Norovirus e molluschi bivalve: dati epidemiologici e attività di ricerca

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI ‘FEDERICO II’
FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA
SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN
“ISPEZIONE DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE”
Norovirus e molluschi bivalve: dati
epidemiologici e attività di ricerca
Dott.ssa Iole Ventrone
Napoli, 18 Maggio 2013
LE MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI
COSTITUISCONO
UN DIFFUSISSIMO PROBLEMA
PER LA SALUTE PUBBLICA
Malattie che si manifestano in seguito all’ingestione di
alimenti che contengono agenti patogeni
Le malattie legate ad alimenti contaminati sono forse il più diffuso
problema di salute pubblica nel mondo contemporaneo ed
un’importante causa di riduzione della produttività.
Esiste un’elevata sottostima
MALATTIE TRASMESSE DA
ALIMENTI
Sintomi
 vomito
solitamente
 nausea
gastroenterici
 diarrea
bambini
Le M.T.A. si manifestano con
maggiore gravità nelle
popolazioni più sensibili
donne gravide
immunodepressi
anziani
Agenti patogeni responsabili di
MTA
Esistono oggi al mondo più di 250 MTA che si
manifestano con differenti sintomi e sono
causate da diversi agenti patogeni.
•Batteri
•Muffe
•Virus
•Parassiti
Spesso si vedono (es.: frutta ammuffita)
Oppure si vedono gli effetti della loro attività
(es.: carni alterate)
Sono meno evidenti: siamo consapevoli
dei loro effetti quando incorriamo in una
infezione
Virus trasmessi da alimenti
Gli alimenti possono rappresentare una causa di trasmissione all’uomo di patogeni
di varia natura.
II virus, differentemente dai batteri, non si moltiplicano e non producono tossine negli alimenti ma possono
essere semplicemente veicolati da questi al momento dell’ingestione.
Veicolo di patogeni

Virus enterici
Dati epidemiologici e clinici indicano una crescente importanza dei virus come
causa di malattie trasmesse con gli alimenti, il cui numero è ancora
sottostimato.
Virus enterici: infezione
Ingestione di alimenti contaminati
I virus inducono focolai di infezione
a livello di tessuti dell’intestino tenue
si replicano a livello della mucosa
intestinale
vengono eliminati con le cellule infettate nel
lume intestinale (passano attraverso il colon
con il chimo)
eliminati con le feci (108-109
virus/g)
Vomito
20-30 milioni di particelle virali
Virus enterici
 Appartengono a 6-8 famiglie diverse
 Virus che causano gastroenteriti: Rotavirus,
Astrovirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus
(NoV e SaV)
 Virus dell’epatite entericamente trasmessa: HAV e
HEV
 Virus che si replicano nell’intestino umano, ma che
causano malattia dopo essere migrati in altri organi,
come il sistema nervoso centrale o il fegato:
Enterovirus
Norovirus
• Sono considerati una delle maggiori cause di gastroenteriti di
origine non batterica
• Solo negli Stati Uniti sono responsabili di 23 milioni di casi
di malattia all’anno, pari a circa l’85% di tutti i casi di
gastroenterite
• Analoghe percentuali sono state riscontrate in Giappone e
Australia dove l’impatto dei Norovirus risulta superiore a
quello di qualsiasi agente di natura batterica, compresa
Salmonella spp..
• In Europa sono responsabili del 40% delle gastroenteriti non
batteriche di cui il 52% è riconducibile al consumo di
molluschi bivalvi
Precedentemente conosciuti come “Norwalk-like virus”, dalla città
omonima nell’Ohio (USA), dove nel 1968 si ebbe il primo episodio di
infezione nell’uomo
Norwalk virus
Norwalk –like virus
SRSVs
•
SRSVs (Small Round Structured Viruses)
•
Piccoli virus (27-35 nm)
Gastroenteritis viruses
A = Rotavirus
B = Adenovirus
C = Norovirus
D = Astrovirus
Le particelle virali sono riportate allo stesso
ingrandimento.
Norovirus spp.
