Caratterizzazione del virus dell`Influenza Equina A H3N8 isolato in

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Caratterizzazione del virus dell’Influenza
Equina A H3N8 isolato in Egitto nel 2008
Characterization of Equine Influenza A
virus H3N8 isolated in Egypt in 2008
Magda A. Kalad1, Eman M. Ebied1, Nashwa K. Madkour1, Safaa A. Warda1, Nehal S. Saleh1,
El-Kabbany M.M.A.1, Soliman I.M.A.1, Magdi D. Saad2, Deidra Shuck-Lee2, Mary A. Younan2,
Emad M. Elassal2, Jeffrey A. Tjaden2
1
2
Veterinary Serum and Vaccines Research Institute (VSVRI), Cairo, Egypt
U.S. Naval Medical Research Unit No. 3 (NAMRU-3), Cairo, Egypt
RIASSUNTO
L’influenza equina è una delle malattie economicamente più importanti nei Paesi in cui l’industria del cavallo da riproduzione e da corsa svolge un ruolo sostanziale. In Egitto, il virus dell’influenza equina di tipo 2 (H3N8) è stato isolato negli anni
1989 e 2000. Nel luglio del 2008 si è verificata un’epizoozia da virus dell’influenza equina che ha interessato almeno tre governatorati (Il Cairo, Alessandria e Giza). Questo lavoro descrive la caratterizzazione antigenica e genetica del virus individuato in questo episodio.
Dai cavalli con manifestazioni respiratorie presenti nei governatorati del Cairo, di Alessandria e di Giza vennero prelevati
trenta tamponi nasali. Vennero quindi effettuate le prove di isolamento del virus su uova di pollo embrionate (ECE, embryonated chichen eggs) SPF (Specific Pathogen Free). I virus isolati sono stati caratterizzati antigenicamente e geneticamente utilizzando le tecniche di HI (inibizione dell’emoagglutinazione), PCR (reazione a catena della polimerasi) e di sequenziamento dell’RNA.
In 25 dei 30 campioni prelevati venne individuato il virus dell’influenza A. In 14 casi si ottenne la conferma mediante PCR e
sequenziamento. La determinazione delle sequenze dei geni per l’emoagglutinina e la neuraminidasi dai singoli virus dimostrò un’identità nucleotidica del 98% con il virus dell’influenza equina A (H3N8) isolato nel 2007 nella città di Kanazawa
(Giappone) e negli USA. In conclusione, il virus dell’influenza equina A sottotipo H3N8 è stato l’agente eziologico dell’epizoozia verificatasi in Egitto nel luglio del 2008.
SUMMARY
Equine influenza is one of the most economically important diseases of equine in countries with substantial breeding and racing industries. In Egypt, Equine influenza type 2 (H3N8) was isolated in 1989 and 2000. In July 2008, an outbreak of equine influenza
virus occurred in Egypt in at least three governorates; Cairo, Alexandria and Giza. This work describes the antigenic and genetic characterization of the virus recovered from this outbreak.
Thirty nasal swabs were collected from horses suffering from respiratory manifestation in Cairo, Alexandria and Giza governorates.
Virus isolation attempts were performed in SPF embryonated chicken eggs (ECE).Virus isolates were antigenically and genetically characterized using HI, PCR and sequencing.
Influenza A virus was recovered from 25 of the 30 samples collected. Fourteen were confirmed by reverse transcriptase PCR and sequencing. Haemagglutinin and neuraminidase genes sequencing from selected isolates showed 98% nucleotide identity with Equine
influenza A (H3N8) virus from Kanazawa, Japan and USA in 2007. In conclusion, Equine influenza A virus subtype H3N8 was the
cause of outbreak occurred in Egypt in July 2008.
“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 26/04/2011 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 04/10/2011”.
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INTRODUZIONE
INTRODUCTION
Da un centinaio di anni, il Medio Oriente alleva e
seleziona una razza pura di cavalli Arabi. L’Egitto
era considerato un mercato industriale per il
commercio e l’esportazione della razza verso
molti Paesi del mondo. È infatti situato nel crocevia di molte attività commerciali ed ha i confini
aperti verso numerosi Stati dell’Africa e dell’Asia.
Proteggere gli allevamenti dalle malattie esotiche
richiede grandi sforzi e un’imponente organizzazione fra le differenti amministrazioni.
L’influenza equina (EI) viene considerata una delle
più importanti malattie respiratorie nei Paesi in cui
l’industria del cavallo da riproduzione e da corsa
rappresenta una delle principali attività economiche.
