PARAMETRI EMATOLOGICI PER
LA VALUTAZIONE DEL
BENESSERE ANIMALE
CONCETTO DI BENESSERE
ANIMALE
Lo stato di un individuo per quanto concerne
le sue capacità di adattarsi all’ambiente.
(Broom 1986)
…Un adattamento difficile o impossibile si associa,
invece, a dolore o ad altri tipi di sofferenza
INTRODUZIONE
• BENESSERE…
…importanza di ordine
• Etico
• Scientifico
• Sociale
• Politico
1
• …necessità di avere degli
strumenti per:
– Accertare obiettivamente le
condizioni di benessere
– e/o accertare eventuali
variazioni in relazione alle
dinamiche ambientali
Le osservazioni cliniche, etologiche e
zootecniche rappresentano il perno delle
attività di verifica del livello di benessere
animale.
Tali
osservazioni
possono
utilmente integrate da:
essere,
comunque,
esami ematologici (conta e formula leucocitaria),
esami di immunologia clinica (sieroproteine,
rapporto albumine/globuline, complemento, lisozima,
battericidia, aptoglobina, blastizzazione linfocitaria);
valutazione dello stress ossidativo.
2
STRESS
Turbe dell’omeostasi
metabolica
se non si risolve
se si risolve
Ripristino dell’omeostasi
Malattia
agenti stressanti
ipofisi
sistema nervoso
corteccia surrene
riserve corporee
cortisolo
immunodepressione
aumento attività metabolica
+ glucosio + NEFA +aminoacidi
catecolamine
animale vigile
>frequenza
cardiaca
e respiratoria
COME INTERFERISCE UNO
STRESS SUL SISTEMA
IMMUNITARIO?
I glucocorticoidi hanno numerosi effetti sul
sistema immunitario:
• diminuzione dei leucociti circolanti
• linfopenia e neutrofilia
• soppressione l’attività dei linfociti B e linfociti
T citotossici
• diminuzione della sintesi di alcune citochine
da parte dei macrofagi
3
NEL CASO DI SITUAZIONI
STRESSANTI CRONICHE???
IMMUNITÀ INNATA
• Prima linea di difesa dell’organismo
• Filogeneticamente più vecchia
dell’immunità acquisita
• È un sistema relativamente inflessibile
IMMUNITÀ INNATA
4
Mokoto Sakamoto Nutrition 1998
SISTEMA IMMUNITARIO
Funge da segnale di allarme, avvisando
compartimento
specifico
dell’immunità
che
necessaria una efficace risposte immunitaria
il
è
Le risposte innate generano molecole che, assieme
all’antigene, fungono da segnale per attivare i linfociti
TeB
Tra i due comparti si realizza un vero e proprio
dialogo
SISTEMA IMMUNITARIO
IMMUNITA’
INNATA
IMMUNITA’
ACQUISITA
5
IMMUNITA’ NATURALE
SCHEMA
DI
JANEWAY
RISPOSTA
IMMUNITARIA
IMMEDIATA
-
<
4
ORE
PRECOCE
TARDIVA
-
(4
-
96
ORE)
MEDIATA
DAL
SISTEMA
IMMUNITARIO
INNATO,
CHE
CONDIZIONA
L’INTERAZIONE
CON
I
PIÙ
COMUNI
PATOGENI
AMBIENTALI
-
(>96
ORE)
RISPOSTE
SPECIFICHE
(ANTICORPI,
LINFOCITI
T)
BARRIERE ESTERNE DELL’IMMUNITÀ INNATA
MECCANICHE
- CUTE, MUCOSE
- EPITELIO CILIATO, MUCO
FISIOLOGICHE O BIOCHIMICHE
- ACIDO LATTICO, ACIDI GRASSI, PELLE