Famiglia Caliciviridae
– Lagovirus (Rabbit hemorrhagic disease virus, European brown hare syndrome virus)
- Vesivirus (Canine calicivirus, Feline calicivirus,
- Sapovirus (Sapporo virus)
Vesicular exanthema of swine virus)
Filogenesi basata sulla proteina capsidica
Norovirus spp.: generalità
•
Privi di involucro esterno
•
Capside icosaedrico con depressioni superficiali a forma di calice
•
Capside formato da 180 molecole (90 dimeri)
della proteina virale capsidica VP1 (55–60 kDa circa)
•
Proteina capsidica organizzata in 2 domini
Genoma
•Singolo filamento di RNA (ssRNA) a polarità positiva ( ~7,5 Kb)
• Tipico dei virus della famiglia Caliciviridae
• Genoma contiene 3 aree maggiori (ORFs)
•ORF 1 (~ 1700 aa) codifica per un precursore poliproteico non
strutturale poi convertito dalla viral 3C-like protease (3CL). Tale
poliproteina include RdRp (regione altamente conservata usata per la
diagnosi di Norovirus)
•ORF 2 (~ 550 aa) codifica per la proteina maggiore del capside (VP1)
•ORF 3 codifica per la proteina strutturale minore del capside (VP2)
con proprietà attualmente non ancora conosciute.
La proteina VP1 forma due domini : P (protundente, P1 e P2) e S (capsidico).
Il sub-dominio P2, più esterno, è il più soggetto a mutazioni e quindi
responsabile dell’elevata variabilità genetica del genere Norovirus
P2 contiene i siti recettoriali, quindi riconosce gli antigeni dei gruppi sanguigni
e si lega ad essi.
Norovirus
•
Si distinguono
geneticamente 5 genogruppi
(GI, GII, GIII, GIV e
GV), che a loro volta sono
divisi in diversi clusters o
genotipi
•
GI, GII e GIV infettano
l’uomo il GIII il bovino, il
GV è stato isolato dal topo
•
Il GII (il più diffuso tra i
genogruppi umani) contiene
19 genotipi
Gastroenterite da Norovirus: Cenni clinici
Periodo di incubazione :
•1-3 giorni
•La malattia ha decorso acuto ed è considerata
essere autolimitante
Sintomi:
• febbre, vomito, diarrea e nausea.
Sono più lievi nei bambini, a differenza delle
altre gastroenteriti virali.
•La loro risoluzione si verifica generalmente entro 23 giorni.
In uno studio epidemiologico condotto in Olanda > 20%
delle persone che aveva avuto la malattia riportava
sintomi anche dopo due settimane (Rockx, 2002)
Norovirus: trasmissione e
resistenza
• Trasmissione principalmente oro-fecale
• E’ descritta anche la trasmissione per via aerea, a seguito di
formazione di particelle di aerosol a partire da episodi di vomito
‘a getto’
• Oltre 30 milioni di particelle virali espulse con il vomito possono
contaminare superfici in una larga area: ci sono evidenze di una
sopravvivenza lunga di tali virus sulle superfici contaminate
• L’elevata infettività dei NoV è ulteriormente potenziata dalla
resistenza all’azione della temperatura e dei comuni
disinfettanti, rendendo estremamente difficoltosa la loro
eliminazione da superfici e alimenti contaminati
Norovirus
Infettività
• Elevata infettività: 10 particelle virali sufficienti a
provocare la malattia
• Inizialmente detta “malattia invernale da vomito”
• Attualmente in aumento anche in mesi primaverili ed
estivi (Regno Unito)
Diffusione dei Norovirus
•
Bassa dose infettiva : consente al virus di diffondersi attraverso
aereosol, vomito, contatti interpersonali e contaminazione dell’ambiente
(livello di reinfezione del 30% o più tra contatti stretti e familiari)
•
La liberazione virale precede l’esordio della malattia nel 30% circa
delle persone esposte e può continuare a lungo dopo la malattia
aumentando il rischio potenziale di una reinfezione
•
Virus resistente ad un ampio spettro di temperature (dal
congelamento a 60°C), sopravvive sulle superfici ambientali, nell’acqua
delle fontane e da bere, e in numerosi cibi mangiati crudi
•
Grande varietà dei norovirus e mancanza di una completa protezione
crociata e di una immunità duratura (le reinfezioni possono avvenire
per tutta la vita)
•
Genoma
che facilmente va incontro a mutazioni che causano
cambiamenti antigenici e ricombinazioni, che determinano l’evoluzione in
nuovi ceppi capaci di infettare soggetti sensibili.
Gastroenteriti da NoV (2000-2008)
I CDC (Centers for Disease Control and Prevention) americani stimano che
siano almeno 23 milioni ogni anno i casi di gastroenteriti acute dovute ad
infezione da Norovirus e che, nel complesso, questi agenti siano responsabili
del 50% del totale delle gastroenteriti.
Gastroenteriti da NoV in UE
• The most commonly reported settings for the virus outbreaks
were restaurant, café, pub, bar or hotel (39 outbreaks), but also
other settings were identified, including specific communities,
such as residential institutions, hospitals or home care
establishments.