I virus dell’influenza A (famiglia Orthomyxoviridae) sono noti come causa di malattia respiratoria
acuta nell’uomo, nel cavallo, nel suino e negli uccelli (Webster et al., 1992). Il virus EI presenta due
sottotipi distinti: H7N7 (Sovinova et al., 1958) and
H3N8 (Wadell et al., 1963). Generalmente si ritiene che il primo non causi epizoozie quanto il secondo, tanto che potrebbe essere estinto dato
che l’ultima epizoozia confermata sostenuta da
questo virus risale al 1978 (Webster,1993; VanMaanen e A. Cullinane, 2002). Invece, le epizoozie
provocate da H3N8 si verificano ogni anno. Uno
studio condotto in Colorado nel 1998 ha dimostrato che l’agente patogeno era responsabile di
due terzi delle infezioni virali respiratorie degli
equini (Mumford et al.,1998).
Tutte le principali epizoozie degli ultimi 20 anni
sono state dovute a virus dell’influenza A del sottotipo H3N8, che sembra essere di origine aviare
(Janet et al., 2004). Malgrado i programmi di vaccinazione intensiva, l’infezione da H3N8 è rimasta
un grave problema sanitario ed economico in tutto il mondo. Alla fine degli anni 1980, venne registrata una grave epizoozia di EI nei cavalli in Sud
Africa, in India e nella Repubblica popolare cinese,
dove l’esistenza dei virus dell’influenza equina A
non era neppure nota.
Recentemente, in Egitto, nel 1989, è stata registrata un’epizoozia di EI H3N8 (Ismail et al., 1990;
Esmat et al., 1992). Un’altra epizoozia, causata dallo stesso sottotipo virale, era stata riscontrata nel
1999-2000 (Hamoda et al., 2001; Nahwa, 2004).
Nel giugno 2008 si osservarono dei casi di malattia caratterizzati da manifestazioni respiratorie
nella popolazione equina di Alessandria, del Cairo
e di Giza. I principali segni clinici osservati erano
rappresentati da tosse frequente, aspra e secca,
spesso accompagnata da febbre elevata. Dai casi
sospetti furono prelevati dei tamponi nasali che
vennero conservati a -80°C fino all’impiego per
l’isolamento e l’identificazione del virus.
Nell’ambito di questo studio, gli autori hanno cercato di isolare e caratterizzare l’agente eziologico
responsabile di questa epizoozia.
Since a century, the Middle East keeps a pure breed
of Arabian horses. Egypt was considered as an industrial market for trade and export of the breed to many
countries. Egypt is located at the cross road of many
trades with open borders with different countries in
Africa and Asia. Protecting live stock from exotic diseases takes a lot of effort and organization between
different administrations.
Equine influenza (EI) is considered to be one of the
most important respiratory diseases in equine in countries where the breeding and racing of horses is a major industry.
Influenza A viruses (family orthomyxoviridae) are
known to cause acute respiratory disease in human,
horses, pigs and birds (Webster et al., 1992). EI virus
has 2 distinct subtypes: H7N7 (Sovinova et al., 1958)
and H3N8 (Wadell et al., 1963). It is generally accepted that the former does not cause outbreaks as much
as the latter, since may be extinct the last confirmed
outbreak caused by this virus was in 1978 (Webster,1993; VanMaanen and A. Cullinane, 2002), However, outbreaks by H3N8 occur annually. A study conducted in Colorado in 1998 showed that the pathogen
was responsible for two thirds of equine viral respiratory infection (Mumford et al., 1998).
All major equine outbreaks in the past 20 years were
due to Influenza A viruses of the H3N8 subtype which
appears to be of avian origin (Janet et al., 2004). Despite intensive vaccination programs, EI H3N8 infection has remained a serious health and economic
problem throughout the world. In the late 1980s, severe widespread EI outbreaks were recorded in horses in South Africa, India and the People’s Republic of
China where equine influenza A viruses were not
known to exist.
Recently in Egypt, in 1989, an outbreak of EI H3N8
was recorded (Ismail et al.,1990; Esmat et al., 1992).
Another outbreak, caused by the same subtype, was
recorded in 1999-2000 (Hamoda et al., 2001; Nahwa, 2004).
In June, 2008, cases with respiratory manifestations
were observed among equine population in Alexandria,
Cairo and Giza. The most prominent clinical signs observed were: frequent harsh dry coughing often accompanied with high fever. Nasal swab samples were collected from the suspected cases and stored at -80oC
until processed for virus isolation and identification.
In this study we attempted to isolate and characterize
the causative agent responsible for this outbreak.
Caratterizzazione del virus dell’Influenza Equina A H3N8 isolato in Egitto nel 2008
MATERIALS & METHODS
Samples
A total of 30 nasal swab samples were collected on
viral transfer media by the General Organization for
Veterinary Services (GOVS) of Egypt. Samples were
collected from horses of different ages and breeds
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MATERIALI E METODI
Campioni
Attraverso l’Organizzazione Generale dei Servizi
Veterinari (GOVS, General Organization for Veterinary Services) dell’Egitto sono stati raccolti in totale
30 tamponi nasali, inseriti in appositi terreni per il
trasporto dei virus. I campioni sono stati prelevati da cavalli di età e razza differenti (12 dal governatorato di Alessandria, 12 da quello del Cairo e 6
da quello di Giza) (Figura 1, mappa dell’Egitto) e
poi inviati all’Equine Diseases Research Department
at the Veterinary Serum and Vaccine Research Institute (VSVRI) del Cairo, in Egitto, per l’isolamento e
l’identificazione del virus.
