiferi codificanti miRNA
è localizzata in unità di trascrizione definite e la loro
espressione è regolata da promotori simili a quelli che si
osservano nei geni codificanti per le proteine. Altri
miRNA sono stati trovati negli introni e negli esoni dei
geni che codificano per le proteine (8). L’espressione dei
miRNA intragenici è per lo più regolata dal promotore del
gene ospite, il che spiega la sovrapponibilità dei pattern
di espressione tra miRNA e mRNA. Alcuni studi riportano
anche una regolazione dell’espressione dei miRNA
intragenici indipendente dal gene ospite (9), con
promotori propri e caratteristiche comunemente
associate alla trascrizione mediata dalla RNA polimerasi
II. I cluster di miRNA condividono un promotore e sono
co-regolati e trascritti come un lungo trascritto primario
(10). La maggior parte dei miRNA dei mammiferi è
trascritta dalla RNA polimerasi II, ma quelli associati agli
elementi nucleari sparsi di lunghezza limitata e quelli
derivanti da virus sono trascritti dalla RNA polimerasi III.
La maggior parte dei miRNA è trascritta come parte
di trascritti di miRNA più lunghi (pri-miRNA), di parecchie
kilobasi, con cappuccio metilico, “splicing” degli introni e
poliadenilazione. Nei pri-miRNA, le sequenze di miRNA
formano delle strutture secondarie, dette “stem–loop”,
che sono riconosciute da un complesso multiproteico
formato dall’enzima Drosha e la regione 8 critica per la
sindrome di Di George (DGCR8). Il DGCR8 lega l’RNA a
doppio filamento e la RNasi III Drosha opera il clivaggio
del doppio filamento a ~11 bp dalla base del filamento
stesso, lasciando due nt protrudenti all’estremità 3’. La
molecola di RNA neoformata, lunga 70–100 bp, è il
precursore del miRNA (pre-miRNA) (10). Per quanto più
raro, per i miRNA derivati dagli introni (mintroni) sembra
sussistere un altro “pathway” biogenetico: avendo le
stesse dimensioni dei pre-miRNA non devono essere
processati da Drosha; quindi, lo spliceosoma opera lo
“splicing” dei mintroni dai trascritti del gene ospite per
formare “loop” intermedi (“lariant”), che ricostituiscono la
struttura del pre-miRNA (Figura 1) (11).
I pre-miRNA sono riconosciuti dalla proteina
esportina 5 che li esporta dal nucleo attraverso il
complesso del poro nucleare in un processo dipendente
da RanGTP. Qui, i pre-miRNA sono ulteriormente
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biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
Figura 1
Biogenesi dei miRNA.
I miRNA possono essere prodotti attraverso “pathway” diversi, a
seconda che l’RNA sia codificato nel suo stesso gene o negli
introni o negli esoni dei geni che codificano per le proteine. I
miRNA codificati dai loro stessi geni sono trascritti come lunghi
pri-miRNA, poliadenilati e con “capping” al 5′; questa molecola è
poi scissa da Drosha in pre-miRNA più corti. I miRNA codificati
da geni codificanti proteine possono essere processati da mRNA
in un processo indipendente da Drosha, che forma comunque
un pre-miRNA a forma di “stem–loop”. Quindi, il pre-miRNA va
dal nucleo al citoplasma, dove è scisso da Dicer, un altro enzima
RNase III, e forma il miRNA maturo. Questa molecola di RNA a
doppio filamento è incorporata nel RISC (complesso di
silenziamento indotto da RNA). Il filamento temporaneo del
miRNA viene rimosso e degradato durante l’incorporazione. Il
miRNA a singolo filamento (filamento guida) porta il complesso
miRISC al mRNA bersaglio con adeguata complementarietà di
sequenza; quando miRISC lega mRNA avviene la degradazione
del mRNA o l’inibizione della traduzione per ingombro sterico. I
miRNA possono anche essere ritrasferiti nel nucleo, dove
possono regolare la trascrizione, oppure possono essere secreti
dalla cellula, ad es., attraverso esosomi, microvescicole, corpi
autosomici e lipoproteine.
PRO, promotore; E1, esone 1; E2, esone 2; Ago2, argonauta 2;
NPM1, nucleofosmina 1.
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
filamento di lunghezza di 22 bp e due nt da entrambe le
estremità. Questi miRNA maturi sono incorporati in
complessi di silenziamento indotti da RNA (RISC).
Mentre questo complesso si assembla, il “duplex” di
miRNA viene sciolto da un’elicasi e il filamento
temporaneo (miRNA*) degradato, lasciando il filamento
guida all’interno del miRISC. E' stato dimostrato che il
filamento con un legame di bp meno stabile nella sua
estremità 5′ viene più spesso selezionato come
filamento guida. E’ stata avanzata l’ipotesi che il Dicer, si
riposizioni dopo il clivaggio e, nella sua nuova posizione,
il dominio dell’elicasi nel Dicer, a seconda della stabilità
termodinamica delle estremità, incorpori il filamento
guida nel RISC (formando il miRISC) (12).
Funzione dei miRNA, trasporto dei miRNA e
trasmissione del segnale tra cellule e tessuti
Il filamento guida del miRNA conduce il miRISC
verso un mRNA bersaglio parzialmente complementare.
Questo complesso si lega alla sequenza “target” che si
trova più comunemente nella 3′ UTR (regione non
tradotta all'estremità 3′) del mRNA (10). Alcuni autori
hanno riportato anche la presenza di sequenze “target”
funzionali nella 5′ UTR e nell’“open reading frame” (13).
La regione “seed” (ossia, la regione iniziale) del miRNA
(i primi 2–8 nt) è particolarmente importante per il
riconoscimento del “target”. I programmi di predizione
utilizzano queste sequenze “seed” per predire gli mRNA
“target” dei miRNA, ma la sola esistenza di una
sequenza nel mRNA che lega la regione “seed” non
garantisce che avvenga il legame col miRNA o
l’inibizione della traduzione. Inoltre, a causa della
lunghezza limitata del “seed”, singoli miRNA potrebbero
legare centinaia di mRNA e singoli mRNA potrebbero
essere legati da parecchi miRNA.