- PEPSINA (STOMACO)
- LISOZIMA (SALIVA, SUDORE, LACRIME)
- pH ACIDO (STOMACO)
MICROBIOLOGICHE
- FLORA BATTERICA (INTESTINO)
6
BARRIERE INTERNE DELL’IMMUNITÀ INNATA
FISIOLOGICHE
- TEMPERATURA CORPOREA
- TENSIONE OSSIGENO
Fattori SOLUBILI
- COMPLEMENTO, LISOZIMA, INTERFERONE
- PROTEINE DI FASE ACUTA
- ANIONE SUPEROSSIDO
- PROTEINE LEGANTI IL FERRO
(LATTOFERRINA, TRANSFERRINA)
Fattori CELLULARI
- MONOCITI/MACROFAGI
- GRANULOCITI NEUTROFILI
- CELLULE NK
ATTUAZIONE RAPIDA
(DAI 4 MINUTI ALLE 4 ORE)
ATTUAZIONE MEDIA E LENTA
(DALLE 4 ORE AI 4 GIORNI)
7
CITOCHINE
• MOLECOLE CHE COSTITUISCONO IL
LINGUAGGIO DEL SISTEMA IMMUNITARIO
• MEDIATORI DELL’IMMUNITÀ INNATA
• MEDIATORI DELL’IMMUNITÀ SPECIFICA
• FATTORI DI CRESCITA DEL SISTEMA
EMOPOIETICO
CITOCHINE
• Le cellule del sistema immunitario, in risposta
a microrganismi, secernono alcune proteine
chiamate citochine che mediano molte
reazioni cellulari dell’immunità innata
• Nell’immunità naturale la principale sorgente
di citochine è rappresentata dai macrofagi
attivati dal riconoscimento di microbi.
CITOCHINE
• La maggior parte delle citochine agisce sulle
cellule che le hanno prodotte (azione
autocrina) o su cellule immediatamente
adiacenti (azione paracrina).
• Nelle reazioni immunitarie innate se viene
attivato un numero abbastanza elevato di
macrofagi le grandi quantità di citochine
prodotte possono
agire anche a distanza
della sede di secrezione (azione endocrina).
• Le citochine dell’immunità innata assolvono a
numerose funzioni nella difesa dell’ospite.
8
CITOCHINE
• TNF e IL- 1 sono le principali citochine coinvolte
nel reclutamento dei neutrofili e dei monociti
circolanti nei focolai di infezione.
• Le cellule NK producono IFN- γ con la funzione
di attivazione dei macrofagi.
• Dal momento che anche i linfociti T producono
IFN- γ, questa citochina può essere considerata
come appartenente ad entrambi i comparti
dell’immunità: sia quello innato che quello
acquisito.
Macrofago
attivato
TNF
IL-1
IL-15
IL-12
Effetti
locali
• Attivazione
endotelio
vasale
con
espressione
di
molecole
di
adesione
• Richiamo
di
neutrofili
e
monociti
Effetti
sistemici
• Az.
Pirogena
• Produz.
APP
• Cachessia
• Trombosi
vascolare
• Shock
Effetti
locali
• Attivazione
endotelio
vasale
con
espressione
di
molecole
di
adesione
• Attivazione
produzione
linfociti
B
Effetti
sistemici
• Az.
Pirogena
• Stim.
APP
• Cachessia
IL-6
Effetti
locali
• Stimola
crescita
linf.B
>
secrezione
anticorpi
Effetti
sistemici
• Az.
Pirogena
• Stimola
produzione
APP
Effetti
locali
Effetti
locali
• Attiva
NK
e
ne
>
attività
• Stimola
prod.
IF-
γ
da
NK
• Stimola
differenz.
linf.T
helper
in
cellule
TH1
• Stimola
proliferazione
NK
• Funge
da
fattore
di
crescita
linf.