• Several contributory factors were reported, either alone or in
combination, for 59 outbreaks; among the most common were
infected food handlers (33 outbreaks) and unprocessed
contaminated ingredients (19 outbreaks).
• Four waterborne outbreaks attributable to calicivirus (including
norovirus) were also reported.
Gastroenteriti da NoV in UE
•
•
•
Regno Unito: il 15,7 % di tutti di infezioni legate al consumo di vegetali e frutta
sono dovute alla contaminazione da Norovirus.
Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi di gastroenterite
dovuti al consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di
norovirus.
Svezia: (giugno-agosto 2006) si sono verificati 3 episodi:
– 15 persone coinvolte dopo consumo in una festa privata di un dolce a base di
crema e lamponi. Gli esami effettuati sui campioni di feci hanno evidenziato la
presenza di Norovirus
– 10 persone si sono ammalate con sintomatologia riferibile a Norovirus dopo
consumo di un cheesecake con lamponi . La segnalazione tardiva della
tossinfezione non ha consentito il prelievo di campioni ma durante le indagini è
emerso che i lamponi utilizzati per il cheesecake erano della stessa marca di
quelli trovati nell’episodio precedente.
– 12 bambini a seguito del consumo di una bevanda a base di lamponi; 9 persone
dopo consumo di un dolce ai lamponi.
Gastroenteriti da NoV in UE
•
•
•
•
•
•
•
•
2006
Danimarca: 2 epidemie collegate ad ostriche (coinvolte 46
persone in un party), provenienza UK e Francia
Italia: 2 epidemie collegate ad ostriche, provenienza Francia,(6
persone USSL12 Veneziana e 12 persone SIAN Trento).
Olanda: epidemia collegata ad ostriche, provenienza Francia (3
casi)
2007
Malta: 71 casi accertati, alimento sospetto ostriche
(provenienza Francia via Italia); presenza di GGI e GGII
2008
Francia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Spagna
Olanda : casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Francia
Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.
Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.
Casi di GE da Norovirus in Italia
• Estate 2003 – Villaggio turistico del centro Italia
183 persone coinvolte (169 ospiti e 14 impiegati)
Norovirus in acqua di mare e acqua di falda non potabile
(docce, piscine e servizi igienici)
• Dicembre 2005 – Ristorante in provincia di Udine
184 soggetti coinvolti
Antipasto di pesce contaminato da Norovirus
• 2007 – Provincia di Bari
Più di 1000 persone coinvolte
Acqua potabile contaminata da Norovirus
Norovirus: “virus da crociera”
• Novembre 2003 – Nave da crociera Aurora (P&O Cruises)
Gastroenteriti da NoV e crociere
Luglio- Novembre 2002: epidemie a bordo
di navi da crociera della stessa compagnia
Ottobre 2003: epidemia a bordo di una
nave da crociera nel Mediterraneo
Gennaio 2005: - epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi
- epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida
Motivi
•I focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente su una nave da
crociera che sulla terraferma.
• La vicinanza degli alloggi potrebbe accrescere le occasioni di contatto di gruppo.
• L’arrivo di altri passeggeri potrebbe causare il contagio dei passeggeri già presenti
e dei membri dell’equipaggio
Alimenti coinvolti
Frutta e verdure
Molluschi bivalvi
ACQUA
CONTAMINATA
Fonti di contaminazione primaria di
Norovirus
Molluschi e Norovirus
Diffusi su tutti i fondali
Animali scavatori sessili
Mediante meccanismo di
filtrazione si nutrono di piccole
particelle alimentari presenti
nell’acqua o nei sedimenti
Metabolismo molto attivo
Trattengono nel loro
organismo il plancton
necessario al nutrimento, ma
anche batteri e virus
eventualmente presenti nelle
acque
Molluschi bivalvi alimenti ad
alto rischio
°C
Litri/ora
Mitilo
14
1,5
Ostrica Europea
15
12
Ostrica Americana
20
18
36-432
litri/giorno
Network europeo per la
rapida individuazione delle
tossinfezioni virali derivate
dagli alimenti
I.S.S.