Livelli diversi di complementarietà tra miRNA e
mRNA possono avere vari effetti sull’espressione
genica: se la complementarietà è perfetta, miRNA
funziona come un piccolo RNA interferente (“short
interfering RNA”, siRNA) e l'mRNA bersaglio viene
tagliato in modo sequenza-specifico dal complesso
miRISC. Ciò è tuttavia raro nei mammiferi, nei quali la
maggior parte dei miRNA lega il proprio “target” con una
complementarietà parziale, lasciando delle protuberanze
(“bulge”) nella neomolecola a doppio filamento
(miRNA–mRNA). I “bulge” ostacolano la funzione di
taglio del miRISC e questo tipo di legame porta
all’inibizione della traduzione e degradazione del mRNA
per deadenilazione (10). Si ipotizza che l’inibizione della
traduzione sia causata dalle interazioni del miRISC con
il meccanismo di avvio della traduzione stessa e
dall’ostacolo sterico dei ribosomi traduttori. Il legame
parzialmente complementare del miRISC può condurre
anche al reclutamento di complessi di deadenilasi e a
rimozione o accorciamento della coda di poli(A) del
mRNA. L’accorciamento o la rimozione completa della
coda di poli(A) induce la rimozione del cappuccio al 5′
del mRNA, che così viene rapidamente degradato al
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
5′–3′ dalle esoribonucleasi (ad es., la 5′–3′
esoribonucleasi 1) (10).
Alcuni studi ipotizzano che i miRNA svolgano anche
altri ruoli nelle cellule, tra cui quelli di attivatori
traduzionali (14) e, probabilmente, di regolatori
trascrizionali. Alcuni miRNA hanno una sequenza di
localizzazione nucleare e si trovano prevalentemente nel
nucleo invece che nel citoplasma, dove potrebbero
regolare la trascrizione genica (15). Sono stati identificati
miRNA anche nei mitocondri, dove probabilmente
regolano l’espressione genica.
I miRNA possono essere trasportati tra cellule e
tessuti. Nel sangue, i miRNA si trovano sia liberi che
all'interno di vescicole. Si pensa che i miRNA liberi siano
stabilizzati da complessi proteici, come le proteine del
RISC argonauta 2 (16) e nucleofosmina 1 (17). Il
meccanismo di rilascio di questi miRNA non è chiaro, ma
è probabile che siano liberati nel sangue a seguito del
rilascio passivo del contenuto di cellule necrotiche. In
corpi apoptotici, esosomi e microvescicole sono stati
trovati miRNA legati a membrane. L’ingresso dei miRNA
in queste vescicole può essere casuale, ma sono stati
anche ipotizzati meccanismi precisi [ad es., Zernecke et
al. hanno dimostrato che alcuni miRNA sono arricchiti
nei corpi apoptotici (18)]. E’ stato dimostrato che le
vescicole arricchite da miR-143/145 convogliano segnali
di ateroprotezione dalle cellule endoteliali alle VSMC
(19). miRNA circolanti sono stati trovati anche nelle
particelle HDL. E' stato riscontrato che la fuoriuscita di
miRNA per il trasporto alle HDL è regolata dalla
sfingomielinasi neutra e che la loro captazione da parte
delle cellule riceventi dipende dal recettore “scavenger”
di classe B tipo I (20). I miRNA circolanti sarebbero
anche coinvolti nella comunicazione intercellulare e,
potenzialmente, nella progressione di malattia (18).
miRNA NELLO SVILUPPO DEL SISTEMA
CARDIOVASCOLARE E NELLA BIOLOGIA
VASCOLARE
miRNA nello sviluppo del sistema cardiovascolare
I miRNA sono necessari per il corretto sviluppo del
sistema cardiovascolare. Topi con deficit di Dicer
muoiono a metà gestazione tra gli stadi embrionali E12,5
ed E14,5, con uno sviluppo vascolare gravemente
compromesso sia nell’embrione che nel sacco vitellino.
Più specificamente, la delezione dell’espressione del
Dicer nelle VSMC embrionali porta a mortalità ed
eccesso di sanguinamento. Inoltre, embrioni murini con
delezione specifica di Dicer a livello cardiaco muoiono
durante la gestazione. Tali embrioni presentano edema
pericardico e ventricoli poco sviluppati. Più nel dettaglio,
si è visto che i miRNA let-7f, miR-27b, -221, -222, -145,
-143, -21 e il “cluster” miR-17–92 svolgono un ruolo nello
sviluppo del sistema vascolare mentre i miR-1, -133, 208a, -208b e -499 hanno un ruolo nello sviluppo del
miocardio. Una rassegna dettagliata sul ruolo dei miRNA
nello sviluppo del sistema cardiovascolare è stata
pubblicata da Boettger e Braun (21).
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
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IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
miRNA nelle cellule della parete arteriosa, nei
leucociti circolanti, nel sangue periferico e
nelle lesioni aterosclerotiche
Cellule endoteliali
E’ stato dimostrato che miR-21 è sovra-regolato nelle
cellule endoteliali in risposta allo “shear stress” e che
l’espressione di miR-10a diminuisce nelle zone
predisposte all’aterosclerosi (22, 23). Sembrerebbe che
l’espressione del miR-155 protegga l’endotelio riducendo
l’espressione del recettore di tipo 1 dell'angiotensina II
(24) e che miR-126 sia espresso specificamente nelle
cellule endoteliali, dove modulerebbe il loro fenotipo e, in
particolare, la risposta alla migrazione indotta dal fattore
di crescita endoteliale e dal fattore di crescita 2 dei
fibroblasti (25). E’ interessante notare che miR-126
regola l’espressione della molecola di adesione 1 delle
cellule vascolari, che media l’adesione di cellule
endoteliali/leucociti nell’endotelio arterioso (26). E' stato
anche dimostrato che le cellule endoteliali apoptotiche
nelle lesioni aterosclerotiche rilasciano corpi apoptotici
arricchiti da miR-126; questo fa sì che altre cellule
endoteliali attraggano cellule progenitrici endoteliali nel
sito, ostacolando lo sviluppo della lesione (18). Si
suppone che miR-34a abbia nell’arteria aterosclerotica
un ruolo nell’apoptosi e nella senescenza delle cellule
endoteliali (27), mentre l’espressione di miR-210 è
indotta dall’ipossia nella placca e provoca un’aumentata
tubulogenesi delle cellule endoteliali insieme a una
possibile neovascolarizzazione (28). E’ stato dimostrato
che l’ipossia aumenta la progressione della lesione verso
l’aterosclerosi promuovendo l’accumulo di lipidi, la flogosi
e la deplezione di ATP; inoltre, la neovascolarizzazione
secondaria a ipossia è stata collegata a placche più
vulnerabili (Figura 2).
