Binding

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Binding
glicocalice: carboidrati
adsorbiti sulle proteine
transmembrane. Perche la
membrana è negativa?
Membrana ès 40% protein,
45% lipidi e 5% carboidrati
40
A
100-200
A
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Schematizzazione del binding o legame tra un recettore transmembraneo e
un ligando esterno seguito dal trafficking e risposta interno e a sua volta da
una risposta che verrà trasmessa all’esterno.
Signal cascade
nucleus
Short term response
long term response
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Tipi di ligando
Classi di ligandi
Proteine
Endocrine: generalmente
ormoni es. Insulina, steroidi
Steriodi
Peptidi
Ioni (Ca++, Na+) e
molecole piccole
((NO))
I segnali possono dare
luogo a:
Trasmissione nervosa
Autocrine: generalmente
proteine es. collagene
Rilascio ormoni
Paracrine: citochine,
chemochine
Stimolazione della crescita
Contrazione muscolare
Adesione
Classi di recettori
Recettore a canale ionico(velocità del ordine di ms, affinità bassa)
Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) (velocità dell’ordine di
minuti, affinità media)
Recettori enzimatici (tipicamente alta affinità ma con tempi di reazione
elevati)
Recettori tirosina chinasi (enzimi che agiscono fosforilando residui di
tirosina nella proteina bersaglio), (velocità dell’ordine di diversi min, alta
affinità)
I CSR
•
•
•
•
•
La maggior parte delle sostanze idrofobiche, e con basso peso molecolare,
passano attraverso la membrana cellulare per diffusione passiva ( gli
steroidi, l’ossido nitrico ecc). Il passaggio di quasi tutte le altre sostanze,
come ad esempio le proteine (citochine, ormoni ecc), il glucosio, gli ioni, gli
amminoacidi ecc, è mediato invece dalle proteine transmembranali.
Le proteine transmembranali responsabili invece, della comunicazione
(recezione segnali, trasmissione segnali e canali di passaggio) sono
chiamate recettori (noti anche come CSR o cell surface receptors). I
recettori, sono caratterizzati da 3 zone o domini:
. I CSR formano legami con i ligandi esterni, che possono essere altre
cellule, o molecole presenti nella ECM. In questo modo i recettori
funzionano da veri e propri sensori ambientali e grazie all’interazione
dinamica e reciproca modificano e modulano l’habitat cellulare.
I recettori possono essere considerati le porte e finestre per la
comunicazione della cellula con l’ambiente
l ambiente esterno,
esterno sia con la matrice extra
cellulare (ECM) che con altre cellule.
I recettori sono inoltre di fondamentale importanza nella rigenerazione dei
tessuti perchè modulano e regolano l’interazione della cellula con i supporti
e substrati sintetici, con i biomateriali, con i farmaci, e con i fattori di
crescita.
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I CAMs sono un tipo particolare di CSR
Il meccanismo di riconoscimento attraverso i CAM è uno dei principali modi in
cui la cellula interagisce con suo ambiente.
Ci sono 4 classi principali di CAM
CAM
Caratteristiche
Integrine
-legano ai ligandi adesivi della matrice extra cellulare, sono detti
legami eterofilici
Caderine
- legano a cellule vicine, generalmente omotipici (caderinacaderina) e sono calcio dipendenti. Le caderine sono
fondamentali per la morfogenesi.
Ig CAM
- legano a altre cellule, generalmente formando legami omotipici,
sono meno forti di legami caderine-caderine e sono le uniche
CAM che non dipendono dalla presenza di calcio.
Selectine
- legano a mucine (la parte glicosata delle proteine), quindi
formano legami etereofilici.
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Le Cadherine: quasi sempre legame omofilico
Hanno 5 domini fuori, i trans membrano e uno nel citoplasma. I 5
domini fuori si legano con cadherine della cellula adiacente.
Importante per lo sviluppo aggregazione e
disaggregazione cellulare (up and down regulation).
Anticorpi contro cadherina rompono i legami e
di t
distruggono
epitelio
it li
Sono Ca dipendenti
E cad (epiteliale), N cad, ecc
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Epithelial cells
Epithelial cells
Basal lamina
Collagen fibrils
Scanning electron micrograph of a basal lamina in the cornea of a chick embryo
Adesione, Motilità
e Forze di adesione
Perche sono importanti
• Adesione scaffold
• Integrazione ospite-costrutto
• Colonizzazione scaffold
• (morfogenesi e guarigione)
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Le integrine
L’importanza dell’interazione tra cellule e la ECM. Livello macromolecolare.
