Dako
HPV Types 6/11
Biotinylated DNA Probe
Codice Y1411
Uso previsto
Per uso diagnostico In Vitro.
Cenni introduttivi
Introduzione
Il Papilloma Virus Umano (HPV) è stato identificato nelle cellule epiteliali di svariati organi, cute e tratto genitale
compresi.1 L'HPV è localizzato nel nucleo e può essere presente in forma episomiale (virus liberi) o integrata.2
Acido nucleico bersaglio
La sonda HPV Types 6/11 Probe ibridizza con le regioni degli ORF (Open Reading Frames, moduli di lettura
aperta) E5, E6 e L2, oltre che con la regione URR (Upstream Regulatory Region, regione di regolazione a
monte) del Papilloma Virus Umano (HPV) tipi 6 e 11.
Specificità
Se utilizzata in condizioni di stringenza, la sonda non rileva il DNA nucleare umano in un dosaggio di
ibridazione in situ non radioattivo, né il DNA dell'E.coli in un dosaggio dot blot. Se utilizzata per l'ibridazione
in situ, la sonda mostra reattività solo con le cellule contenenti HPV.
Attività funzionale
La concentrazione specifica della sonda è formulata mediante titolazione del segnale di ibridazione in situ in un
dosaggio standardizzato non radioattivo.
Reagente fornito
La sonda HPV Types 6/11 Probe viene fornita sotto forma di frammenti di DNA plasmide biotinilato*, di 500 bp
(coppie di basi) o meno, a doppio filamento, in 1,0 mL di soluzione per ibridazione in situ (NaCl 0,3 mol/L e
formammide 50% in tampone).
Da utilizzarsi con In Situ Hybridization System (K0601) o GenPoint™ Detection System (codice K0620).
*Brevetto U.S.A. 4,599,303 concesso in sublicenza da Schleicher & Schuell, Inc.
Materiali necessari
ma non forniti
Fare riferimento alle istruzioni d'uso del sistema di rivelazione In Situ Hybridization o GenPoint™.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
Per uso professionale.
Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.5
Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.
Pericolo
Probe containing Formamide: ≥25-<50% Formamide, ≥1-<3% Cloruro di sodio
H360D
Può nuocere al feto.
P201
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
P280
Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso.
Indossare indumenti protettivi.
P308 + P313
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica.
P405
Conservare sotto chiave.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali,
nazionali e internazionali.
Come regola generale, i minori di 18 anni non sono autorizzati a lavorare con questo
prodotto. Gli utenti devono ricevere un'adeguata preparazione per quanto concerne le
istruzioni operative da seguire, le proprietà nocive del prodotto e le procedure di
sicurezza necessarie.
(128071-001)
P04074IT_01_Y1411/2015.07 p. 1/2
Conservazione
Conservare a 2–8°C. Evitare l'esposizione alla luce diretta o indiretta.
Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati in condizioni difformi
da quelle specificate, l’eventuale uso dovrà essere approvato dall’utente.3 Non sono stati osservati segni
evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno analizzare un controllo positivo
e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che
non sia giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema
della sonda, contattare l’Assistenza Tecnica Dako.
Preparazione dei
campioni
Sezioni in paraffina
La sonda HPV Types 6/11 Biotinylated DNA Probe può essere utilizzata su sezioni di tessuto fissate in
formalina e incluse in paraffina. Per fare in modo che le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente al vetro dei
vetrini, si consiglia di utilizzare il prodotto Silanized Slides (codice S3003).
Le sezioni deparaffinate devono essere pretrattate al fine di consentire l'accesso della sonda alle sequenze di
acido nucleico bersaglio. Incubare in Pepsin 0,8% (codice S3002: sciogliere il contenuto della confezione in
250 mL di acido cloridrico 0,2 N) a 37°C per 5–10 m inuti. Dopo il pretrattamento, le sezioni devono essere
sciacquate in diversi ricambi di acqua deionizzata, quindi immerse in H2O2 0,3% in metanolo per 20 minuti,
infine sciacquate ancora in diversi ricambi di acqua deionizzata.
Procedura di
colorazione
Una volta preparati i campioni, i vetrini vengono lasciati ad asciugare brevemente all'aria, quindi viene aggiunta
su di essi una goccia di HPV Types 6/11 Biotinylated DNA Probe e infine vengono montati i vetrini
coprioggetto. La sonda e il DNA bersaglio vengono denaturati lasciando i vetrini sulla superficie piana di un
blocco riscaldante a 92°C per 5 minuti. Dopo la den aturazione i vetrini vengono trasferiti in una camera
umidificata preriscaldata per l'ibridazione a 37°C (durata 1–18 ore). Dopo l'ibridazione vengono rimossi i vetrini
corpioggetto immergendo i vetrini in 1X TBST (codice S3306 per 10X TBST) a temperatura ambiente. In
seguito i vetrini vengono trasferiti in un bagno di TBST fresco prima del lavaggio di stringenza a 48°C per
30 minuti, seguito a sua volta dal risciacquo in tre ricambi di 1X TBST. La sonda ibridata può essere individuata
con GenPoint Detection System seguendo le istruzioni operative incluse nel kit e applicando un coniugato
streptavidina primaria-HRP diluito con rapporto 1:100 per 30 minuti.
Pattern di colorazione
La colorazione DAB marrone all'interno dei nuclei indica la presenza di HPV.
Caratteristiche
prestazionali
La sonda HPV types 6/11 probe è stata testata su oltre 40 biopsie cervicali infettate con i tipi 6 e 11 dell'HPV
mediante ibridazione in situ con il sistema GenPoint. La presenza del DNA dei tipi 6 e 11 dell'HPV è stata
confermata sia mediante ISH, con sonde tipo-specifiche, sia mediante dosaggi basati su PCR in tempo reale.4
Limiti
L'applicazione di tempi e reagenti di fissazione diversi può influenzare l'intensità del segnale oltre che la
colorazione del fondo. I singoli laboratori di analisi sono tenuti a ottimizzare le procedure di pretrattamento per i
diversi campioni.
Bibliografia
1. Viral Carcinogenesis. Mendelsohn J (eds.). The Molecular Basis of Cancer. W.B. Saunders Company.
2001:Chapter 5
2. Evans MF, et al. Biotinyl-tyramide-based in situ hybridization signal patterns distinguish human papilloma
virus type and grade of cervical intraepithelial neoplasia. Mod Pathol 2002; 15(12):1339
3 Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57FR7163. February 28, 1992
4. Report on file
5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. “Protection of laboratory workers from infectious
diseases transmitted by blood and tissue”; proposed guideline. Villanova, PA. 1991; 7(9):Order Code M29-P
Edition 07/15
(128071-001)
P04074IT_01_Y1411/2015.07 p. 2/2