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
matrice extracellulare e metalloproteinasi. Nel
complesso, miR-24, -221, -31, -146a, -208 e -26a
risultano connessi al fenotipo delle VSMC con capacità di
sintesi, coinvolte essenzialmente nel ciclo cellulare e nel
“signaling” del fattore di crescita derivato dalle piastrine
(32-37). Invece, l’espressione di miR-1, -133, -10a, -21, 143, -145, -100, -204 e let-7d è stata associata alle
VSMC contrattili (Figura 2), coinvolte nell’inibizione della
proliferazione e della migrazione cellulare e nella
stimolazione della contrattilità (30, 38-45).
Leucociti: linfociti, cellule dendritiche e monociti
Si ritiene che i miRNA regolino anche i molteplici ruoli
dei leucociti nello sviluppo dell’aterosclerosi. Molti
miRNA risultano connessi al processo di differenziazione
VSMC
E’ stato dimostrato che i miRNA svolgono un ruolo nel
determinare il fenotipo e nel modulare la proliferazione
delle VSMC. L’espressione di miR-155 inibisce la
differenziazione delle VSMC, probabilmente diminuendo
l’espressione del recettore di tipo 1 dell’angiotensina II
(29), mentre miR-21 ne stimola la proliferazione
influenzando l’espressione della fosfatasi e dell’omologo
della tensina e di Bcl-2 (“B-cell CLL/lymphoma 2”) (30).
L’apoptosi delle VSMC provocata dalle specie reattive
dell’ossigeno (ROS) diminuisce come conseguenza
dell’espressione di miR-21 (31). E' stato dimostrato che
miRNA-21 partecipa alle regolazione genica indotta dalle
ROS e protegge dall’apoptosi ostacolando la traduzione
della morte cellulare programmata (31). Inoltre, miR-146a
promuove la proliferazione di VSMC in vitro e l'iperplasia
neointimale vascolare in vivo formando un ciclo di
“feedback” di espressione con il fattore 4 simil-Krüppel e
diminuendone l’espressione (32). Durante la formazione
di una placca aterosclerotica, alcune VSMC subiscono un
cambiamento fenotipico passando dal fenotipo contrattile
a quello secernente. Le VSMC secernenti producono
60
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
Figura 2
Espressione di miRNA nell’aterosclerosi.
La malattia cardiovascolare (CVD) altera il profilo di espressione
dei miRNA nel siero, nel plasma, nelle piastrine e nelle cellule
mononucleari del sangue periferico. Molti processi cellulari
correlati all’aterosclerosi provocano anche una deregolazione
dei miRNA. Si osservano cambiamenti specifici dei profili di
miRNA nella differenziazione dei linfociti T e dei monociti in
macrofagi e nella formazione di cellule schiumose.
L’aterosclerosi attiva le cellule endoteliali e spinge le cellule della
muscolatura liscia vascolare (VSMC) a un cambiamento
fenotipico, che altera anche l’espressione dei miRNA. Oltre
all’effetto sui processi cellulari, alcune ricerche mostrano che
l’aterosclerosi sovra-regola alcuni miRNA e ne sotto-regola altri
nelle arterie umane, come è indicato dalle frecce riportate dopo
ciascun miRNA.
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
dei linfociti T [miR-150 (46), -125b (47), -182 (48), -146a
(49), -29 (50), -326 (51)] e B [miR-150 (46), -185 (52)].
La produzione di citochine e chemochine dei linfociti T
svolge un ruolo importante nella progressione della
placca aterosclerotica. Svariate citochine sono il
bersaglio di miR-155 nei linfociti T CD4+ e i topi miR155−/− risultano essere immunodeficienti (53). Il miRNA155 è necessario anche per la sopravvivenza dei linfociti
T regolatori e per la risposta dei linfociti T-helper 17 (54).
I miRNA possono anche influenzare la funzione dei
linfociti T nell’aterosclerosi, regolando le cellule
presentanti l’antigene (ad es., le cellule dendritiche). In
particolare, miR-155 e -146a sembrano avere un ruolo
importante nell’attivazione e nella funzione delle cellule
dendritiche (55).
La differenziazione dei monociti in macrofagi dà
luogo a cambiamenti del profilo di espressione dei
miRNA (Figura 2). L’espressione di miRNA-17-5p, miR20a e miR-106a si riduce, consentendo l’up-regolazione
del loro bersaglio, il fattore di trascrizione 1 Runtcorrelato, il chè porta a una maggiore espressione del
recettore del fattore stimolante la formazione di colonie e
a una maggiore differenziazione dei monociti (56). Nel
processo di differenziazione aumenta l’espressione di
miR-21 e miR-146 (57, 58). E’ stato dimostrato che la
polarizzazione dei macrofagi altera il profilo dei miRNA.
Come dimostrato da Graff et al. (59), l’attivazione dei
macrofagi (verso il fenotipo M1 e/o M2) aumenta
l’espressione di miR-125a, -193b, -27a*, -155* e -29b-1*
e diminuisce l’espressione di miR-26a*. In questo studio
è interessante notare che l’espressione di miR-222*
aumentava nei macrofagi M2 e diminuiva nei macrofagi
M1 (59). Al contrario, Zhang et al. hanno osservato
un’up-regolazione significativa di miR-181a, -155-5p,
-204-5p e -451 e una significativa down-regolazione di
miR-125-5p, -146a, 143-3p e -145-5p, confrontando
macrofagi murini M1 e M2 (60). Quando i macrofagi
differenziati sono trattati con oxLDL per stimolare la
formazione di cellule schiumose, c’è un’up-regolazione
di miR-146a, -146b-5p, -155, -9 e -125a-5p (61). Tra
questi miRNA up-regolati, miR-155 funziona come
regolatore a “feedback” negativo, riducendo la risposta
infiammatoria e l’“uptake” lipidico attraverso i recettori
“scavenger” (62). Contrariamente a Chen et al. (62),
Yang et al. hanno rilevato che miR-146a è down-regolato
in modo significativo nei macrofagi stimolati con oxLDL
(63). Gli stessi autori hanno anche osservato che questo
miRNA svolge funzioni molto simili a quelle del miR-155
dopo la stimolazione, soprattutto diminuendo la
produzione di citochine e l’“uptake” dei lipidi (63). I dati
relativi al miR-155 nei macrofagi, nelle cellule schiumose
e anche nelle placche aterosclerotiche murine sono
contraddittori. Sono stati osservati sia effetti pro- che
anti-infiammatori (64, 65). Studi recenti indicano che il
livello di ossidazione delle LDL internalizzate dai
macrofagi può influenzare l’espressione di miR-155 (65)
e che nel topo il livello di dislipidemia può determinare se
questo miRNA agisce come anti- o pro-aterogeno (64).
