CONTRIBUTI SCIENTIFICI
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Miglioramento dell’accuratezza della determinazione della creatinina mediante
l’impiego di metodica enzimatica*
Ilenia Infusino1, Paola Luraschi2, Cristina Valente2, Mauro Panteghini1,2
1Centro Interdipartimentale per la Riferibilità Metrologica in Medicina di Laboratorio (CIRME), Università degli Studi di Milano,
2Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Azienda Ospedaliera ‘Luigi Sacco’, Milano
ABSTRACT
Accuracy improvement of creatinine measurement by the use of an enzymatic assay. The estimation of glomerular filtration rate (GFR) is considered the best index of kidney function. Laboratories may routinely report a GFR
estimate from serum creatinine concentrations by applying the “four variables” Modification of Diet in Renal Disease
study (MDRD) equation. The general implementation of this equation is, however, impaired by the use of different
creatinine assays. In this study, we evaluate the impact of the introduction of an enzymatic assay (E) on trueness and
imprecision of creatinine measurements in comparison with a kinetic alkaline picrate “compensated” method (AP).
Trueness was evaluated by measuring creatinine concentrations of three commutable materials with target value
assigned with gas chromatography-isotope dilution mass spectrometry, while the imprecision was estimated using a
liquid-frozen control material during a eight-month working period for a total of approximately 300 measurements. For
creatinine measurements we used four platforms (all from Roche Diagnostics), the Integra 800 and Modular P (for
trueness evaluation), and the Hitachi 917 and Modular P (for imprecision study). The trueness of creatinine measurements was significantly better using E, mainly at physiological concentrations where the AP was unable to fulfil the
desirable bias (+3.4%). The imprecision of creatinine measurements also decreased when E replaced AP. While only
one out 16 monthly CVs by E was higher than the desirable goal (<2.2%), six monthly CVs by AP (37.5%) surpassed this limit. We conclude that, for suitable clinical usefulness of creatinine measurement, laboratories should consider to definitively replace AP with E.
*Questo lavoro rappresenta il contributo scientifico che la Dr.ssa I. Infusino ha presentato in occasione del ricevimento del premio
intitolato alla memoria del Dr. Piero Bonvicini, istituito da MZ Congressi con gli auspici della SIBioC.
INTRODUZIONE
La stima della velocità di filtrazione glomerulare
(GFR) è considerata il miglior indice di funzionalità renale (1). Essa può essere ottenuta mediante l’impiego di
varie equazioni, che utilizzano la concentrazione della
creatinina nel siero in aggiunta ad altre informazioni,
quali età, sesso, razza, altezza, peso, ecc. (2). Essendo
alcune di queste (altezza e peso) difficili da ottenere da
parte dei laboratori clinici, è stato raccomandato l’uso
della formula a “quattro variabili” derivata dallo studio
“Modification of Diet in Renal Disease” (MDRD), che,
richiedendo solo età, sesso ed, eventualmente, la razza,
in aggiunta alla concentrazione della creatininemia, può
essere agevolmente implementata nei sistemi informatici di laboratorio (3,4).
L’utilizzo da parte dei laboratori di differenti metodi di
misura della creatinina e la mancanza di standardizzazione dei risultati possono però fortemente condizionare
la corretta stima della GFR mediante la suddetta formula (5). Infatti, per valori di creatininemia compresi tra 0,95
mg/dL e 1,50 mg/dL, che portano, a seconda del sesso
e dell’età ad una GFR stimata di ~60 mL/min/1,73 m2,
valore corrispondente al livello decisionale consigliato, la
maggior parte dei metodi attualmente in uso può presentare rilevanti problemi di esattezza e, spesso, anche di
imprecisione (6,7). Dati recentemente pubblicati hanno
suggerito che il metodo enzimatico per la misura della
creatinina del siero, che si basa sulla determinazione
della sarcosina dopo conversione della creatinina
mediante creatininasi, creatinasi e sarcosina ossidasi,
può fornire risultati complessivamente più accurati, permettendo quindi una stima della GFR più affidabile (7-10).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’impatto dell’introduzione di questo metodo sia sull’esattezza sia sull’imprecisione della misura delle creatinina del siero in confronto a quanto ottenuto mediante l’impiego di un metodo tradizionale basato sulla reazione al
picrato alcalino, con calibrazione “compensata” per ottenere risultati riferibili al sistema di riferimento (11).
