TUTOR
Prof. Luigi Ricciardiello
TITOLO DEL PROGETTO Studio di microRNAs associati a mutazioni del gene
APC: caratterizzazione in pazienti con poliposi adenomatosa familiare, meccanismi
di azione in colture di organoidi e risposta all’azione di bioattivi della dieta
mediterranea.
DESCRIZIONE DEL PROGETTO
Stato dell’Arte e Razionale
La poliposi adenomatosa familiare (FAP) è una malattia autosomica dominante caratterizzata dall'
insorgenza di 100-1000 polipi adenomatosi nel colon che progrediscono verso la formazione di
carcinomi colon-rettali (CRC)[1]. Il gene APC è mutato a livello germinale ('primo hit') nei pazienti
con FAP e a livello somatico nell’80% dei CRC sporadici. Nei pazienti FAP, una seconda
alterazione genetica ('secondo hit') di APC è necessaria affinchè la mucosa normale del colon
evolva in adenoma ed eventualmente progredisca verso il CRC. I microRNA (miRNA) sono una
classe di piccoli RNA non codificanti coinvolti anche nel CRC [2]. Tuttavia, il ruolo dei miRNA
nello sviluppo della FAP è ancora scarsamente caratterizzato. Il mio gruppo di ricerca sta
attualmente studiando il ruolo funzionale di specifici miRNA legati al gene APC su linee di CRC.
Recentemente e’ stato pubblicato un nuovo metodo che permette l’isolamento ed il mantenimento
in coltura di cripte intestinali in grado di generare organoidi intestinali che conservano importanti
funzioni fisiologiche del normale epitelio intestinale [3]. Tali modelli, rappresentano un sistema
innovativo per lo studio dei meccanismi regolatori e patologici dell’epitelio intestinale. Inoltre, gli
organoidi costituiscono uno strumento ideale per testare gli effetti chemio-preventivi di sostanze
naturali. Di recente è stato dimostrato che la dieta mediterranea è in grado di prevenire il cancro
colorettale [4]. Abbiamo dimostrato che l’acido eicosapentaenoico ed estratti polifenolici della
mela annurca prevengono lo sviluppo di tumori del colon nel modello Apc Min/+ di poliposi
adenomatosa familiare [5, 6]. I risultati ottenuti da questo nuovo studio forniranno la base per
valutare se l’attività chemiopreventiva di una miscela di bioattivi presenti nella dieta mediterranea
in presenza di mutazioni nel gene APC sia legata ad una modulazione di specifici miRNA.
Bibliografia
1.
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Hum Mol Genet 2001; 10 (7): 721-33.
Cancer Genomics Proteomics. 2009;6:195–204.
Stem Cells 2014; 31(3): 417–422.
Int J Cancer. 2013 Mar 15;132(6):1404-11.
Clin Cancer Res. 2010 Dec 1;16(23):5703-11.
Cancer Prev Res (Phila). 2011 Jun;4(6):907-15.
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
Obiettivi
Lo studio core, condotto su 20 pazienti affetti da FAP, ha come obiettivo quello di identificare
miRNA che contribuiscano alla transizione da mucosa normale ad adenomi. Contestualmente, da 5
pazienti verranno prelevati campioni per ricreare modelli tridimensionali (organoidi) del colon exvivo che verranno utilizzati per valutare la funzione di miRNA potenzialmente coinvolti
nell'eziopatogenesi della FAP, nonché dei CRC sporadici, e per testare l’effetto chemiopreventivo
di bioattivi presenti nella dieta mediterranea in relazione a specifici miRNA.
Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…)
Campioni tissutali di mucosa del colon normale e di adenomi verranno raccolti da 20 pazienti FAP.