miRNA circolanti
L’aterosclerosi può anche esercitare un effetto
sull’espressione di miRNA nel sangue periferico dei
pazienti. Sono stati ottenuti i profili di espressione dei
miRNA negli eritrociti, nelle piastrine, nel siero e nel
plasma ed è stato rilevato che i profili di miRNA dei
soggetti con e senza CVD sono diversi. Ad esempio,
Fichtlscherer et al. hanno dimostrato che miR-133 e
-208a sono up-regolati e che miR-126, -17, -92a, -155 e
-145 sono down-regolati nel siero e nel plasma di
soggetti con CAD (66). I dati relativi ai profili di miRNA
plasmatici e sierici vanno considerati con cautela in
quanto la coagulazione e la preparazione stessa del
campione possono influenzarli (67). Hoekstra et al.
hanno rilevato, nello stesso contesto, che miR-135a,
-134, -198 e -370 sono up-regolati e miR-147 è downregolato nelle cellule mononucleari del sangue periferico
(PBMC), cioè linfociti, monociti e macrofagi (68). Li et al.
hanno affermato di poter individuare soggetti con CAD
stabile, sindrome coronarica acuta e senza CAD
attraverso il profilo di miR-146a nelle PBMC (69). Inoltre,
i ricercatori della “Iwate Medical School” hanno
osservato l’up-regolazione di miR-146a e -146b e la
down-regolazione di let-7i nelle PBMC di soggetti con
CAD (70, 71). Sondermeijer et al. hanno riportato l’upregolazione di miR-340* e miR-624* nelle piastrine di
soggetti con CAD prematura, ipotizzando che i miRNA
piastrinici siano coinvolti nella fine regolazione
dell’espressione genica responsabile della reattività
delle piastrine e, pertanto, abbiano un effetto sulle CVD
aterotrombotiche correlate alle piastrine (72). Uno studio
di Vickers et al. (20) dimostra che i miRNA possono
essere trasportati anche dalle lipoproteine e che
l’iperlipidemia familiare può alterarne il profilo. Tali
risultati indicano che, oltre alle HDL, anche altre
lipoproteine, come le LDL, possono facilitare il trasporto
di miRNA, rendendo l’intero sistema lipoproteico parte
del sistema di “signaling” del miRNA, mediandone gli
effetti tra le varie cellule e tessuti attraverso il sangue
e/o i fluidi extracellulari.
miRNA nella placca aterosclerotica
Il profilo di espressione dei miRNA in situ non è stato
studiato in modo approfondito. E’ stato descritto il profilo
di espressione di miRNA delle lesioni neointimali
carotidee nei ratti. In questo studio, il confronto di una
lesione neointimale con un’arteria sana ha dimostrato
che il miRNA più up-regolato è il miR-21 (30). Inoltre, Li
et al. (73), studiando l’espressione di 13 miRNA
preselezionati,
hanno
osservato
un’aumentata
espressione di miR-21, -130a, -27b, -210 e let-7f nello
strato intimale delle placche arteriose di pazienti con
aterosclerosi. Questi ricercatori hanno dimostrato anche
la contemporanea up-regolazione di miR-130a, miR-27b
e miR-210 nel siero dei pazienti con aterosclerosi (73).
E’ stata anche dimostrata l’up-regolazione di miR-30e5p, -26b e -125a e la down-regolazione di miR-520b e
miR-105 in placche carotidee rispetto ad arterie
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
61
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
toraciche interne di sinistra (LITA) non aterosclerotiche
(74). Cipollone et al. hanno rilevato che, in un pool
preselezionato di 41 miRNA, miR-100, -127, -133a,
-133b e -145 risultavano significativamente up-regolati in
placche carotidee sintomatiche rispetto alle placche
asintomatiche (75).
Abbiamo precedentemente pubblicato i profili di
espressione di miRNA in placche aterosclerotiche
umane di arterie periferiche (carotide, femorale e aorta
addominale) rispetto alle LITA (4), osservando che miR21, -34a, -146a, -146b-5p e -210 erano i miRNA più upregolati nelle placche aterosclerotiche. Abbiamo anche
rilevato che i bersagli di questi miRNA risultavano downregolati nelle placche, collegando questi ultimi alla
morfologia, al fenotipo e alla proliferazione delle VSMC,
così come al metabolismo di HDL e LDL.
Oltre a usare il profilo miRNA delle placche
aterosclerotiche periferiche confrontandolo con le LITA
sane, abbiamo analizzato in modo organico i profili di
espressione dei miRNA (Tabella 1). Tale analisi illustra
che i miRNA, per i quali precedentemente erano stati
riportati diversi profili di espressione nelle frazioni
ematiche di pazienti affetti da CAD rispetto a soggetti
non affetti, presentano anche le stesse differenze di
espressione nelle placche aterosclerotiche in almeno un
letto vascolare rispetto alla parete arteriosa sana (miR126, -134, -145, -146a, -198, -210, -340* e -92a). Inoltre,
molti miRNA, che sulla base di studi su colture cellulari
risultano connessi all’aterosclerosi, sembrano avere lo
stesso “pattern” di espressione nella placca. Ad
esempio, i miRNA per i quali era stata dimostrata una
maggiore espressione nello sviluppo dei monociti in
macrofagi e cellule schiumose risultavano spesso upregolati anche nella placca (miR-146a, -146b-5p, -155, 21) e molti miRNA riscontrati nel fenotipo contrattile delle
VSMC risultavano down-regolati (miR-10a, -133, -145),
mentre quelli connessi al fenotipo secernente erano upregolati nella placca rispetto alle arterie sane (miR146a, -21, -221). La complessità della composizione e
del processo di formazione della placca aterosclerotica e
i molteplici ruoli dei miRNA nel tessuto possono
spiegare, almeno in parte, perché questo nesso non si
veda chiaramente per tutti i miRNA.
Le funzioni e i siti di espressione specifici di cellule e
tessuti di tutti i miRNA discussi in questa rassegna sono
riassunti e correlati alla loro espressione nelle placche
aterosclerotiche di diversi letti arteriosi nella Tabella 1
(4). Tali informazioni consentono una comprensione più
sistematica della funzione dei miRNA nelle lesioni
aterosclerotiche umane.
IMPLICAZIONI CLINICHE
La determinazione del profilo miRNA può contribuire
a chiarire i processi biologici implicati nell’aterosclerosi,
ma anche fungere da biomarcatore e bersaglio di
farmaci. I miRNA hanno varie qualità che li rendono
potenziali candidati al ruolo di biomarcatori molecolari:
sono stabili e ben conservati dal punto di vista
evoluzionistico e la loro espressione spesso cambia in
62
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
modo specifico per tessuto o malattia. Si ritrovano in
molti fluidi corporei come urina, plasma, siero e liquido
cerebrospinale; grazie all’impiego della “polymerase
chain reaction” quantitativa è possibile individuare i
miRNA con elevata sensibilità e specificità (76). Tuttavia,
la terminologia dell’espressione dei miRNA non è stata
ancora standardizzata e gli effetti della raccolta del
campione ematico e del tipo del campione stesso (siero
o plasma) sul profilo miRNA devono essere
accuratamente presi in considerazione e ottimizzati (67).