MATERIALI E METODI
Metodi
Il metodo enzimatico colorimetrico (E) utilizzato
[CREA plus, Roche Diagnostics, cod. 03269991 (Cobas
Integra 800) e cod. 11775685 (Hitachi 917 e Modular P)]
si basa sull’idrolisi, catalizzata dall’enzima creatininasi,
della creatinina in creatina, la quale è poi idrolizzata dalla
creatinasi in sarcosina ed urea. La sarcosina, alla presenza di ossigeno, è convertita dalla sarcosina-ossidasi
biochimica clinica, 2007, vol. 31, n. 5
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in glicina, formaldeide e perossido di idrogeno.
Quest’ultimo reagisce con un sistema cromogenico
dando origine ad un colorante chinoneiminico, la cui
intensità di colore è proporzionale alla concentrazione di
creatinina presente nel campione. Il metodo al picrato
alcalino (AP) utilizzato è un metodo in cinetica con determinazione del bianco campione (CREA, Roche
Diagnostics, cod. 1875418), la cui calibrazione è modificata al fine di minimizzare l’interferenza delle proteine
plasmatiche che mimano la creatinina nella reazione,
per ottenere risultati più strettamente allineati al metodo
di riferimento (11). Durante la sperimentazione sono stati
utilizzati tre diversi analizzatori (tutti da Roche
Diagnostics): Cobas Integra 800 e Modular P nella valutazione dell’esattezza e Hitachi 917 e Modular P nella
valutazione dell’imprecisione. Tutti i sistemi analitici
(analizzatore + reagenti + calibratori + controlli) sono
stati utilizzati esattamente come raccomandato dal produttore, avendo cura di eliminare qualsiasi variante operativa che potesse rappresentare una modifica del sistema così come prodotto.
Valutazione dell’esattezza
L’esattezza della misura della creatinina è stata valutata utilizzando 3 campioni ottenuti da pool di sieri addizionati con creatinina cristallina [Trueness Control
Material (TCM) livello 1, 2 e 3], congelati a -80 °C, ai
quali era stato in precedenza assegnato un valore target
di creatinina mediante il metodo di riferimento [spettrometria di massa in diluizione isotopica accoppiata alla
gas-cromatografia (GC-IDMS)]. Ciascun TCM è stato
misurato in quintuplicato nella stessa serie analitica sia
con E (Cobas Integra 800) che con AP (Modular P).
Valutazione dell’imprecisione
Per la valutazione dell’imprecisione dei metodi, è
stata misurata giornalmente la concentrazione di creatinina di un materiale di controllo liquido-congelato (-80
°C) (Liquicheck Unassayed Chemistry Control Level 2,
BioRad) per due periodi di 8 mesi consecutivi, prima con
AP su Hitachi 917 e Modular P (settembre 2005-aprile
2006) e poi con E sugli stessi analizzatori (maggio 2006dicembre 2006).
Criteri di valutazione
Sia per la definizione del traguardo di inesattezza
massima desiderabile che per la definizione del traguardo di imprecisione massima desiderabile sono stati utilizzati i criteri basati sulla variabilità biologica della creatinina nel siero (12). Sulla base di questi criteri, lo scostamento massimo desiderabile è pari a +3,4% e l’imprecisione massima consentita è pari ad un CV di 2,2%.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Esattezza nella determinazione della creatinina
La Tabella 1 riporta i risultati concernenti l’esattezza
della misura della creatinina con i due metodi valutati,
utilizzando come limite di accettabilità lo scostamento
desiderabile ottenuto dai dati di variabilità biologica della
creatininemia. Come si vede, il metodo E produce dati in
pratica sovrapponibili a quelli ottenuti con il metodo di
riferimento, con uno scostamento massimo di +0,55% ad
una concentrazione di creatininemia intorno a 3,5 mg/dL.
Al contrario, il metodo AP mostra uno scostamento inaccettabile (+5,13%) nella misura del TCM livello 1, proprio
intorno ai livelli di concentrazioni considerate più importanti per la stima della GFR. Aumentando le concentrazioni di creatinina, lo scostamento diminuisce, per arrivare in pratica ad annullarsi solo a concentrazioni elevate
di creatinina (TCM livello 3). Da questi dati è evidente
che nemmeno un intervento di “compensazione” matematica della calibrazione, come quello introdotto da
Roche per aumentare l’esattezza del metodo AP (11),
può ridurre in maniera accettabile (almeno quando le
concentrazioni di creatinina sono a livelli parafisiologici)
la ben nota interferenza da parte di cromogeni non-creatininici presenti nel plasma nelle reazioni basate sul
metodo originalmente proposto da Jaffé nel 1886 (13).
C’è da attendersi che dove nemmeno questo intervento
di compensazione fosse introdotto, lo sovrastima da
parte dei metodi AP possa essere ben più consistente ed
arrivare per alcuni sistemi commerciali al 20-25% (vedi
Figura 1 del rif. 7).
