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MODULISTICA DI PRESENTAZIONE PROGETTI DI “RICERCA CORRENTE 2015” N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Progetto presentato da: ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA Area tematica: Sicurezza degli alimenti Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Responsabile Scientifico: Dr. Giovanna La Salandra Pagina 1 di 26 Modulo 1 - Presentazione complessiva del progetto Progetto presentato dall’ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC (*) 1. Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti. 2. Durata del progetto (espressa in mesi): 36 mesi 3. Area tematica: Sicurezza degli alimenti 4. Linea di ricerca n. 2 - Titolo linea di ricerca: Sviluppo di metodologie innovative per l’individuazione e/o la ricerca di residui, contaminanti ambientali, sostanze impiegate ad uso fraudolento, additivi e organismi geneticamente modificati negli alimenti di origine animale, vegetale, compreso negli alimenti ad uso zootecnico e, infine, approfondimento sulle cause di introduzione nella catena alimentare e valutazione del rischio 5. Responsabile scientifico del progetto: Cognome: La Salandra Nome: Giovanna Qualifica: Dirigente Sanitario Telefono: 0881/786396 Fax: 0881/786366 E-mail: [email protected] 6. Elenco delle Unità operative impegnate nel progetto: a) n. identif. U.O.: .....1 IMS Responsabile U.O.: Dott.ssa Giovanna La Salandra (IZS PB) b) n. identif. U.O.: ....1 EMS Responsabile U.O.: Dott.ssa Elisabetta Suffredini (ISS – LNR per il controllo delle contaminazioni Virali dei Molluschi Bivalvi) c) n. identif. U.O.: .....2 EMS Responsabile U.O.: Dott. Vito Martella (UNI BA – Dipartimento di medicina veterinaria) (*) Identificativi per IZS: AM=Abruzzo-Molise; LT=Lazio-Toscana; LER=Lombardia-Emilia Romagna; ME=Mezzogiorno; PLV=Piemonte-Liguria-Valled’Aosta; PB=Puglia-Basilicata; SA=Sardegna; SI=Sicilia; UM=Umbria-Marche; VE=Venezie Esempio: IZS AM 01/11 RC RC = Ricerca Corrente Pagina 2 di 26 CURRICULUM VITAE DEL RESPONSABILE DEL PROGETTO Nome: Nata: Qualifica: Ente di appartenenza: tel: indirizzo e mail: Laurea: Specializzazione: Giovanna La Salandra Foggia il 30 luglio 1963 Dirigente sanitario Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Via Manfredonia, 20 71100 Foggia +39 0881786396 [email protected] Scienze Biologiche Scienza dell’alimentazione indirizzo nutrizionistico Responsabile U.O.” Ricerca e sviluppo scientifico - Laboratorio di Biologia molecolare e Batteriologia speciale” Responsabile scientifico di progetti di ricerca corrente nell’area tematica sicurezza alimentare. Autore e coautore di pubblicazioni scientifiche e comunicazioni nazionali ed internazionali su argomenti di sicurezza alimentare e controllo igienico-sanitario degli alimenti. Editor progetti Ricerca finalizzata Ministero della Salute anno 2013 Pubblicazioni area scientifica del progetto 2009 La Salandra G., Crisetti E., Pedarra C., Chiocco D., Parisi A., Celano G.V., Germinario G.L., Mula G., Normanno G. “Antibiotic resistance in the food chain: characterization of S. aureus isolated from milk and cheese in Italy”. Clinical Microbiology and Infection volume 15, supplement n. 4, may 2009. 2009 G. La Salandra, G. Normanno, E. Crisetti, L. Serrecchia, T. Onni, M. Fiori, V. Lorusso, S. Tola. “Molecular typing of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from different foods of animal origin”. Clinical Microbiology and Infection volume 15, supplement n. 4, may 2009. 2009 Lorusso V, Dambrosio A, Quaglia NC, Parisi A, La Salandra G, Lucifora G, Mula G, Virgilio S, Carosielli L, Rella A, Dario M, Normanno G. “Verocytotoxin-producing Escherichia coli O26 in raw water buffalo (Bubalus bubalis) milk products in Italy”. J Food Prot. 2009 Aug; 72(8):1705-8. 2011 Lorusso V, Dambrosio A, Quaglia NC, Parisi A, La Salandra G, Mula G, Virgilio S, Lucifora G, Dario M, Normanno G. “Development of a Multiplex PCR for Rapid Detection of Verocytotoxin-Producing Escherichia coli O26 in Raw Milk and Ground Beef.” Journal of Food Protection, 2011 Jan; 74(1):13-7. 2011 E. Crisetti, A. Cataleta, T. Onni, M.A. Cafiero, S. Tola, G. La Salandra. “Occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in dairy products of Apulia region Italy” Clinical Microbiology and Infection, 17: S108–S668. 2011 A. Q. Nabi, A. Vernile, G.Spano, G. La Salandra, L. Beneduce, G. Colelli, S.Massa. ”PCR-based Quality Control of Listeria spp. and L. monocytogenes in Ready-To-Eat Salads sold in Italy”. Current Nutrition & Food Science, 2011, 7, 57-62. 2013 M.G. Basanisi, E. Crisetti, R. Pedale, M.C. Nardella, G. La Salandra. “S. aureus in Puglia da formaggi a latte crudo ovino e profilo di antibiotico resistenza”. Large Animal Review. Supplemento 1 al n. 5 – Ottobre 2013, anno 19. Pag. 94. 2014 La Bella G., D’Alessandro M., La Salandra G. “Monitoring of Hepatitis A virus and Norovirus in mussels from Puglia (South Italy)”. 24th ECCMID – Barcelona, Spain 10-13 May 2014. 2014 La Bella G., D’Alessandro M., La Salandra G. “Monitoraggio delle contaminazioni da Norovirus e virus dell’epatite a in molluschi bivalvi in Puglia”. ISTISAN Congressi 14/C3, pag. 57 edito da Istituto Superiore di Sanità 2015 F. Mancini, M. Monaco, M.G. Basanisi, G. La Salandra, A. Pantosti. “An unusual PVL-positive MRSA strain in milk and dairy products from a region of South Italy”. Journal of Global Antimicrobial Resistance 3 (2015) 151–152. 