Anche altri fattori quali età, condizioni di salute e
cambiamenti dinamici del profilo miRNA circolante nei
vari soggetti non sono ancora stati sufficientemente
approfonditi.
Finora, la maggior parte degli studi condotti sui
miRNA come biomarcatori è in campo oncologico e
attualmente sono commercializzati vari biomarcatori a
scopo diagnostico. “Prometheus Laboratories” e
“Rosetta Genomics” hanno lanciato un test di laboratorio
finalizzato a individuare l’origine delle metastasi sulla
base del profilo di miRNA espressi. Asuragen ha messo
a punto metodi diagnostici per il carcinoma pancreatico
(77). Sono in corso alcuni studi per individuare i miRNA,
la cui espressione nel sangue rifletta lo stato attuale o la
futura progressione delle placche aterosclerotiche (20,
66, 68, 72). Finora, solo l’up-regolazione del miR-146a
nelle PBMC di soggetti con CAD rispetto a soggetti non
affetti è stata replicata in due studi indipendenti (69, 70).
Per quanto riguarda il ruolo dei miRNA come
bersaglio diretto di farmaci, è oggetto di studi di fase II il
primo farmaco basato su LNA (“locked-nucleic-acid”) per
la cura dell’epatite C (78). I miRNA correlati alla
disfunzione endoteliale precoce, come miR-10a (23) e
miR-126
(25),
potrebbero
diventare
“target”
farmacologici interessanti. Potrebbe essere possibile
stabilizzare una placca instabile influenzando
l’espressione dei miRNA associati al fenotipo più incline
alla rottura, come hanno dimostrato Lovren et al.
promuovendo il fenotipo contrattile delle VSMC con la
sovra-espressione di miR-145 (79).
Gli eventi cardiovascolari maggiori si prevengono
agendo sui fattori di rischio e le statine sono ampiamente
utilizzate per ridurre le concentrazioni plasmatiche di
LDL. E’ stato dimostrato che le statine riducono
l’espressione di miR-146a e -146b e aumentano
l’espressione di let-7i nelle PBMC dei soggetti con CAD
(70, 71). Più specificamente, è noto che l’atorvastatina
riduce il miR-221/222 (80) e il miR-34a (81) nelle cellule
progenitrici endoteliali circolanti, mentre pravastatina o
rosuvastatina non hanno tale effetto. Gli effetti divergenti
delle varie statine sull’espressione di miRNA potrebbero
essere correlati ai loro eventuali effetti pleiotropici. Un
trattamento che inibisca direttamente l’espressione di
miR-33a/b è stato dimostrato aumentare le HDL
plasmatiche e ridurre i trigligeridi VLDL nei cercopitechi
verdi (82). Profili alterati di miRNA sembrano essere
associati ad altri fattori di rischio cardiovascolare come
ipertensione, diabete e fumo, ma sono necessarie
ulteriori ricerche per chiarire il potenziale clinico di questi
profili.
↑(68)
↑(68)
↓(46)
Linfociti
Ba
↑(47)
Linfociti
Tb
Monocitic
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
miR-17-5p
miR-17–92
miR-17
miR-155*
miR-155
miR-150
miR-147
miR-146b-5p
miR-146a
miR-146
miR-145
miR-143
miR-135a
miR-134
↓(66)
↓(66)
↓(66)
↑(66)
miR-133a
miR-133b
miR-133
↑(73)
miR-130a
miR-127
miR-126
miR-125b
miR-10a
↓(66)
↓(66)
↓(66)
↑(66)
↓(68)
↑(69,70)
↑(84)
↑(84)
↑(54)
↓(46)
↑(49)
↑(61)
↑(61)
Macrofagid
↓(83)
↑(59)M1,2
↑(60)M1/M2
↑(61,65)
↓(64)
↓(60)M1/M2 ↑(61)
↑(58)
↓(60)M1/M2
↓(60)M1/M2
↓(60)M1/M2
miR-125a-5p
↓(66)
↓(70)
PBMCa
↑(59)M1
Piastrinea
↓(83)
↓(66)
Plasmaa
miR-106a
miR-105
miR-100
miR-1
let-7i
let-7f
let-7d
miRNA
Sieroa
Precedentemente studiati
Tabella 1
MicroRNA (miRNA) associati a malattia cardiovascolare (CVD)
↓(24)
↓(25, 26)
Cellule
endoteliali
↓(29)
↑(32)
↓(42,79)
↓(42)
↓(39)
↓(40)
↓(43)
↓(38)
↓(45)
VSMCf
↑(75)
↑(75)
↑(75)
↑(75)
↑(73)
↑(74)
↓(23)
↓(74)
↑(75)
↑(73)
↑
↑
↓
↓
↑
↑
↑
↑
↓
↓
↓
Placche atero- Placche Placche
sclerotiche
carotidee aortiche
Sì
↑
↑
↑
↑
↓
Sì
↑
Sì
ND
Sì
No
Sì
Sì
No
Sì
Sì
ND
Sì
Sì
No
Sì
Sì
ND
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
ND
Sì
No
Sì
Sì
No
Sì
Sì
ND
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
ND
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
Sì
No
No
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Nelle arterie Nella
sanef
placcaf
↓
↓
↑
Placche
femorali
Nel “Tampere Vascular Study” [Raitoharju et al. (4)]
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
63
64
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
↑(68)
↓(50)
↑(48)
Linfociti
Tb
↓M1,↑M2(59)
↑(57)
↓(83)
↑(60)M1/M2
↑(59)M2
↑(60)M1/M2
↓(83)
↓(66)
↑(72)
↑(51)
↑(60)M1/M2
↑(59)M1,2
↑(61)
Macrofagid
↑(27)
↑(28)
↓(22)
Cellule
endoteliali
↑(35)
↑(37)
↑(33)
↑(34)
↑(30,31)
↓(41)
↑(36)
↓(44)
VSMCf
↓(74)
↑(74)
↑ (73)
↑(74)
↑(73)
↑(73)
↓
↓
↑
↑
↑
↓
↓
↑
↑
↑
↑
Placcheatero- Placche Placche
sclerotiche
carotidee aortiche
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
Placche
femorali
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Si
Si
Sì
Sì
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Si
Si
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Sì
No
ND
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
No
Sì
No
Sì
Sì
No
Sì
Sì
Sì
Sì
No
ND
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Sì
Nelle arterie Nella
sanef
placcaf
Sì
Sì
Nel “Tampere Vascular Study” [Raitoharju et al. (4)]
individui con CVD vs. individui senza; bIn leucociti differenziati vs. non differenziati; cIn macrofagi vs. monociti; dIn cellule schiumose vs. macrofagi; eIn VSMC con fenotipo sintetico vs.
contrattile; fmiRNA positivamente espresso se presente in almeno metà dei campioni analizzati.