(12 from Alexandria, 12 from Cairo and 6 from Giza
governorates) (Figure 1, Map of Egypt). Samples
were sent to the Equine Diseases Research Department at the Veterinary Serum and Vaccine Research
Institute (VSVRI), Cairo, Egypt for virus isolation and
identification.
Isolamento del virus
Nella cavità amnio-allantoidea di uova di pollo embrionate (ECE) di 9-11 giorni di età ed indenni da
agenti patogeni specifici (SPF, Specific pathogen free)
venne inoculato un volume di 0,2 ml di ciascun
campione clinico. Le ECE vennero incubate a 3435°C per tre giorni e poi conservate a 4°C per 24
ore prima di essere sottoposte al prelievo del liquido amnio-allantoideo. Si determinò quindi l’attività
emoagglutininica nel liquido purificato, impiegando
il test di emoagglutinazione (HA) (Palmer et al.,
1975; OIE, 2004). I liquidi prelevati dalle uova che
presentavano un’attività HA < 1/16 o non mostravano alcuna prova della presenza del virus dell’EI
vennero reinoculati sino ad un massimo di altre tre
volte in ECE SPF e poi riesaminati. Il liquido prelevato dalle uova con un titolo di HA ≥ 1/16 venne
sottoposto ad identificazione mediante test di inibizione dell’emoagglutinazione (HI) utilizzando antisieri sottotipo-specifici (Swenson, 1992; OIE, 2004).
Identificazione degli agenti virali
isolati: test di emoagglutinazione
(HA) e inibizione
dell’emoagglutinazione (HI)
I test HA ed HI utilizzati per l’identificazione dell’agente virale isolato (liquidi delle uova al secondo
ed al terzo passaggio) vennero effettuati utilizzando
una sospensione di eritrociti di pollo all’1% ed antisieri di riferimento attivi sia contro il sierotipo
(A/equi-1) che quello (A/equi-2). Vennero utilizzati
antisieri di riferimento provenienti dal National Veterinary Services Laboratories, USA Department of Agriculture veterinary services (NVSL., USDA) (OIE, 2004).
PCR e sequenziamento
L’RNA del virus venne estratto dagli isolati virali
raccolti utilizzando il Qiagen viral RNA mini kit (Qiagen Inc., CA, USA) seguendo le istruzioni della casa
produttrice. L’RNA è stato esaminato utilizzando
una tecnica di PCR in tempo reale specifica per la
matrice genica dei virus dell’influenza A, secondo le
indicazioni di (Spackman et al., 2002). L’RNA degli
isolati risultati positivi per la matrice genica è stato
FIGURA 1 - Mappa dell’Egitto che mostra i governatorati in cui si sono verificate
le epizoozie di EI nel 2008.
FIGURE 1 - Map of Egypt showing governorates where EI outbreak occurred in 2008.
Virus isolation
A volume of 0.2 ml from each clinical sample was inoculated into amnio-allantoic cavity of a 9-11 day old
Specific pathogen free (SPF) Embryonated chicken
eggs (ECE). ECE were incubated at 34- 35oC for three
days and then stored at 4oC overnight before amnioallantoic fluid was harvested. HA activity in the clarified fluid was determined using haemagglutination
test (HA) (Palmer et al., 1975,OIE., 2004). Harvested
egg fluids which had either HA activity < 1/16 or lacking evidence of EI virus were re-inoculated up to 3
more times in SPF ECE and evaluated. Harvested egg
fluid with HA titer ≥ 1/16 were identified by haemagglutination inhibition (HI) test using subtype specific
antisera (Swenson, 1992; OIE, 2004).
Identification of the isolated viral
agents: Haemagglutination (HA)
& Haemagglutination inhibition
(HI) test
HA and HI tests used for identification of the isolated
viral agent (Egg fluids of the 2nd and 3rd passages)
were performed using 1% chicken RBCs suspension
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impiegato per la trascrizione inversa dei segmenti
del virus dell’influenza A utilizzando il primer universale “Uni-12” secondo le indicazioni di Hoffman et
al., 2001. Il cDNA ottenuto da quest’ultimo passaggio venne impiegato per l’amplificazione dei geni per
la codifica dell’emoagglutinina e della neuraminidasi,
mediante l’uso dei set di primer universali sviluppati
da Hoffman et al., 2001. I prodotti dell’amplificazione dei geni della HA e della NA vennero sequenziati utilizzando il BigDye terminator kit versione 3.1 della Applied Biosystems, CA, USA, seguendo le istruzioni della casa produttrice e i dati vennero letti mediante ABI3130xl Genetic Analyzer.