2015 M. G. Basanisi, G. Nobili, G. La Bella, R. Russo, G. Spano, G. Normanno, G. La Salandra. “Molecular characterization of Staphylococcus aureus isolated from sheep and goat cheeses in southern Italy”. Small Ruminant Research, submitted. Pagina 3 di 26 Curriculum vitae et studiorum ELISABETTA SUFFREDINI Esperienza professionale - 10.07.2014 – presente: Responsabile del Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle contaminazioni Virali dei Molluschi Bivalvi (art. 33 del Reg. (CE) n.882/2004) - 31.10.2013 – presente: Ricercatore (tempo indeterminato) presso l’Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare - 18.10.2004 – 30.10.2013: Collaboratore Tecnico Enti di Ricerca presso l’Istituto Superiore di Sanità - 23.06.2000 – 17.10.2004: Ricercatore a progetto presso l’Istituto Superiore di Sanità Istruzione e formazione - 24.11.2010 Diploma di Specializzazione in Microbiologia e Virologia - 28.02.2007 Dottorato di Ricerca in Biologia Cellulare e dello Sviluppo - 13.10.2002 Diploma di Specializzazione in Chimica e Tecnologie Alimentari - 18.04.2000 Diploma di Laurea in Scienze Biologiche Esperto nei seguenti gruppi di lavoro: - CEN/TC 275/WG 6/TAG 3 commission per l’elaborazione di metodi analitici molecolari per la ricerca o il conteggio di batteri in matrici alimentari - CEN/TC 275/WG 6/TAG 4 commission per l’elaborazione di metodi per la ricerca dei virus negli alimenti - Gruppo Tecnico per la valutazione dei piani di monitoraggio dei Molluschi Bivalvi – nota DGISAN 937-P11/01/2013 del Ministero della Salute - EFSA BIOHAZ Working Group on Heat treatment of bivalve molluscs; M-2015-0055, EFSA-Q-2015-00161 - Technical sub-group (analytical methods) in the EFSA BIOHAZ Working Group Baseline survey of Norovirus in oysters; EFSA-Q-2015-00455, EFSA-Q-2015-00455 Lecturer nei seguenti corsi universitari: - Corso di Microbiologia Agraria, Laurea Specialistica in Nutrizione Umana, Università di Roma "Tor Vergata" (2004 - presente) - Corso di Microbiologia Generale, Laurea in Scienze Biologiche, Università di Roma "La Sapienza" (2005 - 2012) Pubblicazioni Suffredini E, Ciccaglione AR, Rizzo C, La Rosa G, Capuano F, Proroga Y, Alfonsi V, Bruni R, Tosti ME, Cozzi L, Di Pasquale S, Equestre M, Scavia G, Taffon S, Dimaro O, Losardo M and De Medici D. Multidisciplinary approach in the investigation of a Hepatitis A outbreak and in the management of HAV contaminated shellfish production areas - Campania Region, Italy, 2015. In: 13th National Congress of the Italian Society for Virology. Abstract book; September 14-16, 2015; Orvieto. 2015. p.22. Suffredini E, Lanni L, Arcangeli G, Pepe T, Croci L, Mazzette R, Ciccaglioni G, Croci L. Qualitative and quantitative assessment of viral contamination in bivalve molluscs harvested in Italy. International journal of food microbiology 2014;184:21-26. Suffredini E, Mioni R, Mazzette R, Bordin P, Serratore P, Fois F, Piano A, Cozzi L, Croci L. Detection and quantification of Vibrio parahaemolyticus in shellfish from Italian production areas. International journal of food microbiology 2014;184:14-20. Suffredini E, Cozzi L, Ciccaglioni G, Croci L. Development of a colony hybridizaton method for the enumeration of total and potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus in shellfish. International journal of food microbiology 2014;186:22-31. Pavoni E, Consoli M, Suffredini E, Arcangeli G, Serracca L, Battistini R, Rossini I, Croci L, Losio MN. “Noroviruses in Seafood: A 9-Year Monitoring in Italy”. Foodborne Pathog Dis. 2013 Jun;10(6):533-9 Croci L, Suffredini E. Real-time PCR detection of food-borne pathogenic vibrio. In: Rodrfguez-Lázaro D, ed. “Realtime PCR in food science” Norfolk: Caister Academic Press; 2013. p.135-148. Suffredini E, Magnabosco C, Civettini M, Rossetti E, Arcangeli G, Croci L. “Norovirus contamination in different shellfish species harvested in the same production areas” J Appl Microbiol. 2012 Sep;113(3):686-92 Pepe T, Ventrone I, Suffredini E, Ceruso M, Croci L, Anastasio A, Cortesi ML. “Norovirus monitoring in bivalve molluscs harvested and commercialized in southern Italy”. J Food Prot. 2012 May;75(5):976-81 Suffredini E, López-Joven C, Maddalena L, Croci L, Roque A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and environmental microbiology 2011; 77(17):6301-6304. Suffredini E, Pepe T, Ventrone I, Croci L. Norovirus detection in shellfish using two Real-Time RT-PCR methods. New Microbiol. 2011 Jan; 34(1):9-16. Pagina 4 di 26 FORMATO EUROPEO PER IL CURRICULUM VITAE INFORMAZIONI PERSONALI Nome VITO MARTELLA Indirizzo VIA PESCE N. 50, 70010 CASAMASSIMA (BA) - ITALIA Telefono 0804679805 0804679843 [email protected] Fax E-mail Nazionalità Luogo e Data di nascita Codice fiscale Italiana Torino, 30 /04/1970 MRTVTI70D30L219C ESPERIENZA LAVORATIVA • Date (da – a) • Nome e indirizzo del datore di lavoro • Tipo di azienda o settore • Tipo di impiego • Principali mansioni e responsabilità • Date (da – a) • Nome e indirizzo del datore di lavoro • Tipo di azienda o settore • Tipo di impiego • Principali mansioni e responsabilità CAPACITÀ E COMPETENZE ORGANIZZATIVE Ad es. coordinamento e amministrazione di persone, progetti, bilanci; sul posto di lavoro, in attività di volontariato (ad es. cultura e sport), a casa, ecc. Dall’01/03/2001 ad oggi Università degli Studi di Bari, Palazzo Ateneo, Corso Umberto I n.1, 70100, Bari. Università Professore associato SSD VET/05 (Malattie infettive degli animali domestici) presso il Dipartimento di Medicina Veterinaria, Strada prov. Per Casamassima Km 3, 70010 Valenzano (BA) Ricerca ed insegnamento Dal 01/08/2000 al 27/02/2001 Università degli Studi di Bari, Palazzo Ateneo, Corso Umberto I n.1, 70100, Bari. Università Ricercatore universitario SSD VET/05 (Malattie infettive degli animali domestici) presso Dipartimento di Medicina Veterinaria, Strada prov. Per Casamassima Km 3, 70010 Valenzano (BA) Ricerca ed insegnamento ATTIVITA’ DI COORDINAMENTO DI PROGETTI DI RICERCA Coordinatore scientifico e/o responsabile di unità operativa nell’ambito di numerosi progetti di ricerca corrente e finalizzata finanziati dal Ministero della Salute e di progetti PRIN e PON finanziati dal MIUR. ATTIVITA’ ISTITUZIONALE ED ATTIVITA’ SCIENTIFICA 2015: Membro del Gruppo di Studio sui Calicivirus per l’ICTV (International Commette for Taxonomy of Viruses) Pagina 5 di 26 2014 ad oggi: Componente del Gruppo di lavoro per la ricerca dell’Università degli Studi di Bari 2013 ad oggi: Coordinatore dell’ISGEV (Italian Study Group for Enteric Viruses) 2012: Membro del panel dei Revisori per la Valutazione di progetti per conto del Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca e per la valutatazione dei prodotti della ricerca (VQR 2004-2010) per conto dell'ANVUR Professore a contratto (2 gg) presso Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Brasile 2011 ad oggi: Direttore della Scuola di Dottorato “Sanità Animale e Zoonosi” dell’Università degli Studi di Bari. Membro del Noronet (norovirus classification working group), gruppo di studio internazionale per i norovirus Incluso nell’elenco dei TIS (Top Italian Scientists) 2010: Visiting scientist (3 mesi) presso il FARP, Columbus State University, Wooster, Ohio, USA, collaborando con la Prof.ssa Linda J. Saif. 2009-2010: Valutatore di progetti per la Ohio State University. 2008 ad oggi: Membro del RCWG (Rotavirus Classification Working Group) 2006 ad oggi: Incluso nell’elenco di esperti per i panel scientifici dell’ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control); 2005: Membro del panel di esperti CIVR (Comitato di indirizzo per la valutazione della ricerca). 2001: Visiting scientist (2 mesi) da parte del Baker Institute, Cornell University di Ithaca, New York, USA ATTIVITA’ EDITORIALE E DI Membro dell’editorial board delle riviste Archives of Virology (dal 2008 a 2012), Journal of Medical Science (dal 2012 ad oggi) and Virus Genes (dal 2010 a 2014). Referee per riviste scientifiche internazionali, incluse The Lancet, Virology, Archives of Virology, Veterinary Microbiology, Journal of Virological Methods, Microbes and Infection, Journal of Medical Microbiology, Journal of Medical Virology, Epidemiology and Infection, Journal of Clinical Microbiology, Journal of General Virology, Journal of Virology, Virus Gene, Virus Research, Emerging Infectious Diseases. Referee per tesi di PhD per università estere. ATTIVITA’ DIDATTICA Dall‘anno accademico 2000-2001 ha svolto attività didattica in modo continuativo in corsi di laurea e scuola di specializzazione, presso l’Università degli Studi di Bari PREMI Miglior contributo scientifico SIDiLV (2015) Miglior contributo scientifico SIDiLV (2013) Scopus Highly Cited Italian Scientists (2013) Miglior contributo scientifico SIDiLV (2012) Top Italian Scientist (2011) Miglior contributo scientifico SIDiLV (2011) Fast Breaking Papers (2006) Pagina 6 di 26 PUBBLICAZIONI Autore e coautore di 285 pubblicazioni su riviste internazionali con impact factor soggette a valutazione di referee (H index =42, Scopus, Novembre 2015). ELENCO 10 PUBBLICAZIONI SIGNIFICATIVE ULTIMI 5 ANNI 1. Terio V, Di Pinto A, Di Pinto P, Martella V, Tantillo G. RNA extraction method for the PCR detection of hepatitis A virus in shellfish. Int J Food Microbiol. 2010. 142(1-2):198-201 2. Kroneman A, Vega E, Vennema H, Vinjé J, White PA, Hansman G, Green K, Martella V, Katayama K, Koopmans M. Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping. Arch Virol. 158(10):2059-68. doi: 10.1007/s00705013-1708-5. 3. Giammanco GM, De Grazia S, Tummolo F, Calderaro A, Bonura F, Buonavoglia A, Martella V, Medici MC. Norovirus variant GII.4 Sydney 2012 in Italy in the 2012/2013 winter season. Emerg Inf Dis. 2013. 19(8): 1348-9. 4. Martella V, Medici MC, De Grazia S, Tummolo F, Calderaro A, Bonura F, Saporito L, Terio V, Catella C, Lanave G; Buonavoglia C, Giammanco GM. Evidence for recombination between the pandemic GII.4 norovirus strains New Orleans 2009 and Sydney 2012. J Clin Microbiol. 2013. 51(11): 3855-7 5. Giammanco GM, De Grazia S, Terio V, Lanave G, Catella C, Bonura F, Saporito L, Medici MC, Tummolo F, Calderaro A, Hansmann G, Martella V. Analysis of early strains of the norovirus pandemic variant GII.4 Sydney 2012 identifies mutations in adaptive sites of the capsid protein. Virology. 2014. 450-451:355-8 6. Medici MC, Tummolo F, Martella V, Giammanco GM, De Grazia S, De Conto F, Arcangeletti MC, Chezzi C, Calderaro A. Novel recombinant GII.P16_GII.13 and GII.P16_GII.3 norovirus strains in Italy. Virus Research. 2014. 188: 142–145. 7. Di Martino B, Di Profio F, Ceci C, Di Felice E, Green KY, Bok K, De Grazia S, Giammanco GM, Massirio I, Lorusso E, Buonavoglia C, Marsilio F, Martella V. Seroprevalence of norovirus genogroup IV antibodies among humans, Italy 20102011. Emerg Infect Dis. 2014, 20: 1867-1871. 8. Medici MC, Tummolo F, De Grazia S, Calderaro A, De Conto F, Terio V, Chironna M, Bonura F, Pucci M, Bányai K, Martella V, and Giammanco GM. Epidemiological dynamics of norovirus GII.4 variant New Orleans 2009 in Italy. J Gen Virol. 2015. 96 (9): 2919-27. 9. de Graaf M, van Beek J, Vennema H, Podkolzin AT, Hewitt J, Bucardo-Rivera F, Templeton K, Mans J, Nordgren J, Gábor R, Lynch M, Rasmussen LD, Iritani N , Chan MC, Martella V, Balay K, Vinjé J, White PA, Koopmans MP. Emergence of a novel GII.17 norovirus – End of the GII.4 era? Eurosurveillance. 2015. Jul 2;20(26). pii: 21178. 10. Medici MC, Tummolo F, Calderaro A, Chironna M, Giammanco GM, De Grazia S, Arcangeletti MC, De Conto F, Chezzi C, Martella V. Identification of the emerging Kawasaki 2014 GII.17 human norovirus, Italy, 2015. Eurosurveillance. 2015. 