APPROCCIO IMMUNOLOGICO
• E’ utile applicare in laboratorio esami di tipo
immunologico atti a definire l’ entità dello sforzo di
adattamento ambientale degli animali e le alterazioni
correlate a tale sforzo
• Sono test abbastanza “robusti”
• Non richiedono tempi prolungati di esecuzione
• Forniscono dati predittivi sulla possibile evoluzione di
condizioni di scarso benessere verso patologie
clinicamente conclamate
• Il campione prelevato può essere usato per altri esami
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DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’
BATTERICIDA
DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’
BATTERICIDA
• L’inibizione della crescita del
E.coli viene valutata come
variazioni di D.O. Si
effettua la lettura con
spettrofotometro a λ di 690nm.
• Il risultato viene espresso come valore
percentuale di capacità battericidica del siero
in esame.
• La sua concentrazione viene espressa in %.
SISTEMA COMPLEMENTO
• Il termine complemento definisce una famiglia di
proteine e frammenti proteolitici che svolgono
molteplici funzioni nell’immunità naturale ed
acquisita. Tali funzioni comprendono:
• distruzione diretta di cellule
• regolazione di differenti meccanismi effettori della
risposta immunitaria
• capacità di modulare ogni fase della risposta
immunitaria
:
dal
riconoscimento
iniziale
dell’antigene fino alla sua eliminazione.
10
SISTEMA COMPLEMENTO
Gli stimoli principali che lo attivano sono
• I complessi antigene-anticorpo
• Le superfici biologiche dotate di forti cariche
ioniche come la membrana più esterna dei
batteri Gram- e la parete cellulare dei batteri
Gram+ e dei funghi
• I carboidrati con elevato contenuto di
mannosio che sono diversi da quelli prodotti
dalla maggior parte dei mammiferi
SISTEMA COMPLEMENTO
SISTEMA COMPLEMENTO
Nella difesa dell’ospite il sistema del complemento
assolve a tre funzioni
Infine
si
ha
la
formazione
La
frazione
C3b
riveste
i
di
un
complesso
proteico
microbi
favorendo
un
loro
che
si
inserisce
sulla
legame
con
i
fagociti
grazie
ai
membrana
della
cellula
recettori
per
C3b
espressi
microbica
sulla
membrana
di
quest’ultimi
Alcuni
prodotti
di
degradazione
del
complemento
svolgono
un’
azione
chemotattica
su
neutrofili
e
monociti
favorendo
l’istaurarsi
di
un
processo
flogistico
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SISTEMA COMPLEMENTO
Polimerizzazione
struttura tubulare
penetrazione membrana
poro
lisi della cellula
ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO
PER VIA ALTERNATIVA
ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO
PER VIA ALTERNATIVA
• La capacità della cascata complementare di
essere attivata in assenza di anticorpi è
imputabile alla instabilità intrinseca della
componente complementare C3.
• Il C3 in fase fluida presenta una lenta ma
continua attivazione spontanea .
• Se tale attivazione del C3 avviene in
prossimità di una appropriata superficie
(come una membrana biologica) il frammento
può legarsi covalentemente ad essa.
12
ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO
PER VIA ALTERNATIVA
VIA MB-LECTIN (MANNANBINDING LECTIN)
TITOLAZIONE DEL
COMPLEMENTO EMOLITICO
• Fornisce indicazioni sui meccanismi di difesa
immunitaria
dell’animale
e
sulle
sua
competenza nei confronti dei patogeni
ambientali
• L’evidenziazione
di
bassi
livelli
di
complemento indica un avvenuto consumo in
vivo in seguito a stati flogistici e quindi un
notevole
coinvolgimento
del
sistema
immunitario aspecifico con il rischio di
insorgenza di patologie condizionate.
13
CH50 ASSAY
PATIENT'S
SERUM (w/ C’)
MAC
CYTOLYSIS
LISOZIMA
Il lisozima, noto anche come muramidasi, è un
potente enzima antibatterico in grado di svolgere
un’azione sinergica con la risposta immunitaria
umorale e con i fattori del complemento
La muramidasi presenta la capacità di attaccare e
demolire i polisaccaridi azotati (peptidoglicano)
che costituiscono gli strati periferici delle
strutture cellulari di vari germi
LISOZIMA
14
LISOZIMA
La concentrazione del lisozima nel
siero viene mantenuta principalmente
dai neutrofili in degenerazione.