Analisi della sequenza genica
Le sequenze dei geni per l’emoagglutinina (HA) e la
neuroaminidasi (NA) sono state editate impiegando il Sequencher software (Gene Codes, Inc., USA) e
confrontati con le sequenze strettamente correlate
disponibili presso la GenBank, utilizzando il BioEdit
software, versione 7.0.9. (Hall T.A., 1999). L’analisi
delle evoluzioni delle sequenze sia dal punto di vista filogenetico che molecolare venne condotta utilizzando il MEGA versione 5 (Tamura, Peterson,
Stecher, Nei, Kumar 2011). I modelli evolutivi più
adatti a ciascun set di dati (sia per l’HA che per la
NA) vennero stimati utilizzando la funzione di test
del modello di MEGA5 seguendo i criteri di default
del software. Vennero ricostruiti gli alberi di massima probabilità per ciascun allineamento di sequenza di HA ed NA utilizzando il modello evolutivo più
adatto stabilito nel corso del passaggio precedente.
Le sequenze geniche per HA ed NA sono state inviate alla GenBank utilizzando, rispettivamente, i numeri di accesso FJ209731 ed CY087167.
RISULTATI E DISCUSSIONE
L’insorgenza improvvisa e la rapida diffusione in tutte le categorie di età osservata attraverso la comparsa di tosse frequente e aumento della temperatura corporea portarono alla formulazione di un sospetto diagnostico di influenza equina, che è considerata la più importante malattia respiratoria contagiosa degli equini a carattere transitorio (Wilson,
1993; Daly et al., 2006). L’introduzione di un singolo
cavallo infetto da EI può determinare una diffusione
esplosiva del virus fra gli equini non protetti su
un’ampia area geografica; ciò deve imporre la cancellazione delle competizioni dei cavalli da corsa per
5 mesi, l’interruzione dei programmi di allenamento
ed occasionalmente la cancellazione di un torneo,
con conseguenti perdite economiche (Newton e
Mumford, 1995; Guthrie et al., 1999; OIE, 2004).
Dal 1978, i virus dell’influenza equina A H7N7 non
hanno più provocato epizoozie note e non sono
più considerati una causa importante di malattia
respiratoria nei cavalli (Webster, 1993; Van Maanen e A. Cullinane 2002, OIE, 2004).
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Caratterizzazione del virus dell’Influenza Equina A H3N8 isolato in Egitto nel 2008
and reference antisera against both (A/equi-1) and
(A/equi-2). Reference antisera obtained from National
Veterinary Services Laboratories, USA Department of
Agriculture veterinary services (NVSL., USDA) were
used (OIE, 2004).
PCR and sequencing
Viral RNA was extracted from harvested virus isolates
using Qiagen viral RNA mini kit (Qiagen Inc., CA,
USA) according to manufacturer’s instructions. RNA
was tested using real time PCR assay specific for the
matrix gene of influenza A viruses according to (Spackman et al., 2002). RNA from isolates that were
positive for the matrix gene were used for reverse
transcription of influenza A virus segments using “Uni-12” universal primer according to Hoffman et al.,
2001. cDNA from the latter step was used for amplification of the haemagglutinin and neuraminidase
genes using the universal primer sets developed by
Hoffman et al., 2001. Amplified products of HA and
NA genes were sequenced using the BigDye terminator kit version 3.1 from Applied Biosystems, CA, USA,
according to manufacturer instructions on the
ABI3130xl Genetic Analyzer.
Sequence analysis
Sequences of haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes were edited using the Sequencher software (Gene Codes, Inc., USA) and
aligned with closely related sequences available in
GenBank using the BioEdit software version 7.0.9.
(Hall, T.A. 1999). Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version
5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, Kumar 2011). Evolutionary model best fit for each data set (HA or NA)
was estimated using the model test function in
MEGA5 following the software default criteria. Maximum likelihood trees were reconstructed for each of
HA and NA sequence alignment using the best fit evolutionary model from the previous step.
HA and NA sequences were submitted to GenBank
under accession numbers: FJ209731 and CY087167
respectively.
RESULTS AND DISCUSSION
The sudden onset, rapid spread of infection in all age
categories observed through frequent coughing and elevated body temperatures led to a tentative clinical diagnosis of Equine influenza, which is considered to be
the most important transient, contagious, respiratory
disease of horses (Wilson, 1993; Daly et al., 2006). Introduction of a single infected horse with EI can result
in explosive virus spread in unprotected horses over a
wide geographical area; this would necessitate cancellation of racing competitions for 5 months, interruption in training programs and occasional tournament
disruption leading to economic losses (Newton and
Mumford, 1995; Guthrie et al., 1999; OIE, 2004).