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
• Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) scelto nel
2002 dal Ministero della Salute per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
• Collabora e diffonde le informazioni provenienti dal
Laboratorio Comunitario di Riferimento, il "Centre for
Environment, Fisheries and Aquaculture Science "
(CEFAS) - Weymouth - United Kingdom
Reg CE 2073/2005 (1441/2007)
sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari
Criteri di sicurezza
Alimento
Microrganismo
Piano
campionamento(1)
n
c
Molluschi
bivalvi vivi
Salmonella
5
0
E.coli
1
0
Limiti(2)
Assente in
25g
230MPN/100
g
(1)
n= numero di unità che formano il campione
c= numero di unità campionarie i cui valori si situano tra m ed M
(2) Si applica l’ultima edizione della norma
Consideranda :
(12) Gli indicatori fecali convenzionali non sono
affidabili (…) e non è pratica sicura basarsi sulla
rimozione degli indicatori batterici fecali per determinare
i tempi di depurazione dei frutti di mare.
(23) È opportuno che i criteri per i virus patogeni nei
molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d’analisi
sono stati sufficientemente messi a punto.
(27) Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi
di analisi per virus enterici
Regolamenti 853-854/2004
Classificazione delle aree di produzione/stabulazione dei molluschi
bivalvi vivi
 Classificazione A,B e C basata sul numero di E.coli:
- A <230 E.coli/100g;
- B < 4600 E.coli/100g (Tolleranza analitica del 10% )
- C <46000 E.coli/100g
 Molluschi provenienti da area B: devono essere sottoposti a depurazione
presso Centri autorizzati (854 e 853/2004 part C)
 Molluschi provenienti da area C: stabulazione di lunga durata, almeno
due mesi (854 e 853/2004 part C)
2006 :AUMENTO DEI CASI DA NOROVIRUS IN EUROPA
Al programma FBVE partecipano 13 nazioni, 12 hanno risposto al quesito
9 nazioni hanno confermato un aumento della frequenza di focolai/casi
rispetto allo stesso periodo del 2004
L’ Italia non ha comunicato
le informazioni prima
della pubblicazione dei
dati.
I soli 4 casi indicati
suggeriscono una marcata
sottostima della situazione
nazionale.
Raccomandazione 20/04/2007
• La mancanza di un sistema di monitoraggio adatto a
registrare tutti i casi di tossinfezioni virali ha spinto il
Ministero della salute a emanare nel 2007 una
raccomandazione nella quale esorta le Regioni a delegare i
laboratori ufficiali per studiare metodiche standardizzate al
fine di rendere più efficaci i controlli ufficiali.
• I.S.S. partecipa all’istituzione del gruppo
CEN/TC275/WG6/TAG4
“Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A
virus in food by RT-PCR”
coordinatore dr. David Lee (CEFAS)
•
Necessità di definire metodi di riferimento (standardizzati ed
internazionalmente riconosciuti) per NV (GGI e GGII) e HAV:
Superfici
Frutta e vegetali
Acqua
Molluschi bivalve
Metodi classici
• Microscopia elettronica Scarsa sensibilità
• Saggi immunoenzimatici (ELISA) Cross reattività
• Colture cellulari
Virus difficilmente o affatto coltivabili
• Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE
Tecniche molecolari
Basso numero di
virus presenti
 Natura complessa e non
omogenea della matrice
alimentare
Hanno evidenziato la più alta sensibilità nell’individuare
i Norovirus
Protocollo sperimentale
1.
Estrazione e concentrazione del virus dalla
matrice alimentare
2.
Estrazione e purificazione dell’RNA per
rimuovere gli inibenti
3.
Retrotrascrizione a cDNA tramite l’enzima
trascrittasi inversa
4.
Amplificazione con Real Time PCR
Estrazione di Boom
(NucliSENS® MiniMag - bioMerieux)
Liberazione e stabilizzazione degli acidi nucleici
Legame degli acidi nucleici
Purificazione degli acidi nucleici, rimozione degli
inibitori
Recupero degli acidi nucleici in un piccolo volume
Real-Time PCR
5’VPG
ORF 1
ORF 2
ORF 3
AAA3’
Real-Time PCR
Primers & Probes
NOROVIRUS GI
QNIF4 (FW):
NV1LCR (REV):
NVGG1p (PROBE):
CGC TGG ATG CGN TTC CAT (Costafreda et al. 2006)
CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC (da Silva et al. 2007)
TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT (da Silva et al. 2007)
NOROVIRUS GII
QNIF2 (FW):
COG2R (REV):
QNIFS (PROBE):
ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA (Furhman et al. 2005)
TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA (De Medici et al. 2004)
AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG (Furhman et al. 2005)
Protocollo Real-Time PCR
Profilo termico:
• Mix RT-PCR
(kit Platinum Quantitative
RT-PCR ThermoScript OneStep System –
INVITROGEN)
 2x Thermoscript reaction
mix
 Primer 1 (12,5 μM)
 Primer 2 (22,5 μM)
 Probe (6,5 μM)
 ROX (50x)
 ThermoScript Plus /
Platinum Taq
 Acqua
 RNA
Step
description
Temperature
and time
Number
of cycles
RT
55°C
1 h
1
Preheating
95°C
5 min
1
Amplification
Denaturation
Annealingextention
95°C
15 sec
60°C 1 min
65°C 1 min
45
Estrazione acidi nucleici e PCR
•
Mengovirus : controllo di processo (efficienza della procedura di
concentrazione del virus ed estrazione degli acidi nucleici)
•
amplificazione del virus tal quale
•
amplificazione del virus estratto dal campione
•
cDNA di Norovirus : controllo interno (efficienza della reazione di
PCR)
•
amplificazione di RNA di sintesi
•
amplificazione dell’RNA di sintesi insieme al campione
RISULTATO
RISULTATO
Nota del
DGSAN del 24/11/2009
• L’ISS, in qualità di LRN,
ha diramato agli IZZSS
un metodo quantitativo
per la determinazione di
Norovirus e HAV in
molluschi bivalve mediante
Real Time PCR.