L ECM non è una struttura di supporta ma gioca un ruolo attivo e importante
in tante funzioni dette cellulari. Migrazione, proliferazione, differenzazione,
apoptosis. Inoltre modula l’espresione delle citochine e i fattori di crescità e
attiva la trasduzione e segnalazione intracellulare. Il rapporto cellule ECM
funziona per reciprocità dinamica.
L ECM è l’ambiente
La
l’ bi t che
h regola
l la
l dinamica
di
i dell’espressione
d ll’
i
genetica
ti e
differenzazione.
Le molecole del ECM interagiscono con i recettori (CSR-cell surface receptors)
che trasmettano segnali attraverso la membrana a molecole dentro i citoplasma.
Questi segnal iniziano una cascata di eventi attraverso il CSK al nucleo
(cytoskeleton) che risulatno nell’espressione di geni. Questo vanno trascritti in
proteine che hanno un effetto sull ECM. (Inside-out hypothesis)
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CAM :Cell Adhesion molecule, CSR : cell
surface receptors. VCAM, PECAM
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Le molecole dell’ECM: GAG, HA, elastina,
collagene, fibronettina, laminina ecc. Calcio,
sodio, acqua, fattori di crescita ecc. Le
macromolecole hanno elavate peso molecolare e
diffondo poco. La classe più importantedi CSR
per la ECM sono le INTEGRINE. Sono proteine
transmembrane con 2 subunita glicoproteiche ,
alpha e beta non legate cov. tra di loro. Si dice
proteine eterodimeriche in cui le varie α e β
sono omologhe fino al 40% . Per ora sono state
identificate 9 subunità α e circa 16 β, e
24integrine.DI queste 8 riconoscono Fn e 5
laminina.
Le proteine del ECM hanno dei AA specifici che
si legano alle integrine. La sequenza tripeptidica
piu comune è il RGD che si trova in Fb, lam,
coll.
La catena α è piu specifico nel riconoscimento.
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•Gran parte sta fuori nello sapzio extra cellulare.
•La parte extra c. del dominio α ha 4 siti per legare a ioni ++ e sono coinvolti nel
legame che calmodulina che è sempre presente nelle interazioni.
•Il legame con la ECM induce dei segnali intra c. La parte interna interagisce con il
CSK. In generale, segnale dal ECM attraverso le integrine vengono trasdotte via il
CSK e induce cambiamenti di forma che portano a movimento, proliferazione,
diff
differenzazione
i
ecc.
• Alcuni recettori sono specifici altri riconoscono più epitopi
•Possono anche diversificarsi (plasticità e ridondanza)
•Affinita 106-109 litri/mole. Da confrontare con l’affinità anticorpo-antigene.
•Sono presenti in concentrazioni da 10 o 100 volte di più. La loro azione dipende dall
concentrazione locale,, e ppossono solo agire
g quando
q
ppresente in densità locali grandi
g
(zone di adesioni focali o emidesmosomi). Quando sono diffusi in maniera omogena
sulla CM, non c’è adesione. Quando stimolati si raggruppano in contatti focali, e la
somma delle loro affinità per unità di area aumenta. Le integrine possono spostarsi
per espolarare l’ambiente. Se l’affinità fosse alta, non sarebbe facile interompere il
legame e non ci sarebe motilità cellulare.
•Multiple weak adhesions-----few strong adhesions
La formazione di un contatto focale grazie alla migrazione di integrine in un
punto comune della membrana cellulare . Dalla parte citoplasmica le catene β
delle integrine si legano a 2 proteine talina e α-actinina. In seguito viene
associato anche la FAK, che si fosforilizza, e altre due proteine: vinculina e
paxillina. Successivamente avviene il legame con l’actina che si polimerizza
formando i microfilamenti. Si associano anche i microtubol
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The cytoskeleton: microfilaments, intermediate filaments and
filaments
Micro filaments: Actin – contractile 3-6 nm
Intermediate filaments (fibrous proteins eg desmin, vimentin)10 nm. - tensile, rope like structures, much longer than actin.
Form the structural framework in the cell.
Filaments: microtubules 25 nm. Cell shape and
motility. Tracks for vesicle movement
Il processo di adesione
1. L’integrina lega al RGD (pochi secondi)
2. La prima proteina (gia presente) è talina, quasi sempre associata
a vinculina. Talina ha siti per legarsi a integrine, actina e
vinculina
3. La proteina a actinina lega fibrille di actina ai CAM. Questa
proteina reticola le fibrille di actina che polimerizzandosi
diventao filamenti contrattili, formando le microfibrille. Altre
proteine importanti sono la filamina e la paxillina
4. In presenza di più integrine arriva il FAK Focal adhesion kinase, un
enzima tyrosina kinase, che legandosi al complesso proteico si
fosforilizza (a un residuo tryosina) e cosi diventa altamente
reattivo iniziando la cascata di reazioni e la formazione di un
complesso proteico sotto l’integrina.