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In Egitto, nell’ottobre del 1989 e all’inizio del 2000
vennero rilevate due epizoozie di influenza nella popolazione equina; nella prima furono individuati i
sottotipi 1 e 2, mentre nella seconda fu riscontrato
soltanto il sottotipo 2. Nel giugno 2008, nella popolazione equina dei governatorati di Alessandria, del
Cairo e di Giza si osservarono dei casi di manifestazioni respiratorie simili a quelle descritte nelle epizoozie precedenti (Figura 1). Gli accertamenti clinici seguiti dai tentativi di isolare il virus dai campioni
prelevati dagli animali colpiti permisero di identificare l’EI come agente eziologico di questa epizoozia.
Il virus dell’influenza A sottotipo H3N8 venne isolato da 25 tamponi nasali su 30 (83,3%). Questa è
Since 1978, equine influenza A H7N7 viruses have
not caused any known outbreaks, and are no longer
considered an important cause of respiratory disease
in horses (Webster, 1993; Van Maanen and A. Cullinane 2002; OIE, 2004).
In Egypt, two outbreaks of equine influenza among equine populations were recorded in October (1989)
and in the beginning of (2000), both subtypes 1 and
2 were detected in the first outbreak and only type 2
in the second.
In June (2008), cases of respiratory manifestation
were observed among equine population in Alexandria, Cairo and Giza governorates similar to those observed in the previous outbreaks (Figure 1).
TABELLA 1
Passaggi e titoli di HA in uova di pollo embrionate (ECE) inseminate con tamponi nasali equini
Località
Cairo
Alessandria
Giza
Numero
di serie dei
tamponi
nasali
Passaggi
1° passaggio
2° passaggio
3° passaggio
+ve/T
+ve/T
range del
titolo HA
+ve/T
range del
titolo HA
+ve/T
range del
titolo HA
1
3/5
* * 8-16
5/5
8-128
* ND
ND
2
2/5
2
5/5
32
ND
ND
3
3/5
8-16
4/5
16-32
ND
ND
4
0/5
-ve
4/5
8-128
ND
ND
5
0/5
-ve
4/5
4-16
ND
ND
6
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
7
3/5
8-16
5/5
32-64
ND
ND
8
0/5
-ve
4/5
32-128
ND
ND
9
0/5
-ve
4/5
4-16
ND
ND
10
0/5
-ve
4/5
64
ND
ND
11
1/5
2
3/5
32
ND
ND
12
2/5
4
4/5
8-16
ND
ND
1
1/5
2
0/5
16
ND
ND
2
2/5
2
5/5
32-128
ND
ND
3
2/5
2
5/5
32-64
ND
ND
4
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
5
0/5
-ve
2/5
8
4/5
16
6
0/5
-ve
2/5
8
4/5
16
7
0/5
-ve
5/5
128-256
ND
ND
8
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
9
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
10
0/5
-ve
5/5
128-256
ND
ND
11
2/5
4-8
4/5
64- 128
ND
ND
12
1/5
4
3/5
16-32
ND
ND
1
2/5
2-8
5/5
32-128
ND
ND
2
0/5
-ve
2/5
8-16
ND
ND
3
0/5
-ve
3/5
8-16
ND
ND
4
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
5
2/5
-ve
2/5
8-16
ND
ND
6
1/5
4
2/5
8-16
ND
ND
+ve/T = Positivi / Uova totali - * ND = Non effettuato
-ve = negativi - ** Il titolo HA è espresso come reciproco della diluizione virale
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TABLE 1
Passage level and HA titers of equine nasal swabs in Embryonated Chicken Egg (ECE)
Locality
Cairo
Alex
Giza
Serial
number
of nasal
swabs
Passages
st
nd
1 passage
3rd passage
2 passage
+ve/T
+ve/T
HA titer
range
+ve/T
HA titer
range
+ve/T
HA titer
range
1
3/5
* * 8-16
5/5
8-128
* ND
ND
2
2/5
2
5/5
32
ND
ND
3
3/5
8-16
4/5
16-32
ND
ND
4
0/5
-ve
4/5
8-128
ND
ND
5
0/5
-ve
4/5
4-16
ND
ND
6
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
7
3/5
8-16
5/5
32-64
ND
ND
8
0/5
-ve
4/5
32-128
ND
ND
9
0/5
-ve
4/5
4-16
ND
ND
10
0/5
-ve
4/5
64
ND
ND
11
1/5
2
3/5
32
ND
ND
12
2/5
4
4/5
8-16
ND
ND
1
1/5
2
0/5
16
ND
ND
2
2/5
2
5/5
32-128
ND
ND
3
2/5
2
5/5
32-64
ND
ND
4
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
5
0/5
-ve
2/5
8
4/5
16
6
0/5
-ve
2/5
8
4/5
16
7
0/5
-ve
5/5
128-256
ND
ND
8
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
9
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