PBMC, cellule mononucleari del sangue periferico; VSMC, cellule della muscolatura liscia vascolare; ND, non disponibile.
aIn
miR-92a
miR-9
miR-624*
miR-520b
miR-451
miR-370
miR-34a
miR-340*
miR-326
miR-31
miR-30e-5p
miR-29
miR-27b
miR-26b
↑(59)M2
↑(72)
↑(68)
↓(52)
Linfociti
Ba
Monocitic
miR-27a*
↓(66)
↑(66)
a
Piastrine
PBMCa
↑(59)M1,2
↑(73)
↑(66)
Plasmaa
miR-26a*
mir-26a
miR-24
miR-222*
miR-221
miR-210
miR-21
miR-20a
miR-208a
miR-208
miR-204
miR-198
miR-193b
miR-185
miR-182
miR-181a
miRNA
miR-17-5p
Sieroa
Precedentemente studiati
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE
E’ dimostrato che i processi correlati all’aterosclerosi
influenzano l’espressione dei miRNA nelle colture
cellulari e nei modelli animali. Di recente, l’interesse dei
ricercatori si è concentrato sul ruolo dei miRNA come
biomarcatori per CVD. Gli studi sull’espressione dei
miRNA nell’aterosclerosi umana sono ancora in numero
limitato e la funzione dei miRNA nelle arterie
aterosclerotiche umane è ancora ignota. Questa
rassegna degli studi sull’espressione dei miRNA nelle
varie frazioni e cellule ematiche strettamente correlate
all’aterosclerosi è il tentativo di capire come tali miRNA,
che si ritiene abbiano un ruolo nell’aterosclerosi umana,
siano espressi nelle lesioni aterosclerotiche avanzate
rispetto alle arterie sane. Molti miRNA per i quali è stata
dimostrata l’alterazione del profilo di espressione nelle
frazioni ematiche di soggetti con CVD risultano anche
deregolati nella parete arteriosa aterosclerotica. Questo
suggerisce che l’espressione di questi marcatori possa
riflettere i cambiamenti che si verificano realmente nella
parete arteriosa. Abbiamo anche rilevato che molti
miRNA connessi all’aterosclerosi in studi su colture
cellulari sono espressi anche nella placca come predetto
in fase sperimentale. Ad esempio, mir-126, -145, -146a
e -210 sono espressi allo stesso modo in molti tessuti e
tipi cellulari correlati all’aterosclerosi, confermando il
nesso con la CVD. Poiché il ruolo dei miRNA
nell’aterosclerosi è un campo di ricerca relativamente
nuovo, restano ancora da chiarire tutte le potenzialità
cliniche di questi piccoli RNA nella diagnosi e nel
trattamento della CVD.
CONFLITTO DI INTERESSI
Finanziamenti ricevuti: Unione Europea, 7o
Programma Quadro, Finanziamento per il progetto
AtheroRemo, GA n°201668; E. Raitoharju, Foundation of
Clinical Chemistry, Finnish Cultural Foundation, Aarne
Koskelo Foundation, Tampere City Science Foundation,
Alfred Kordelin Foundation; N. Oksala, Emil Aaltonen
Foundation; T. Lehtimäki, Finnish Foundation of
Cardiovascular Research, Tampere Tuberculosis
Foundation, Tampere University Hospital Medical Fund
grants 9M048 e 9N035, Emil Aaltonen Foundation.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
Nemetz PN, Roger VL, Ransom JE, et al. Recent trends in
the prevalence of coronary disease: a population-based
autopsy study of nonnatural deaths. Arch Intern Med
2008;168:264–70.
Di Angelantonio E, Gao P, Pennells L, et al. Lipid-related
markers and cardiovascular disease prediction. JAMA
2012;307:2499–506.
Zhao Y, Samal E, Srivastava D. Serum response factor
regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2
during cardiogenesis. Nature 2005;436:214–20.
Raitoharju E, Lyytikainen LP, Levula M, et al. miR-21, miR210, miR-34a, and miR-146a/b are up-regulated in human
atherosclerotic plaques in the Tampere Vascular Study.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
Atherosclerosis 2011;219:211–7.
Hansson GK, Hermansson A. The immune system in
atherosclerosis. Nat Immunol 2011;12:204–12.
Chatzizisis YS, Coskun AU, Jonas M, et al. Role of
endothelial shear stress in the natural history of coronary
atherosclerosis and vascular remodeling: molecular,
cellular, and vascular behavior. J Am Coll Cardiol
2007;49:2379–93.
Perrotta I. Ultrastructural features of human
atherosclerosis. Ultrastruct Pathol 2013;37:43–51.
Kim VN, Nam JW. Genomics of microRNA. Trends Genet
2006;22:165–73.
Ozsolak F, Poling LL, Wang Z, et al. Chromatin structure
analyses identify miRNA promoters. Genes Dev
2008;22:3172–83.
Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA
biogenesis
and
function.
Thromb
Haemost
2012;107:605–10.
Ruby JG, Jan CH, Bartel DP. Intronic microRNA precursors
that bypass Drosha processing. Nature 2007;448:83–6.
Noland CL, Ma E, Doudna JA. siRNA repositioning for
guide strand selection by human Dicer complexes. Mol Cell
2011;43:110–21.
Moretti F, Thermann R, Hentze MW. Mechanism of
translational regulation by miR-2 from sites in the 5′
untranslated region or the open reading frame. RNA
2010;16:2493–502.
Ørom UA, Nielsen FC, Lund AH. MicroRNA-10a binds the
5′UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their
translation. Mol Cell 2008;30:460–71.
Hwang HW, Wentzel EA, Mendell JT. A hexanucleotide
element directs microRNA nuclear import. Science
2007;315:97–100.
Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, et al. Argonaute2
complexes carry a population of circulating microRNAs
independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad
Sci USA 2011;108:5003–8.
Wang K, Zhang S, Weber J, et al. Export of microRNAs and
microRNA-protective protein by mammalian cells. Nucleic
Acids Res 2010;38:7248–59.