3; September, 20 (35) Pagina 7 di 26 Razionale del progetto I virus enterici rappresentano un importante problema nel settore della sanità pubblica, a causa della loro persistente presenza nell’ambiente e della possibile contaminazione di alimenti e acqua. I Norovirus (NoV) e il virus dell’epatite A (HAV) sono importanti agenti virali d’infezione nell’uomo a trasmissione alimentare e rappresentano rispettivamente la maggiore causa di gastroenterite acuta non batterica e una comune causa di epatite virale (foodborne viruses). Differenti studi epidemiologici indicano i molluschi bivalvi come importanti vettori di tali patologie, a causa della loro capacità di filtrare l’acqua e di concentrare oltre alle sostanze nutrienti anche virus e batteri (Terio et al., 2010). Non esistono attualmente metodi di routine per la coltura di questi virus e la loro diagnostica è basata su metodi molecolari. Nel 2013 sono state pubblicate due procedure standardizzate, la UNI CEN ISO/TS 15216-1:2013 e la UNI CEN ISO/TS 152162:2013, per la determinazione di HAV e di Norovirus negli alimenti mediante Real-Time RT-PCR (RT-qPCR). La RT-qPCR presenta alcuni limiti intrinseci alla metodica quali la necessità di analisi multiple e di curve standard per la quantificazione dell’acido nucleico target in base ai valori di Ct, presentando così delle difficoltà per rilevare e quantificare un basso numero di copie del DNA target. La droplet digital PCR (ddPCR) è un nuovo metodo molecolare utile per una precisa quantificazione degli acidi nucleici che utilizza un'analisi di diluizione del campione, mediante un generatore di droplet (goccioline), e la metodica statistica della distribuzione di Poisson, così da limitare analisi multiple e il ricorso a curve standard per consentire la quantificazione assoluta del numero di copie del DNA target. Inoltre, questo approccio può ridurre la difficoltà di quantificare i virus in presenza di inibitori associati alla tipologia di matrice alimentare (Rački et al., 2014). La ddPCR è una misurazione end-point e utilizza un sistema di reazione di amplificazione simile come sistema alla qPCR basata su tecnologia TaqMan®, ma con il vantaggio di poter calcolare in maniera più accurata e sensibile il numero assoluto di copie del genoma target (copie/µL), specialmente per campioni con una piccola concentrazione di RNA/DNA e anche in campioni complessi. Recentemente sono stati pubblicati alcuni lavori che mostrano l’elevata potenzialità di questa metodica innovativa nella quantificazione assoluta di virus enterici in alimenti (Rački et al., 2014; Coudray et al., 2015). Prima dell’adozione di una metodica nuova, sono tuttavia necessarie prove di validazione e valutazione comparativa, con riferimento a metodi che già sono in uso e ben validati. Tali indagini sono necessarie per fornire agli organi deputati al controllo degli alimenti, uno strumento efficace, in termini di specificità, accuratezza e rapidità dell’analisi. Obiettivi del presente progetto sono: 1. Messa a punto di un protocollo per la ricerca di HAV e Norovirus in alimenti mediante la tecnica della ddPCR; 2. Confronto della ddPCR con i metodi previsti dalle linee guida (RT-qPCR) per la rilevazione e quantificazione di HAV e Norovirus negli alimenti; 3. Raccolta ed analisi comparativa di campioni di molluschi bivalvi prelevati in diverse aree della costa pugliese, mediante screening in parallelo di campioni di campo. BIBLIOGRAFIA: Terio V, Di Pinto A, Di Pinto P, Martella V, Tantillo G. RNA extraction method for the PCR detection of hepatitis A virus in shellfish. Int J Food Microbiol. 2010;142(1-2):198-201. Terio V, Martella V, Moschidou P, Di Pinto P, Tantillo G, Buonavoglia C. Norovirus in retail shellfish. Food Microbiol. 2010: 27(1):29-32. ISO/TS 15216-1:2013 Microbiology of food and animal feed -- Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR -- Part 1: Method for quantification. ISO/TS 15216-2:2013 Microbiology of food and animal feed -- Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR -- Part 2: Method for qualitative detection. Nejc Rački, Dany Morisset, Ion Gutierrez-Aguirre, Maja Ravnikar. One-step RT-droplet digital PCR: a breakthrough in the quantification of waterborne RNA viruses. Anal Bioanal Chem (2014) 406:661–667. Coralie Coudray-Meuniera, Audrey Fraissea, Sandra Martin-Latila, Laurent Guillierb, Sabine Delannoyc, Patrick Fachc, Sylvie Perellea. A comparative study of digital RT-PCR and RT-qPCR for quantification of Hepatitis A virus and Norovirus in lettuce and water samples. International Journal of Food Microbiology 201 (2015) 17. Pagina 8 di 26 Descrizione complessiva del progetto 1. Breve sintesi delle conoscenze già disponibili sull’argomento I virus enterici rappresentano un importante problema nel settore della sanità pubblica, a causa della loro persistente presenza nell’ambiente e alla loro possibile contaminazione di cibi e acqua. Norovirus (NoV) ed Hepatovirus A (HAV) rappresentano rispettivamente la maggiore causa di gastroenterite acuta non batterica e di epatite. Differenti studi epidemiologici indicano i molluschi bivalvi come importanti vettori di tali patologie, a causa della loro capacità di filtrare l’acqua e di concentrare oltre alle sostanze nutrienti anche virus e batteri. Si ipotizza che un certo numero di infezioni sia in parte da attribuire al consumo di alimenti contaminati da questi patogeni. È ormai accettato dalla comunità scientifica internazionale, considerare questi virus come “foodboorne pathogen”. I molluschi bivalvi costituiscono una matrice complessa, in cui i virus target possono essere presenti e capaci di dare infezioni a basse dosi (1-10 UFP). Non esistono attualmente metodi di routine per la coltura di questi virus e la loro diagnostica è basata su metodi molecolari. Nel 2013 sono state pubblicate due procedure standardizzate, la UNI CEN ISO/TS 15216-1:2013 e la UNI CEN ISO/TS 15216-2:2013, per la determinazione di HAV e di Norovirus negli alimenti mediante Real-Time RT-PCR (RT-qPCR). In realtà la RT-qPCR presenta alcuni limiti relativi all’efficienza di amplificazione (sono necessarie analisi multiple del campione) e si basa su curve standard per la quantificazione dell’acido nucleico target in base ai valori di Ct, presentando così delle difficoltà per rilevare e quantificare un basso numero di copie del DNA target. La droplet