10
0/5
-ve
5/5
128-256
ND
ND
11
2/5
4-8
4/5
64- 128
ND
ND
12
1/5
4
3/5
16-32
ND
ND
1
2/5
2-8
5/5
32-128
ND
ND
2
0/5
-ve
2/5
8-16
ND
ND
3
0/5
-ve
3/5
8-16
ND
ND
4
0/5
-ve
0/5
-ve
0/5
-ve
5
2/5
-ve
2/5
8-16
ND
ND
6
1/5
4
2/5
8-16
ND
ND
+ve/T = Positive / Total eggs - * ND = Not Done
-ve = negative - * * HA titer expressed as the reciprocal of the virus dilution
una percentuale proporzionalmente elevata; per
esempio, Marley et al.,1995 riferirono soltanto
una positività del 7% di isolamento del virus da
estratti di tamponi nasali prelevati da cavalli con
malattia respiratoria acuta nel corso di epizoozie
di influenza. Per quanto concerne l’indagine virologica sull’attività emoagglutininica suscitata dai
tamponi nasali nelle ECE, la Tabella 1 evidenzia che
25 isolati su 30 al primo passaggio (13 isolati, 6 da
cavalli provenienti dal Cairo, 5 da Alessandria e 2
da Giza) e 12 isolati al secondo passaggio (5 dal
Cairo, 4 da Alessandria e 3 da Giza) hanno fatto
riscontrare titoli compresi, rispettivamente, tra 216 e 8-256.
40
Caratterizzazione del virus dell’Influenza Equina A H3N8 isolato in Egitto nel 2008
Clinical investigations followed by virus isolation attempts from samples collected from affected horses
were successful in identifying EI as the causative agent
for this outbreak.
Influenza A, H3N8 subtype virus was isolated from 25
of 30 (83.3%) nasal swabs. This is a comparatively
high percentage, for example Marley et al., 1995 reported 7% positive virus isolation from nasal swabs
extracts obtained from horses with acute respiratory
disease during influenza epidemics. With regard to virological investigation of nasal swabs yielding haemagglutinating activity in ECE; Table 1 shows that 25 of
30 isolates from the first passage (13 isolates; 6 from
Cairo, 5 from Alex and 2 from Giza) and 12 isolates
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❚ Malattie infettive
TABELLA 2
Identificazione sierologica degli agenti virali isolati
utilizzando il test HI
Località
Cairo
Aless.
Giza
Numero del
campione
**Titolo *Titolo HI degli antisieri antiHA
A/equi-1
A/equi-2
TABLE 2
Serological identification of the isolated viral agents
using HI test
Locality
Sample
number
**HA
titer
*HI titer of Antisera against
A/equi-1
A/equi-2
1
128
-ve
320
1
128
-ve
320
2
32
-ve
160
2
32
-ve
160
3
32
-ve
160
3
32
-ve
160
4
128
-ve
320
4
128
-ve
320
5
16
-ve
160
5
16
-ve
160
7
64
-ve
160
8
128
-ve
320
Cairo
7
64
-ve
160
8
128
-ve
320
9
16
-ve
160
9
16
-ve
160
10
64
-ve
160
10
64
-ve
160
11
32
-ve
320
11
32
-ve
320
12
16
-ve
160
12
16
-ve
160
1
16
-ve
160
1
16
-ve
160
2
128
-ve
320
2
128
-ve
320
3
64
-ve
320
3
64
-ve
320
5
64
-ve
160
5
64
-ve
160
6
128
-ve
160
6
128
-ve
160
7
256
-ve
320
7
256
-ve
320
10
256
-ve
320
10
256
-ve
320
11
128
-ve
320
11
128
-ve
320
12
32
-ve
160
12
32
-ve
160
1
128
-ve
320
1
128
-ve
320
2
16
-ve
160
2
16
-ve
160
3
16
-ve
160
3
16
-ve
160
5
16
-ve
160
5
16
-ve
160
6
16
-ve
160
6
16
-ve
160
*Il titolo anticorpale HI è espresso come reciproco della diluizione sierica.
**Il titolo HA è espresso come reciproco della diluizione virale.
La propagazione del terzo passaggio solitamente
effettuata in questi isolati dimostra la mancanza o
i bassi livelli dei titoli HA nei passaggi precedenti.
Quindi, i due isolati che mostrano un basso titolo
HA (1/8) nel secondo passaggio presentano un incremento dello stesso titolo (1/16) al terzo passaggio e successivamente esposti alla caratterizzazione HI. Questi risultati sono in accordo con
quelli ottenuti da OIE, 2008, in cui l’isolato può essere caratterizzato immediatamente se il titolo
HA è di 1/16 o più.
I 5 isolati che mostrano titoli HA negativi nel secondo passaggio sono rimasti negativi anche nel terzo.