La sua determinazione ci permette di conoscere
l ’attività dei granulociti e lo stato di funzionalità del
sistema monocitario/macrofagico, indicandoci la
presenza di stati infiammatori.
LISOZIMA
I campioni di siero vengono posti a contatto con
una sospensione di Micrococcus lysodeikticus,
incorporato in un gel di agar .
LISOZIMA
La sua concentrazione viene espressa in µg/ml
15
PROTEINE DI FASE ACUTA
PROTEINE DI FASE ACUTA
POSITIVE
NEGATIVE
NEG: Decrease in concentration (10–30%);
0: No change; I: 50% to 100% increase; II:
Between 100% and 10 times increase; III: More than 10 times increase.
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PROTEINE DI FASE ACUTA
PROTEINE DI FASE ACUTA
L’
Hp essenzialmente previene la perdita di Fe legandosi
all’Hg libera e dando origine a complessi molto stabili.
Ha
anche un effetto batteriostatico, sottraendo ai batteri
la biodisponibilità del Fe, necessario alla loro creescita
Nei
bovini sembra avere un ruolo di regolazione del
metabolismo lipidico (Nakajiuna et al., 1997) ed agire da
immunomodulatore (Ohtsuka et al., 2001).
PROTEINE DI FASE ACUTA
17
PROTEINE DI FASE ACUTA
Per SAA, nel bovino, sono state individuate due
isoforme.
Non si conosce esattamente il suo ruolo anche
se ne sono stati ipotizzati diversi
PROTEINE DI FASE ACUTA
PROTEINE DI FASE ACUTA
18
PROTEINE DI FASE ACUTA
STRESS OSSIDATIVO
19
STRESS OSSIDATIVO
STRESS OSSIDATIVO
Quando la produzione di ROS, invece, non viene
controbilanciata dai sistemi antiossidanti:
STRESS OSSIDATIVO
• Fenomeni infiammatori con rilascio di ROS da
parte dei leucociti
• Malattie metaboliche/circolatorie (ischemie)
che comportano danno tissutale
• Per azione di metalli pesanti:Fe!!
• Trattamenti con farmaci anabolizzanti con
aumentato consumo di ossigeno
• Alimentazione con presenza di fattori proossidanti (micotossine)
• Per azione dell’ossido nitrico (NO)
20
21
n.s.
Valori di riferimento: 7,9 ds 3,1 ng/ml
n.s.
P< 0,0001
73
78
%
%
P< 0,005
44
27
1,25 0,39
CH50
%
μg/ml
Moscati & Beghelli, 2008
Valori di riferimento: 1 – 3 µg/ml; battericidia:>90%; complemento:> 30
CH50
P< 0,0005
225
3,4
P< 0,05
372
2,7
Beghelli & Moscati, 2008
Valori di riferimento: PAO 250 ± 50 µM CLO neutralizzate
ROM’s 0.6 ± 0.2milliMoli H2O2
22
• L’utilizzo routinario
dei parametri di immunità
aspecifica può dare utili indicazioni della capacità
adattativa all’ambiente.
• Questa capacità potrebbe essere influenzata anche
dalla genetica, lo studio approfondito delle variazioni
nelle diverse condizioni ambientali potrebbe indicare
quali razze possono facilmente essere adibite a diverse
tipologie di allevamento.
Nelle razze di interesse zootecnico l’utilizzo dei test atti
a valutare lo
stress ossidativo ed i parametri di immunità aspecifica
sono strumenti da utilizzare per una diagnosi di
popolazione, al fine di individuare una causa
collettiva in grado di influenzare lo
stato sanitario e di benessere/malessere degli
allevamenti.
23
Grazie per l’attenzione
!!!!!
24