digital PCR (ddPCR) è un nuovo metodo molecolare utile per una precisa quantificazione degli acidi nucleici che utilizza un'analisi di diluizione del campione, mediante un generatore di droplet (goccioline), e la metodica statistica della distribuzione di Poisson, così da limitare analisi multiple e il ricorso a curve standard per consentire la quantificazione assoluta del numero di copie del DNA target. Inoltre, questo approccio può ridurre la difficoltà di quantificare i virus in presenza di inibitori associati alla tipologia di matrice alimentare (Rački et al., 2014). La ddPCR è una misurazione end-point e utilizza un sistema di reazione di amplificazione simile come sistema alla qPCR basata su tecnologia TaqMan ®, ma con il vantaggio di poter calcolare in maniera più accurata e sensibile il numero assoluto di copie del genoma target (copie/µL), specialmente per campioni con una piccola concentrazione di RNA/DNA, anche in campioni complessi. 2. Quali nuove conoscenze/informazioni il progetto si prefigge di produrre L’obiettivo del progetto è la messa a punto di un protocollo di rilevazione di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante la tecnica della Droplet Digital PCR, e la valutazione delle sue caratteristiche prestazionali ai fini della possibile applicazione come alternativa al metodo standardizzato, basato sull’utilizzo della Real Time RT-PCR. Allo stesso tempo si procederà al confronto del nuovo metodo con quelli standardizzati, fornendo dati di performance analizzando campioni reali di molluschi bivalvi prelevati in diverse aree della costa pugliese. 3. Metodologia Preparazione di standard a RNA e cDNA dei virus target per la valutazione del limite di rilevazione della ddPCR. Estrazione degli acidi nucleici da campioni di campo, prelevati nella zona Pugliese, mediante kit commerciali, come indicato nelle procedure tecniche ISO/TS 15216-1:2013 e ISO/TS 15216-2:2013, o mediante metodologie alternative ugualmente performanti. Analisi molecolare degli estratti per la rilevazione e la quantizzazione dei virus HAV e Norovirus con applicazione delle procedure standardizzate ISO/TS 15216-1:2013 e ISO/TS Pagina 9 di 26 15216-2, mediante Real-Time RT-PCR. 4. Messa a punto del protocollo operativo in ddPCR su standard precedentemente preparati. Si tratta di un saggio basato sull’utilizzo di sonde fluorescenti target specifiche che non necessità di ripetizioni di analisi. Dopo aver preparato la mix di reazione, il campione sarà processato nel generatore di droplet e in seguito sottoposto ad amplificazione PCR. Al termine il software calcolerà la concentrazione del DNA target in copie per microlitro utilizzando l’analisi di distribuzione di Poisson. Analisi in ddPCR degli estratti dei campioni già analizzati in Real-Time RT-PCR. Interpretazione dei risultati. Applicazione di test statistici per l’elaborazione dei dati ottenuti e confronto delle performance delle metodiche Descrizione dei criteri di trasferibilità e di diffusione dei prodotti e dei risultati da conseguire Al termine del progetto si provvederà alla diffusione dei risultati raggiunti e dei dati di performance delle due metodiche, disseminando i prodotti realizzati (documenti metodologici e rapporti tecnici) a tutti gli operatori del settore potenzialmente coinvolti e comunicando i risultati prettamente scientifici nell’ambito di convegni, congressi, etc. In particolare, i risultati del presente progetto saranno oggetto di pubblicazione su riviste nazionali ed internazionali. A conclusione di tutte le attività si procederà all'organizzazione di eventi formativi (giornate di formazione/corsi di aggiornamento) per tutti gli stakeholder del settore. 5. Valore aggiunto dell’aggregazione tra soggetti diversi che partecipano al progetto Le diverse UU.OO., che partecipano al progetto, forniscono competenze e professionalità, ognuna per le diverse fasi del progetto. In particolare, la U.O. 1IMS, radicata sul territorio fornirà la base del campionamento e svilupperà la metodica ddPCR, avendo già avviato la ricerca di HAV e Norovirus in alimenti mediante tale strumento con una precedente ricerca. Le UU.OO. 1EMS e 2EMS, forniranno il supporto scientifico indispensabile per la messa a punto della metodica e la stesura del protocollo operativo con confronto in termini di performance delle metodiche oggetto del lavoro. La potenzialità del progetto è basata proprio sull’aggregazione dei soggetti partecipanti. 6. Descrizione e spiegazione dell’articolazione del programma in fasi fra le varie UU.OO. La ricerca si articolerà in sei work package: • WP1: Ricerca bibliografica. • WP2: Campionamento e analisi molecolare dei campioni di mitili mediante Real Time RTPCR. • WP3: Messa a punto e standardizzazione del saggio in Droplet Digital PCR su materiale di riferimento. • WP4: Analisi campioni di campo in Droplet Digital PCR. • WP5: Elaborazione dati ottenuti e confronto delle metodiche. Pagina 10 di 26 • WP6: Presentazione dei risultati ottenuti a convegni nazionali e/o internazionali e redazione di pubblicazioni su riveste scientifiche nazionali e/o internazionali. WP1 Sarà effettuata la raccolta bibliografica di materiale scientifico aggiornato sugli argomenti di interesse, mediante la consultazione di banche dati elettroniche, testi e riviste scientifiche. WP2 Le UU.OO. 1IMS e 2EMS procederanno al campionamento di mitili della costa Pugliese. I campioni saranno successivamente analizzati mediante applicazione della procedura standardizzata UNI CEN ISO/TS 15216-2 per la ricerca di HAV e Norovirus. WP3 Per la messa a punto del saggio in Droplet Digital PCR per la ricerca e la quantizzazione di HAV e Norovirus si partirà da materiale di riferimento e target analitici (RNA o cDNA), fornito dall’U.O. 1EMS, quantizzati mediante metodica di riferimento RT-qPCR (ISO/TS 15216-1:2013). Su tale materiale lavorerà l’U.O. 