Il test HI è stato utilizzato per identificare i sottotipi impiegando antisieri specifici per i sottotipi di
riferimento contro A/equi-1/Praga/56 e A/equi2/Miami/63. Come riportato nella Tabella 2, contro
quest’ultimo sono stati rilevati titoli significativi
(160-230), mentre i risultati con il primo antisiero
sono stati negativi. Un virus isolato nel 2008 in
Egitto e chiamato A/equi-2/Alex-1/08 venne ulte-
Alex
Giza
*HI antibody titer expressed as the reciprocal of serum dilution.
**HA titer expressed as the reciprocal of the virus dilution.
from the second passage (5 from Cairo, 4 form Alex
and 3 from Giza) had titers ranging between 2-16
and 8-256 respectively.
The propagation of the 3rd passage usually done on
those isolates showing lack or low in HA titer in the
previous passages.
So, the two isolates which show low HA titer (1/8) in
the 2nd passage, show on increase in HA titer (1/16)
in the 3rd passage and consequently exposed to HI
characterization, these results are in Parallel with
that obtained by OIE, 2008, where the isolate can be
characterized immediately if the HA titer is 1/16 or
more.
The 5 isolates which show negative HA titer in 2nd
passage persist for the negativity in the 3rd one.
HI test was used to identify the subtype using reference subtype specific antisera against A/equi-1/
Prague/56 and A/equi-2/Miami/63. Significant titer
(160-320) against the latter was detected as shown
in Table 2, while results with the former antisera were
negative.
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❚ Malattie infettive
FIGURA 2 - Relazione filogenetica fra il gene HA del virus dell’EI dell’Egitto nel 2008 e i virus EI H3N8. La storia evolutiva è stata dedotta utilizzando il metodo della Massima Probabilità basato sul modello di Hasegawa-Kishino-Yano [1]. Viene
mostrato l’albero con la massima probabilità logaritmica (-4754,9425). La percentuale di alberi in cui i taxa associati si raggruppano insieme è mostrata vicino ai rami. Gli alberi iniziali per la ricerca euristica sono stati ottenuti automaticamente
nel modo seguente. Quando il numero dei siti comuni era < 100 o inferiore ad un quarto del numero totale dei siti, è stato usato il metodo della massima parsimonia; altrimenti, è stato impiegato il metodo BIONJ con distanza MCL. Per tracciare un modello delle differenze della frequenza evolutiva fra i siti è stata utilizzata una distribuzione discreta (5 categorie
[+G, parametro = 0,7545]). L’albero è disegnato in scala, con le lunghezze dei rami misurate secondo il numero di sostituzioni per sito. L’analisi ha coinvolto 34 sequenze nucleotidiche. Le posizioni dei codoni inclusi erano 1°+2°+3°+Non codificante. Tutte le posizioni contenenti gap e dati mancanti sono state eliminate. Nella serie di dati finale c’erano in totale
1670 posizioni. Le analisi evolutive sono state condotte in MEGA5.
FIGURE 2 - Shows the phylogenetic relationship of Egypt 2008 EI HA gene to EI H3N8 viruses. The evolutionary history was inferred
by using the Maximum Likelihood method based on the Hasegawa-Kishino-Yano model [1]. The tree with the highest log likelihood (4754.9425) is shown. The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. Initial
tree(s) for the heuristic search were obtained automatically as follows.When the number of common sites was < 100 or less than one
fourth of the total number of sites, the maximum parsimony method was used; otherwise BIONJ method with MCL distance matrix
was used. A discrete Gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among sites (5 categories [+G, parameter
= 0.7545]). The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. The analysis involved 34
nucleotide sequences. Codon positions included were 1st +2nd +3rd +Noncoding. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 1670 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA5.
riormente confermato mediante tecniche molecolari utilizzando la PCR in tempo reale per la specifica matrice genica. Questa indagine venne seguita
dall’amplificazione dei geni per HA ed NA ed il loro sequenziamento, designato come A/equi/Egypt/
6066NAMRU3-VSVRI/2008, con accesso alla Gen-
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Caratterizzazione del virus dell’Influenza Equina A H3N8 isolato in Egitto nel 2008
A virus isolate from 2008 from Egypt designated as
A/equi-2/Alex-1/08 was further confirmed by molecular methods using the matrix gene specific real time
PCR. This was followed by amplification of the HA and
NA genes and sequencing, designated as A/equi/Egypt/
6066NAMRU3-VSVRI/2008 with GenBank accession
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❚ Malattie infettive
FIGURA 3 - Relazione filogenetica fra il gene NA del virus dell’EI dell’Egitto nel 2008 e i virus EI H3N8. La storia evolutiva è stata dedotta utilizzando il metodo della Massima Probabilità basato sul modello di Hasegawa-Kishino-Yano.Viene mostrato l’albero con la massima probabilità logaritmica (-3347,6127). La percentuale di alberi in cui i taxa associati si raggruppano insieme è mostrata vicino ai rami. Gli alberi iniziali per la ricerca euristica sono stati ottenuti automaticamente nel
modo seguente. Quando il numero dei siti comuni era < 100 o inferiore ad un quarto del numero totale dei siti, è stato
usato il metodo della massima parsimonia; altrimenti, è stato impiegato il metodo BIONJ con distanza MCL. Per tracciare
un modello delle differenze della frequenza evolutiva fra i siti (5 categorie [+G, parametro = 0,5870]) è stata utilizzata una
distribuzione Gamma discreta L’albero è disegnato in scala, con le lunghezze dei rami misurate secondo il numero di sostituzioni per sito. L’analisi ha coinvolto 36 sequenze nucleotidiche. Le posizioni dei codoni inclusi erano 1°+2°+3°+Non
codificante. Tutte le posizioni contenenti gap e dati mancanti sono state eliminate. Nella serie di dati finale c’erano in totale 1336 posizioni. Le analisi evolutive sono state condotte in MEGA5.