5. Dii seguito
i c’è una riorganizzione
i
i i
del
d l citoscheletro,
i
h l
e la
l cellula
ll l
diventa rigida, contrattile. Di solito c’e anche l’espressione
proteica. T= poche ore.
6. Il segnale viene cosi trasmesso all’interno della cellula.
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Le I si raggruppano e inizia una cascata di segnali
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Cellula non adesa, poco adesa e molto adesa, su un substrato.
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IL controllo dell’adesione (e quindi motilità, e espressione quindi
fenotipo)
Gradienti chemeotattici: concentrazioni differenti nello spazio, nel caso di ligandi solubili,
possono dare luogo alla migrazione.
Gradienti haptotattici: concentrazioni differenti nello spazio nel caso in cui il ligando sia
insolubile o immobilizzato. Si tratta per esempio di molecole presenti su un substrato o le
molecole
l l del
d l ECM
Inibizione da contatto: Quando le cellule sentono la vicinanza fisica delle altre, non sono
più in grado di spostarsoi o proliferare. Il contatto può essere considerato come un segnale
che l’unità funzionale è arrivata a uno stato di equilibrio. L’inibizione da contatto è un
meccanismo molto importante nelle cellule epiteliali, ed è noto che le cellule tumorali
perdono questo tipo di controllo interno, dando luogo alla formazione di masse cellulari o
tumori.
Galvanotassi: E’ il movimento cellulare dovuto alla presenza di campi elettrici, ed è un
fenomeno ben noto neglii embrioni che possiedono anche una polarità elettrica.
elettrica
Guida dal contatto o “contact guidance”: La modulazione del movimento e crescita in base
alla forma toplogica del substrato. E’ un fenomeno noto sopratutto nelle colture cellulari di
neuroni e nella coltura di cellule muscolari scheletriche.
Durotassi: fenomeno noto da poco. Regolazione adesione in base al modulo elastico del
substrato.
Assono su reti
Le linee
L
li
di stress
t
create
t da
d un
fibroblasto su silicone
Questo è contact guidance
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Inibizione di contatto invece da un segnale a una cellula di non
muovere o crescere piu, e i risultato e un movimento da masse
di cellule. I lamelli crescono verso zone dove non ci sono
cellule. Il fenomeno occore principalmente in c. Mesenchimali
e non occore in strati epiteliali
p
((solo tumorali)) tranne ai bordi
laterali.
Fibroblasti: i lamellipodii si
avvicinano, poi una passa sotto e
dopo si ritira
Motilità
S=velocita
P=tempo di persistenza= tempo che percorre tra due cambi di
direzione con orientazioni distinte
Cellula
Funzione
s (velocità)
P (tempo di
persistenza)
Neutrofili
Fagocitosi batteri
20 µm/min
4 min
Linfociti
Distruzione cellule
4 µm/min
20 min
Macrofagi
Sviluppo antigeni
2 µm/min
30 min
Cellule endoteliali
angiogenesi
0.5 µm/min
4-5 ore
Cellule embrioniche
morfogenesi
0.16 µm/min
Fibroblasti
Guarigione
0.5 µm/min
1 ora
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x(t ) = 2nµt
x(t )2 = 2nS 2 P {t − P(1 + e−t / P )}
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Andamento bifasico.
1. Down regulation
2. Substrato troppo appicicoso
Velocità e concentrazione di ligando adesivo
Motilità cellulare in funzione dell’adesivita e affinità di una superficie. Se il
legame integrina-superficie ha un elevata affinità, basta una piccola
concentrazione per aumentare la velocità. Invece se il valore di KD è elevato,
sono necessarie più ligando per stimolare la migrazione.
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Motilita cellulare in funzione del rapporto adesività del substrato/coesività
cellulare. Se le cellule sono coesive tendono a migrare meno. Invece cellule che
interagiscono con la matrice sono più motili, e più sensibili a gradienti haptotattici.
Energia potenziale o energia libera in funzione della distanza dalla
superficie di una cellula. Il buco di potenziale dovuto al
legame Recettore-Ligando si trova a circa 25 nm dalla
superficie.
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Abbassamento della barriera di energia potenziale in
seguito alla sollecitazione del legame con a una
forza pari a F.
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