1IMS al fine di ottenere una procedura in ddPCR applicabile all’analisi dei campioni di campo e valutazione delle sue caratteristiche prestazionali. WP4 Al fine di ottenere dati sul confronto delle metodiche Real-Time RT-qPCR e ddPCR, il protocollo operativo messo a punto precedentemente in ddPCR verrà utilizzato nella ricerca dei virus target negli estratti dei campioni di campo, già analizzati in Real-Time RT-PCR. WP5 I risultati delle analisi effettuate in Real-Time RT-PCR e Droplet Digital PCR saranno elaborati confrontandoli al fine di ottenere dati relativi alle performance delle due metodiche. WP6 Tutti i dati relativi all’indagine verranno raccolti in una relazione che sarà successivamente diffusa. A conclusione del progetto verrà organizzato un convegno per comunicare e divulgare i risultati raggiunti fornendo spunti per futuri lavori ed approfondimenti scientifici, nonché indicazioni metodologiche utili per i futuri piani di controllo ufficiale. 7. Output del programma (es. documenti; metodologie; corsi di formazione, attivazione di servizi, etc.) con indicazione dei tempi previsti per la presentazione Report sulla problematica con riferimento alle norme europee adottate e ai risultati scientifici diffusi nel breve periodo da gruppi di ricerca nazionali e internazionali. Predisposizione dei campioni e primi dati sulle analisi molecolari (entro il 18° mese) R1. Report finale sui risultati ottenuti (entro il 36° mese) R2. Giornate di formazione sulla metodica e i protocolli messi a punto per l’analisi con riferimento in particolare all’utilizzo della Droplet Digital PCR agli operatori del settore alimentare che si occupano di controllo di qualità e agli organi ufficiali per il controllo delle contaminazioni virali. Workshop rivolto agli operatori del settore per il trasferimento sul territorio dei risultati ottenuti. WS (36° mese). 8. Obiettivi e indicatori per la verifica dei risultati raggiunti L’obiettivo del progetto è la messa a punto di un protocollo di rilevazione di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante la tecnica della Droplet Digital PCR, e la valutazione delle sue caratteristiche prestazionali ai fini della possibile applicazione come alternativa al metodo standardizzato, basato sull’utilizzo della Real Time RT-PCR. Allo stesso tempo si procederà al Pagina 11 di 26 confronto del nuovo metodo con quelli già standardizzati, in particolare fornendo dati di performance analizzando campioni reali di molluschi bivalvi prelevati in diverse aree della costa pugliese. Il metodo basato sull’utilizzo della ddPCR potrà essere così utilizzato per la ricerca di virus enterici, HAV e Norovirus, anche in altri alimenti al fine di fornire uno strumento maggiormente performante e in grado di rilevare anche minime quantità di questi patogeni alimentari. Gli indicatori utilizzati per la verifica del raggiungimento degli obiettivi generali del progetto sono rappresentati dalla diffusione della metodologia applicata al controllo delle contaminazioni degli alimenti da virus enterici e anche da giornate di divulgazione e formazione degli operatori del S.S.N. impegnati nel settore della sicurezza alimentare. Pagina 12 di 26 Cronogramma del progetto L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti WP0: Gestione amministrativa e coordinamento scientifico del progetto – mesi 1 – 36. WP1: Ricerca bibliografica. WP2: Campionamento e analisi molecolare dei campioni di mitili mediante Real Time RT-PCR WP3: Messa a punto e standardizzazione del saggio in Droplet Digital PCR su materiale di riferimento. WP4: Analisi campioni di campo in Droplet Digital PCR. WP5: Elaborazione dati ottenuti e confronto delle metodiche. WP6: Presentazione dei risultati ottenuti a convegni nazionali e/o internazionali e redazione di pubblicazioni su riveste scientifiche nazionali e/o internazionali. UO 1 1 1, 3 1, 2 1 1, 2, 3 1, 2, 3 WP 1 0 1 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 3 4 5 6 R1 WS R2 R1-2: Rapporti WS: Workshop 1 = U.O. 1IMS, IZS della Puglia e della Basilicata - S.S. “Biologia molecolare e batteriologia speciale” 2 = U.O. 1EMS, Istituto Superiore di Sanità – Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo della contaminazioni virali dei molluschi 3 = U.O. 2EMS, Università degli Studi di Bari – Dipartimento di Medicina Veterinaria Pagina 13 di 26 Modulo 1bis - Progetto dell’Unità Operativa di ricerca 1. Unità Operativa 1 IMS N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Numero identificativo dell’Unità Operativa e tipo: 1 IMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Responsabile scientifico dell’Unità Operativa: Cognome: La Salandra Nome: Giovanna Qualifica: Dirigente Sanitario Telefono: 0881/786396 Fax: 0881/786366 E-mail: [email protected] Pagina 14 di 26 Descrizione del contributo specifico fornito al progetto dall’U.O. con indicazione delle attività, metodologia e obiettivi perseguiti Il contributo fornito al progetto “L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti” dall' U.O. 1 IMS riguarderà le seguenti attività: 1. Gestione del progetto; 2. Raccolta di campioni di mitili e analisi per la ricerca di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante l’applicazione della procedura tecnica UNI CEN ISO ISO/TS 152162:2013 utilizzando la metodica Real Time RT-PCR; 3. Messa a punto e ottimizzazione della metodica di rilevazione e quantificazione mediante la tecnica della Droplet Digital PCR a partire da materiale di riferimento e stesura finale del protocollo; 4. Analisi molecolare degli estratti dei campioni di campo, precedentemente analizzati in Real Time RT-PCR, con il protocollo messo a punto in Droplet Digital PCR; 5. Analisi statistica e confronto dei dati delle due metodiche Real Time RT-PCR e Droplet Digital PCR; 6. Divulgazione dei risultati mediante presentazione in congressi/conferenze e mediante