FIGURE 3 - Shows the phylogenetic relationship of Egypt 2008 EI NA gene to EI H3N8 viruses. The evolutionary history was inferred
by using the Maximum Likelihood method based on the Hasegawa-Kishino-Yano model. The tree with the highest log likelihood (3347.6127) is shown. The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. Initial
tree(s) for the heuristic search were obtained automatically as follows.When the number of common sites was < 100 or less than one
fourth of the total number of sites, the maximum parsimony method was used; otherwise BIONJ method with MCL distance matrix
was used. A discrete Gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among sites (5 categories [+G, parameter
= 0.5870]). The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. The analysis involved 36
nucleotide sequences. Codon positions included were 1st +2nd +3rd +Noncoding. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 1336 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA5.
Bank con i numeri FJ209731 and CY087167, rispettivamente (Figure 2 e 3). L’analisi della sequenza del gene HA di questo isolato ha dimostrato
che è strettamente correlata ai virus dell’influenza
A H3N8 individuati nelle epizoozie del Giappone e
degli USA del 2007, con un’identità nucleotidica
No.: FJ209731 and CY087167 respectively (Figures 2
& 3). Sequence analysis of the HA gene from this isolate showed that it is closely related to influenza A
H3N8 virus isolates from outbreaks in Japan and USA
in 2007 with a nucleotide identity of 98%. Phylogenetic analysis of this isolate with selected isolates from
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❚ Malattie infettive
del 9%. L’analisi filogenetica di questo isolato confrontato con altri della GenBank Blastn attraverso
la ricerca di ceppi strettamente correlati ha ulteriormente confermato che è correlato soprattutto
agli isolati degli USA (Figure 2 e 3) con un bootstrap
support value del 99%.
In conclusione, i metodi virologici e molecolari
utilizzati in questo lavoro hanno sostenuto l’identificazione e la caratterizzazione del virus responsabile di questa epizoozia come EI sottotipo
H3N8. Inoltre, il virus isolato A/equi-2/Alex-1/08 o
A/equi/Egypt/6066NAMRU3-VSVRI/2008 risulta
strettamente correlato soprattutto ai virus dell’influenza A (H3N8) di USA o Giappone.
La ricomparsa dell’EI in Egitto indica quanto sia importante vaccinare la popolazione equina allevata
nel Paese con un ceppo isolato localmente. La produzione di un vaccino utilizzando il ceppo più recente (A/equi/Egypt/6066NAMRU3-VSVRI/2008) da
destinare all’impiego per la vaccinazione dei cavalli
allevati localmente proteggerà l’industria del settore
da future epizoozie. Inoltre, l’applicazione di una
sorveglianza attiva per l’EI nei cavalli allevati localmente e in quelli importati finalizzata a individuare
ed identificare precocemente la malattia contribuirebbe ad estinguere sul nascere le future epizoozie.
GenBank Blastn search of closely related strains further confirmed it is most closely related to the USA
isolates (Figure 2 and 3) with a bootstrap support value 99%.
In conclusion, virological and molecular methods used
in this work supported the identification and characterization of the virus responsible for this outbreak to
be EI subtype H3N8.
Additionally, the virus isolate A/equi-2/Alex-1/08 or
A/equi/Egypt/6066NAMRU3-VSVRI/2008 is most
closely related to influenza A (H3N8) viruses from
USA or Japan.
The reappearance of EI in Egypt indicates the importance of vaccination in locally bred horse population
with a locally isolated strain.
The production of a vaccine using the most recent strain (A/equi/Egypt/6066NAMRU3-VSVRI/2008) for
use in vaccinating local bred horses will protect the industry from future outbreaks.
Moreover, the application of active surveillance for EI
in locally bred and imported horses for early detection
and identification of EI will help early abortion of future epidemics.
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