Zernecke A, Bidzhekov K, Noels H, et al. Delivery of
microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12dependent vascular protection. Sci Signal 2009;2:ra81.
Hergenreider E, Heydt S, Treguer K, et al. Atheroprotective
communication between endothelial cells and smooth
muscle cells through miRNAs. Nat Cell Biol
2012;14:249–56.
Vickers KC, Palmisano BT, Shoucri BM, et al. MicroRNAs
are transported in plasma and delivered to recipient cells by
high-density lipoproteins. Nat Cell Biol 2011;13:423–33.
Boettger T, Braun T. A new level of complexity: the role of
microRNAs in cardiovascular development. Circ Res
2012;110:1000–13.
Weber M, Baker MB, Moore JP, et al. MiR-21 is induced in
endothelial cells by shear stress and modulates apoptosis
and eNOS activity. Biochem Biophys Res Commun
2010;393:643–8.
Fang Y, Shi C, Manduchi E, et al. MicroRNA-10a regulation
of proinflammatory phenotype in athero-susceptible
endothelium in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci USA
2010;107:13450–5.
Zhu N, Zhang D, Chen S, et al. Endothelial enriched
microRNAs regulate angiotensin II-induced endothelial
inflammation
and
migration.
Atherosclerosis
2011;215:286–93.
Fish JE, Santoro MM, Morton SU, et al. miR-126 regulates
angiogenic signaling and vascular integrity. Dev Cell
2008;15:272–84.
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
65
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
66
Harris TA, Yamakuchi M, Ferlito M, et al. MicroRNA-126
regulates endothelial expression of vascular cell adhesion
molecule 1. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:1516–21.
Ito T, Yagi S, Yamakuchi M. MicroRNA-34a regulation of
endothelial senescence. Biochem Biophys Res Commun
2010;398:735–40.
Ivan M, Harris AL, Martelli F, et al. Hypoxia response and
microRNAs: no longer two separate worlds. J Cell Mol Med
2008;12:1426–31.
Zheng L, Xu CC, Chen WD, et al. MicroRNA-155 regulates
angiotensin II type 1 receptor expression and phenotypic
differentiation in vascular adventitial fibroblasts. Biochem
Biophys Res Commun 2010;400:483–8.
Ji R, Cheng Y, Yue J, et al. MicroRNA expression signature
and antisense-mediated depletion reveal an essential role
of microRNA in vascular neointimal lesion formation. Circ
Res 2007;100:1579–88.
Lin Y, Liu X, Cheng Y, et al. Involvement of microRNAs in
hydrogen peroxide-mediated gene regulation and cellular
injury response in vascular smooth muscle cells. J Biol
Chem 2009;284:7903–13.
Sun SG, Zheng B, Han M, et al. miR-146a and Krüppel-like
factor 4 form a feedback loop to participate in vascular
smooth muscle cell proliferation. EMBO Rep
2011;12:56–62.
Chan MC, Hilyard AC, Wu C, et al. Molecular basis for
antagonism between PDGF and the TGFbeta family of
signalling pathways by control of miR-24 expression.
EMBO J 2010;29:559–73.
Davis BN, Hilyard AC, Nguyen PH, et al. Induction of
microRNA-221 by platelet-derived growth factor signaling is
critical for modulation of vascular smooth muscle
phenotype. J Biol Chem 2009;284:3728–38.
Liu X, Cheng Y, Chen X, et al. MicroRNA-31 regulated by
the extracellular regulated kinase is involved in vascular
smooth muscle cell growth via large tumor suppressor
homolog 2. J Biol Chem 2011;286:42371–80.
Zhang Y, Wang Y, Wang X, et al. Insulin promotes vascular
smooth muscle cell proliferation via microRNA-208mediated downregulation of p21. J Hypertens
2011;29:1560–8.
Leeper NJ, Raiesdana A, Kojima Y, et al. MicroRNA-26a is
a novel regulator of vascular smooth muscle cell function. J
Cell Physiol 2011;226:1035–43.
Chen J, Yin H, Jiang Y, et al. Induction of microRNA-1 by
myocardin in smooth muscle cells inhibits cell proliferation.
Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011;31:368–75.
Torella D, Iaconetti C, Catalucci D, et al. MicroRNA-133
controls vascular smooth muscle cell phenotypic switch in
vitro and vascular remodeling in vivo. Circ Res
2011;109:880–93.
Huang H, Xie C, Sun X, et al. miR-10a contributes to
retinoid acid-induced smooth muscle cell differentiation. J
Biol Chem 2010;285:9383–9.
Kang H, Davis-Dusenbery BN, Nguyen PH, et al. Bone
morphogenetic protein 4 promotes vascular smooth muscle
contractility by activating microRNA-21 (miR-21), which
down-regulates expression of family of dedicator of
cytokinesis
(DOCK)
proteins.
J
Biol
Chem
2012;287:3976–86.
Cordes KR, Sheehy NT, White MP, et al. miR-145 and miR143 regulate smooth muscle cell fate and plasticity. Nature
2009;460:705–10.
Grundmann S, Hans FP, Kinniry S, et al. MicroRNA-100
regulates neovascularization by suppression of mammalian
target of rapamycin in endothelial and vascular smooth
muscle cells. Circulation 2011;123:999–1009.
Courboulin A, Paulin R, Giguere NJ, et al. Role for miR-204
in human pulmonary arterial hypertension. J Exp Med
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
2011;208:535–48.
Yu ML, Wang JF, Wang GK, et al. Vascular smooth muscle
cell proliferation is influenced by let-7d microRNA and its
interaction with KRAS. Circ J 2011;75:703–9.
Xiao C, Calado DP, Galler G, et al. MiR-150 controls B cell
differentiation by targeting the transcription factor c-Myb.
Cell 2007;131:146–59.
Rossi RL, Rossetti G, Wenandy L, et al. Distinct microRNA
signatures in human lymphocyte subsets and enforcement
of the naive state in CD4+ T cells by the microRNA miR125b. Nat Immunol 2011;12:796–803.
Stittrich AB, Haftmann C, Sgouroudis E, et al. The
microRNA miR-182 is induced by IL-2 and promotes clonal
expansion of activated helper T lymphocytes. Nat Immunol
2010;11:1057–62.
Curtale G, Citarella F, Carissimi C, et al. An emerging player
in the adaptive immune response: microRNA-146a is a
modulator of IL-2 expression and activation-induced cell
death in T lymphocytes. Blood 2010;115:265–73.
Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, et al. MicroRNA-29
regulates T-box transcription factors and interferon-γ
production in helper T cells. Immunity 2011;35:169–81.
Du C, Liu C, Kang J, et al. MicroRNA miR-326 regulates
TH-17 differentiation and is associated with the
pathogenesis of multiple sclerosis. Nat Immunol
2009;10:1252–9.
Belver L, de Yebenes VG, Ramiro AR. MicroRNAs prevent
the generation of autoreactive antibodies. Immunity
2010;33:713–22.
Rodriguez A, Vigorito E, Clare S, et al. Requirement of
bic/microRNA-155 for normal immune function. Science
2007;316:608–11.
Zernecke A. MicroRNAs in the regulation of immune cell
functions–implications for atherosclerotic vascular disease.
Thromb Haemost 2012;107:626–33.
Busch M, Zernecke A. microRNAs in the regulation of
dendritic cell functions in inflammation and atherosclerosis.
J Mol Med 2012;90:877–85.
Fontana L, Pelosi E, Greco P, et al. MicroRNAs 17-5p-20a106a control monocytopoiesis through AML1 targeting and
M-CSF receptor upregulation. Nat Cell Biol 2007;9:775–87.
Kasashima K, Nakamura Y, Kozu T. Altered expression
profiles of microRNAs during TPA-induced differentiation of
HL-60 cells. Biochem Biophys Res Commun
2004;322:403–10.
Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, et al. NF-kappaBdependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor
targeted to signaling proteins of innate immune responses.
Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:12481–6.
Graff JW, Dickson AM, Clay G, et al. Identifying functional
microRNAs in macrophages with polarized phenotypes. J
Biol Chem 2012;287:21816–25.
Zhang Y, Zhang M, Zhong M, et al. Expression profiles of
miRNAs in polarized macrophages. Int J Mol Med
2013;31:797–802.
Chen T, Huang Z, Wang L, et al. MicroRNA-125a-5p partly
regulates the inflammatory response, lipid uptake, and
ORP9 expression in oxLDL-stimulated monocyte/
macrophages. Cardiovasc Res 2009;83:131–9.
Huang RS, Hu GQ, Lin B, et al. MicroRNA-155 silencing
enhances inflammatory response and lipid uptake in
oxidized low-density lipoprotein-stimulated human THP-1
macrophages. J Investig Med 2010;58:961–7.
Yang K, He YS, Wang XQ, et al. MiR-146a inhibits oxidized
low-density lipoprotein-induced lipid accumulation and
inflammatory response via targeting toll-like receptor 4.
FEBS Lett 2011;585:854–60.
Donners MM, Wolfs IM, Stoger LJ, et al. Hematopoietic
miR155 deficiency enhances atherosclerosis and
IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY
CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
decreases plaque stability in hyperlipidemic mice. PLoS
One 2012;7:e35877.
Nazari-Jahantigh M, Wei Y, Noels H, et al. MicroRNA-155
promotes atherosclerosis by repressing Bcl6 in
macrophages. J Clin Invest 2012;122:4190–202.
Fichtlscherer S, De Rosa S, Fox H, et al. Circulating
microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ
Res 2010;107:677–84.
Wang K, Yuan Y, Cho JH, et al. Comparing the MicroRNA
spectrum between serum and plasma. PLoS One
2012;7:e41561.
Hoekstra M, van der Lans CA, Halvorsen B, et al. The
peripheral blood mononuclear cell microRNA signature of
coronary artery disease. Biochem Biophys Res Commun
2010;394:792–7.
Li L, Chen XP, Li YJ. MicroRNA-146a and human disease.
Scand J Immunol 2010;71:227–31.
Takahashi Y, Satoh M, Minami Y, et al. Expression of miR146a/b is associated with the Toll-like receptor 4 signal in
coronary artery disease: effect of renin-angiotensin system
blockade and statins on miRNA-146a/b and Toll-like
receptor 4 levels. Clin Sci 2010;119:395–405.
Satoh M, Tabuchi T, Minami Y, et al. Expression of let-7i is
associated with Toll-like receptor 4 signal in coronary artery
disease: effect of statins on let-7i and Toll-like receptor 4
signal. Immunobiology 2012;217:533–9.
Sondermeijer BM, Bakker A, Halliani A, et al. Platelets in
patients with premature coronary artery disease exhibit
upregulation of miRNA340* and miRNA624*. PLoS One
2011;6:e25946.
Li T, Cao H, Zhuang J, et al. Identification of miR-130a, miR27b and miR-210 as serum biomarkers for atherosclerosis
obliterans. Clin Chim Acta 2010;412:66–70.
Bidzhekov K, Gan L, Denecke B, et al. microRNA
expression signatures and parallels between monocyte
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
subsets and atherosclerotic plaque in humans. Thromb
Haemost 2012;107:619–25.
Cipollone F, Felicioni L, Sarzani R, et al. A unique microRNA
signature associated with plaque instability in humans.
Stroke 2011;42:2556–63.
Creemers EE, Tijsen AJ, Pinto YM. Circulating microRNAs:
novel biomarkers and extracellular communicators in
cardiovascular disease? Circ Res 2012;110:483–95.
Ajit SK. Circulating microRNAs as biomarkers, therapeutic
targets,
and
signaling
molecules.
Sensors
2012;12:3359–69.
Lindow M, Kauppinen S. Discovering the first microRNAtargeted drug. J Cell Biol 2012;199:407–12.
Lovren F, Pan Y, Quan A, et al. MicroRNA-145 targeted
therapy
reduces
atherosclerosis.
Circulation
2012;126:S81–90.
Minami Y, Satoh M, Maesawa C, et al. Effect of atorvastatin
on microRNA 221/222 expression in endothelial progenitor
cells obtained from patients with coronary artery disease.
Eur J Clin Invest 2009;39:359–67.
Tabuchi T, Satoh M, Itoh T, et al. MicroRNA-34a regulates
the longevity-associated protein SIRT1 in coronary artery
disease: effect of statins on SIRT1 and microRNA-34a
expression. Clin Sci 2012;123:161–71.
Rayner KJ, Esau CC, Hussain FN, et al. Inhibition of miR33a/b in non-human primates raises plasma HDL and
lowers VLDL triglycerides. Nature 2011;478:404–7.
Weber C, Schober A, Zernecke A. MicroRNAs in arterial
remodelling, inflammation and atherosclerosis. Curr Drug
Targets 2010;11:950–6.
Xiao C, Srinivasan L, Calado DP, et al. Lymphoproliferative
disease and autoimmunity in mice with increased miR-1792 expression in lymphocytes. Nat Immunol
2008;9:405–14.
biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 1
67