pubblicazione dei dati su riviste scientifiche. L’obiettivo del progetto e delle attività della U.O. 1 IMS all’interno di esso è la messa a punto di un protocollo di rilevazione di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante la tecnica della Droplet Digital PCR, e la valutazione delle sue caratteristiche prestazionali ai fini della sua possibile applicazione come alternativa al metodo standardizzato basato sull’utilizzo della Real Time RTPCR. Pagina 15 di 26 Modulo 1bis - Progetto dell’Unità Operativa di ricerca 1. Unità Operativa 1 EMS N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Numero identificativo dell’Unità Operativa e tipo: 1 EMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Istituto Superiore di Sanità Responsabile scientifico dell’Unità Operativa: Cognome: Suffredini Nome: Elisabetta Qualifica: Ricercatore; Responsabile del Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle contaminazioni Virali dei Molluschi Bivalvi Telefono: 06/49902477 Fax: 06/49902045 E-mail: [email protected] Pagina 16 di 26 Descrizione del contributo specifico fornito al progetto dall’U.O. con indicazione delle attività, metodologia e obiettivi perseguiti Il contributo dell’unità operativa 1 EMS al progetto “L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti” consisterà nelle seguenti attività: 1. Collaborazione nella messa a punto e nell’ottimizzazione della metodica di rilevazione e quantificazione mediante la tecnica della Droplet Digital PCR; 2. Fornitura di materiali di riferimento e target analitici (acidi nucleici di HAV e NoV) quantizzati mediante metodica di riferimento RT-qPCR (ISO/TS 15216-1:2013); 3. Collaborare all’elaborazione dei risultati delle prove; 4. Supporto nella stesura finale del protocollo in Droplet Digital PCR; 5. Supporto nelle attività di divulgazione dei risultati stessi mediante presentazione in congressi/conferenze e mediante pubblicazione dei dati su riviste scientifiche. A tale scopo l’unità operativa 1 EMS provvederà a preparare adeguati standard (RNA virale o di sintesi e cDNA quantizzato) per la valutazione del limite di rilevazione della ddPCR in reazione semplice e in presenza di inibenti derivanti da matrice alimentare. Tali standard saranno quantizzati mediante metodica validata e accreditata ISO/TS 15216-1:2013. L’obiettivo del progetto e delle attività della U.O. 1 EMS all’interno di esso è la messa a punto di un protocollo di rilevazione di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante la tecnica della Droplet Digital PCR, e la valutazione delle sue caratteristiche prestazionali ai fini della sua possibile applicazione come alternativa al metodo standardizzato basato sull’utilizzo della Real Time RT-PCR. Pagina 17 di 26 Modulo 1bis - Progetto dell’Unità Operativa di ricerca 1. Unità Operativa 2 EMS N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Numero identificativo dell’Unità Operativa e tipo: 2 EMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” – Dipartimento di Medicina Veterinaria Responsabile scientifico dell’Unità Operativa: Cognome: Martella Nome: Vito Qualifica: Professore Associato Telefono 080/467982015 Fax: 080/4679843 E-mail: [email protected] Pagina 18 di 26 Descrizione del contributo specifico fornito al progetto dall’U.O. con indicazione delle attività, metodologia e obiettivi perseguiti Il contributo dell’unità operativa 2 EMS al progetto “L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di norovirus in alimenti” consisterà nelle seguenti attività: 1. Raccolta di campioni di mitili da impianti di allevamento della Regione Puglia; 2. Analisi dei campioni con metodiche ISO 3. Collaborazione nella messa a punto e nell’ottimizzazione della metodica di rilevazione e quantificazione mediante la tecnica della Droplet Digital PCR; 4. Supporto nella validazione della Droplet Digital PCR su campioni di campo; 5. Supporto nelle attività di divulgazione dei risultati stessi mediante presentazione in congressi/conferenze e mediante pubblicazione dei dati su riviste scientifiche. A tale scopo l’unità operativa 2 EMS provvederà alla raccolta dei campioni di mitili prelevati dagli impianti di allevamento della Regione Puglia e all’analisi molecolare mediante metodiche ISO. L’obiettivo del progetto e delle attività della U.O. 2 EMS all’interno di esso è la messa a punto di un protocollo di rilevazione di virus enterici, quali HAV e Norovirus, mediante la tecnica della Droplet Digital PCR, e la valutazione delle sue caratteristiche prestazionali ai fini della sua possibile applicazione come alternativa al metodo standardizzato basato sull’utilizzo della Real Time RT-PCR. Pagina 19 di 26 Tabella n. 1 – Risorse umane impegnate nel progetto per singola U.O. N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Durata del progetto (espressa in mesi): 36 mesi Unità Operativa n. 1 IMS Ente di appartenenza della Unità Operativa: Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome La Salandra NOME Giovanna La Salandra Nome Giovanna Laboratorio/Sezione di QUALIFICA IZSPB – Laboratorio di Biologia Dirigente sanitario Rapporto di lavoro MESI UOMO Dipendente - TI 4/1 Dipendente - TI 4/1 Molecolare e Batteriologia Speciale Rosa Coppola IZSPB – Laboratorio di Biologia Tecnico di laboratorio Molecolare e Batteriologia Speciale IZSPB – Laboratorio di Biologia Biologo/biotecnologo Contratto a tempo determinato/borsa di 22/1 Molecolare e Batteriologia Speciale studio/altra tipologia di contratto TOTALE: 30/3 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA Firma del Responsabile Scientifico del progetto Firma del Direttore dell’IZS capofila (per ciascuna U.O.) (solo per U.O. proponente) DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA PROF. CANIO BUONAVOGLIA Pagina 20 di 26 Tabella n. 1 – Risorse umane impegnate nel progetto per singola U.O. N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Durata del progetto (espressa in mesi): 36 mesi Unità Operativa n. 1 EMS Ente di appartenenza della Unità Operativa: Istituto Superiore di Sanità Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome Suffredini NOME Elisabetta Suffredini Nome Elisabetta Laboratorio/Sezione di Dipartimento di Sanità QUALIFICA Pubblica Ricercatore Rapporto di lavoro MESI UOMO Dipendente - TI 3/1 Dipendente - TI 3/1 Veterinaria e Sicurezza Alimentare – Reparto Pericoli Microbiologici connessi agli Alimenti Simona Di Pasquale Dipartimento di Sanità Pubblica Ricercatore Veterinaria e Sicurezza Alimentare – Reparto Pericoli Microbiologici connessi agli Alimenti TOTALE: 6/2 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa ..................................................