Per lo studio core da ogni paziente verranno effettuati 2 campionamenti dalla mucosa normale e 2
da adenomi (< 5mm). Per la fase esplorativa iniziale, l'RNA estratto verrà ibridato su specifica
piattaforma microarray al fine di valutare in maniera simultanea l’espressione di miRNA nella
mucosa normale e negli adenomi. Successivamente, sulla base dei risultati del microarray,
l’espressione dei miRNA selezionati verrà validata mediante q-RT-PCR. Inoltre, verranno
effettuati 7 campionamenti dalla mucosa normale e 7 da adenomi (< 5mm), per isolare singole
cripte che saranno coltivate per generare organoidi tridimensionali, sui quali verranno testati gli
effetti funzionali dei miRNA precedentemente selezionati. A tale scopo, gli organoidi verranno
trasfettati mediante infezione retrovirale con specifici vettori. Verrà inoltre analizzato l’effetto di
tali miRNA su specifici pathways a livello trascrizionale, mediante real time PCR, o a livello
traduzionale, mediante western blot. Mediante analisi immunoistochimica verrà valutato l'effetto
dei miRNA sulla proliferazione cellulare, l'apoptosi e sul differenziamento delle cellule staminali
del colon. Vista la natura esplorativa dello studio si ritiene sufficiente un arruolamento di 20
pazienti. Verranno applicati il Test t di Student per valutare le differenze medie tra due gruppi ed il
test ANOVA per confronti multipli per le variabili continue. Il Chi quadro ed il Fisher exact test
saranno applicati per analizzare le variabili categoriche. L’analisi statistica sarà effettuata mediante
software GraphPad Prism o SPSS. I campioni previsti dal progetto saranno raccolti presso l'Unità
Operativa (UO) di Gastroenterologia (Prof. Bazzoli) del Policlinico S.Orsola-Malpighi e le
successive fasi sperimentali saranno condotte presso il Centro Unificato di Ricerca Biomedica
Applicata (CRBA). Il progetto è svolto in collaborazione con l’UO di Genetica Medica (Prof. Seri).
Il CRBA dispone di tutta la strumentazione necessaria per svolgere questo progetto.
Risultati attesi
Dato che la perdita di funzione del gene APC è generalmente associata alla formazione di adenomi,
miRNA overespressi o downregolati nel colon di pazienti FAP potrebbero intervenire nei
meccanismi patogenetici della FAP e anche dei CRC sporadici. Inoltre, l’innovativo studio
funzionale tramite organoidi consentirà di predire gli effetti in vivo dei miRNA, consentendo una
più realistica traslazionalità verso il paziente con FAP anche in relazione all’effetto
chemiopreventivo della miscela di bioattivi. Questi risultati potranno quindi essere estesi alla
popolazione generale.
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DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA
Il candidato dovrà essere in possesso di dottorato in Biologia Cellulare e Molecolare e di Laurea
Magistrale in Biologia Molecolare e Cellulare (classe LM-6 Biologia). Formazione specifica ed
esperienza nell'isolamento ed il mantenimento in coltura di organoidi rappresentano un prerequisito
imprescindibile. Il candidato dovrà avere esperienza in metodiche di biologia molecolare e
cellulare, nonché essere in possesso delle competenze necessarie a soddisfare gli obiettivi dello
studio. Il candidato vincitore dovrà effettuare:
1) L’estrazione di RNA e proteine dai tessuti
2) La valutazione dell’espressione di miRNA nei tessuti prelevati dai pazienti con FAP
mediante microarray e qRT-PCR
3) L’isolamento di cripte intestinali da biopsie di pazienti FAP ed il mantenimento in
coltura per generare organoidi tridimensionali
4) Condurre studi funzionali ex-vivo su organoids per caratterizzare il comportamento
dei miRNA di interesse e per testare gli l'effetti chemio-preventivi di bioattivi
contenuti nella dieta mediterranea.
Durante il primo semestre dell'assegno il candidato vincitore si occuperà del reclutamento dei
pazienti che aderiranno allo studio ed al sottostudio in oggetto, dell'estrazione dell'RNA dalle
biopsie di tali pazienti e dell'analisi di espressione genica differenziale al fine di individuare
miRNA espressi in modo aberrante negli adenomi di pazienti con FAP. Nel secondo semestre di
attività l'assegnista si occuperà dell'isolamento e del mantenimento in coltura di cripte intestinali
dalle biopsie di un sottogruppo di pazienti per generare organoidi sui quali verranno condotti studi
funzionali ex-vivo volti a caratterizzare il ruolo di miRNA di interesse, nonché testare i potenziali
effetti chemiopreventivi di bioattivi contenuti nella dieta mediterranea. Lo studio ha come obiettivo
principale quello di identificare miRNA che contribuiscano alla transizione da mucosa normale ad
adenomi in pazienti con FAP e di ricreare modelli tridimensionali (organoidi) del colon ex-vivo
dagli stessi pazienti che verranno utilizzati per valutare la funzione di miRNA potenzialmente
coinvolti nell'eziopatogenesi della FAP e dei CRC sporadici. Gli obiettivi primari dello studio
serviranno a fornire le conoscenze per valutare se bioattivi contenuti nella dieta mediterranea
possano esercitare un effetto preventivo sulla formazione degli adenomi regolando il profilo di
espressione di miRNA specifici.
Scheda attività assistenziale (se prevista)
PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA
ATTIVITÀ
N. ORE SETTIMANA
Non è prevista attività assistenziale
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