Tabella 1
Valutazione dell’esattezza
TCM livello 1
Valore atteso creatinina (mg/dL)
Scostamento desiderabile
(percentuale e assoluto)
0,858
+3,4%
Media metodo picrato alcalino
“compensato” (mg/dL)
Scostamento
(percentuale e assoluto)
+5,13%
350
+3,4%
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3,445
+0,059
+3,4%
1,78
+0,042
+2,71%
0,86
+0,47%
TCM livello 3
1,733
+0,029
0,90
Media metodo enzimatico (mg/dL)
Scostamento
(percentuale e assoluto)
TCM livello 2
3,47
+0,047
+0,14%
1,74
+0,002
+0,29%
+0,117
+0,025
3,48
+0,007
+0,55%
+0,035
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dispersione dei risultati ottenuti. E’ importante notare che
nell’arco di tutta la sperimentazione, solo un dato di CV
mensile (mese di novembre 2006, 2,8%) ottenuto con E
è risultato superiore all’obbiettivo di imprecisione desiderabile (<2,2%), mentre, nel periodo di utilizzo del metodo
AP ben sei CV mensili (pari al 37,5% del totale) superavano questo limite [valori compresi tra 2,5% (Hitachi
gennaio 2006) e 5,1% (Modular novembre 2005)].
CONCLUSIONI
Figura 1
Imprecisione (espressa come CV mensili) della determinazione
della creatinina sull’analizzatore Hitachi 917 (grafico superiore)
e sull’analizzatore Modular P (grafico inferiore). La freccia indica il momento del passaggio dalla metodica al picrato alcalino
a quella enzimatica; la linea tratteggiata indica il limite massimo
desiderabile di imprecisione (CV=2,2%).
I nostri dati dimostrano con evidenza che l’impiego
del metodo E per la misura della creatinina del siero è in
grado fornire un’accuratezza (esattezza ed imprecisione) significativamente migliore rispetto alla metodologia
AP, anche quando in quest’ultima vengano introdotte dal
produttore artificiose modifiche di calibrazione. È quindi
tempo che i laboratori clinici adottino metodi di misura
della creatinina accurati (E) abbandonando metodiche
ormai obsolete (AP), al fine di consentire di stimare in
maniera più affidabile la GFR e di ottenere quindi i rilevanti benefici dovuti alla precoce ed accurata individuazione delle malattie renali croniche (10). Crediamo che di
fronte ad una qualità analitica nettamente migliore, che
si traduce in un rilevante impatto clinico dell’informazione fornita, i responsabili dei laboratori non possano continuare a rimandare tale cambiamento adducendo esclusivamente motivazioni dovute alle differenze di costo dei
reagenti. Come già affermato in una rassegna pubblicata da questa rivista (14), la chiave per realmente apprezzare l’importanza e il vero impatto delle attività di laboratorio deve essere unicamente rappresentata dal considerare gli aspetti economici esclusivamente nel più
ampio contesto dell’economia sanitaria e non solamente
e limitatamente al costo degli esami di laboratorio, dove,
per definizione, ogni determinazione rappresenta un
costo ed il suo valore rimane al di fuori dello scopo finale delle attività del laboratorio stesso.
Precisione nella determinazione della creatinina
Durante il periodo di valutazione dell’imprecisione
sono state eseguite un totale di 624 determinazioni. La
media complessiva delle concentrazioni misurate in 8
mesi sui due strumenti utilizzati (Hitachi e Modular) è
risultata rispettivamente di 5,85 mg/dL per il metodo AP
(n=307) e di 5,70 mg/dL per il metodo E (n=317), confermando una, seppur a queste concentrazioni accettabile,
differenza (2,6%) tra i due metodi. La Figura 1 riporta
l’imprecisione della misura della creatinina (espressa
come CV mensile) dei sistemi analitici valutati, prima utilizzando il metodo AP e poi l’E. L’imprecisione è diminuita in entrambi i sistemi analitici quando è stato introdotto
il metodo E. In particolare, l’analizzatore Hitachi 917 forniva un CV medio complessivo sugli 8 mesi pari al
2,18% per il metodo AP e al 1,25% per il metodo E, con
una differenza statisticamente significativa (P = 0,015).
Anche l’analizzatore Modular P mostrava una diminuzione del CV medio complessivo nel passaggio tra AP ed E
(2,19% vs. 1,51%), anche se tale differenza non raggiungeva la significatività statistica a causa dell’elevata
RINGRAZIAMENTI
Si riconosce il rilevante contributo che il personale
tecnico del Settore Automazione ed Urgenze del
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche dell’A.O. Luigi
Sacco ha fornito per la produzione dei dati utilizzati in
questo lavoro.
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