……….......................... Firma del Responsabile Scientifico del progetto Firma del Direttore dell’IZS capofila (per ciascuna U.O.) (solo per U.O. proponente) DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA PROF. CANIO BUONAVOGLIA Pagina 21 di 26 Tabella n. 1 – Risorse umane impegnate nel progetto per singola U.O. N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Durata del progetto (espressa in mesi): 36 mesi Unità Operativa n. 2 EMS Ente di appartenenza della Unità Operativa: Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” – Dipartimento di Medicina Veterinaria Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome Martella NOME Vito Martella Nome Vito Laboratorio/Sezione di QUALIFICA Dipartimento di Medicina Veterinaria Professore Associato Sezione “Malattie infettive” Rapporto di lavoro MESI UOMO TI 6/1 TI 6/1 – Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” Valentina Terio Dipartimento di Medicina Veterinaria Ricercatore confermato Sezione “Malattie infettive” – Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” TOTALE: 12/2 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa ..................................................……….......................... Firma del Responsabile Scientifico del progetto Firma del Direttore dell’IZS capofila (per ciascuna U.O.) (solo per U.O. proponente) DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA PROF. CANIO BUONAVOGLIA Pagina 22 di 26 Tabella n. 2 - Spese complessive intero progetto N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Durata del progetto (espressa in mesi): 36 mesi Responsabile scientifico del progetto: Cognome La Salandra Nome Giovanna UNITA’ IMS VOCI DI SPESA UNITA’ 1 TOTALE - attrezzature - materiale di consumo 10.000,00 10.000,00 - personale non dipendente 36.000,00 36.000,00 3.000,00 3.000,00 500,00 500,00 49.500,00 49.500,00 - missioni - spese generali (max. 10%) (1) TOTALE PARZIALE IMS UNITA’ EMS VOCI DI SPESA UNITA’ 1 - materiale di consumo UNITA’ 2 TOTALE 3.500,00 3.500,00 1.000,00 1.910,00 - personale non dipendente - missioni - spese generali (max. 10%) 910,00 90,00 90,00 (2) TOTALE PARZIALE EMS 1.000,00 4.500,00 5.500,00 (1+2) TOT. GENERALE 49.500,00 5.500,00 55.000,00 Firma del Responsabile scientifico DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA Firma del Direttore dell’IZS PROF. CANIO BUONAVOGLIA Pagina 23 di 26 Tabella n. 3 - Spese per U.O. IMS N. identificativo progetto: IZS PB 07 /15 RC Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Numero identificativo Unità Operativa: 1 IMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome La Salandra VOCI DI SPESA Nome Giovanna IMPORTI DESCRIZIONE - attrezzature - materiale di consumo 10.000,00 Reagenti e consumabili di laboratorio - personale a contratto 36.000,00 Biologo/Biotecnologo per due anni con esperienza nella ricerca sulla sicurezza degli alimenti e conoscenza certificata di piattaforme innovative di analisi come Real Time PCR e ddPCR - missioni 3.000,00 Riunioni del progetto; attività di divulgazione dei risultati - spese generali (max. 10%) (1) TOTALE 500,00 Produzione di materiale divulgativo, consulenza tecnica, acquisto software 49.500,00 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa Firma del Responsabile Scientifico del progetto DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA Pagina 24 di 26 Tabella n. 4 - Spese per U.O. EMS N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Numero identificativo Unità Operativa: 1 EMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Istituto Superiore di Sanità Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome Suffredini VOCI DI SPESA IMPORTI Nome Elisabetta DESCRIZIONE - materiale di consumo - personale a contratto - missioni 910,00 Riunioni del progetto; attività di divulgazione dei risultati. - spese generali (max. 10%) (1) TOTALE 90,00 1.000,00 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa Firma del Responsabile Scientifico del progetto ..................................... .............……….......................... DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA Pagina 25 di 26 Tabella n. 4 - Spese per U.O. EMS N. identificativo progetto: IZS PB 07/15 RC Titolo del progetto: L’innovazione della Droplet Digital PCR (ddPCR) per la rilevazione e quantificazione del virus dell’epatite A e di Norovirus in alimenti Numero identificativo Unità Operativa: 2 EMS Ente di appartenenza dell’Unità Operativa: Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” – Dipartimento di Medicina Veterinaria Responsabile scientifico dell’U.O.: Cognome Martella VOCI DI SPESA - materiale di consumo Nome Vito IMPORTI DESCRIZIONE 3.500,00 Reagenti e consumabili di laboratorio - personale a contratto - missioni 1.000,00 Riunioni del progetto; attività di divulgazione dei risultati - spese generali (max. 10%) (1) TOTALE 4.500,00 Firma del Responsabile scientifico dell’Unità Operativa Firma del Responsabile Scientifico del progetto ..................................................……….......................... DR.SSA GIOVANNA LA SALANDRA Pagina 26 di 26