•
Il citato metodo è stato
sottoposto a validazione
interna e risulta dotato
dei requisiti di efficacia
Disegno sperimentale
1.
MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL
TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN
MOLLUSCHI BIVALVE
2.
RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE
RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE
CAMPANIA
Campionamento
15 allevamenti
46 prelievi al dettaglio
(7 area A - 8 area B)
117 pools di
Mytilus galloprovincialis
Specie analizzate
35
4
3
2
1
N-O
S-O
N-E
S-E
1
Mytilus galloprovincialis
Ensis minor
Chamelea gallina
Tapes philippinarum
Ostrea edulis
Glycymeris glycymeris
Acquistati presso punti vendita
(19 autorizzati e 16 ambulanti abusivi)
Materiali e metodi
Arrivo dei molluschi in
laboratorio
Lavaggio per
rimuovere fango e
detriti dalla
superficie esterna
delle valve
Materiali e metodi
Selezione di 20-25
esemplari per pool
Apertura delle valve
con lama pulita in
condizioni di sterilità
Dissezione del tessuto
digestivo con bisturi, pinzette
e forbicine sterili
Sminuzzamento con
bisturi sterile
Disegno sperimentale
Retrotrascrizione
Fase di denaturazione
Fase di annealing
Fase di extension
Estrazione e concentrazione
dell’RNA virale dalla
matrice alimentare
Retrotrascrizione a cDNA
Amplificazione con
Real Time PCR
Lettura dei risultati
della Real Time PCR
Risultati – Allevamenti
Prelievi: pool delle tre profondità di ciascun filare
Allevamenti
1ºcampionamento
Luglio 2007 / Maggio 2008
Zona A
NO
NE
SO
SE
1
7
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
Zona B
NO
NE
SO
SE
8
12
+
+
+
+
+
+
+
13
NC
14
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
3
4
5
6
9
10
11
15
NC
+
C
NC
-
2ºcampionamento
Settembre 2008 / Giugno 2009
3ºcampionamento
Novembre 2009 / Marzo 2010
NO
NE
SO
SE
C
NO
-
-
-
-
+
-
NC
-
NE
-
-
SE
C
+
NC
NC
NC
NC
NC
NC
-
SO
NC
-
NC
+
+
+
+
+
C
NO
NE
SO
SE
C
NO
NE
SO
SE
C
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
+
+
+
+
NC
NC
+
+
+
+
+
+
+
Positivi 13 allevamenti campionati (86,6%) in almeno uno dei prelievi
Risultati – Prelievi al dettaglio
Prelievi al dettaglio
Positività per NoVs
NoV GII
NoV GI +
NoV GII
27
15
4 Ensis minor
0
0
3 Chamelea gallina
3
2
2 Tapes philippinarum
2
1
Positività in 33 dei 45
1 Ostrea edulis
1
0
prelievi effettuati presso i
1 Glycymeris
1
1
punti vendita
Tot campioni positivi
34
19
Campioni
35 Mytilus
negativi
galloprovincialis
27%
Campioni
positivi
73%
glycymeris
Il campione di Glycymeris glycymeris sequestrato
in un ristorante della provincia di Napoli
contaminato da Norovirus appartenenti
ad entrambi i genogruppi.
Risultati per i punti vendita di Mytilus galloprovincialis
• Dei n. 35 punti vendita della Regione Campania nei quali sono
stati acquistati i campioni di Mytilus galloprovincialis, sono
risultati positivi :
 10 dei 16 rivenditori ambulanti abusivi che vendevano il
prodotto sfuso
 17 dei 19 punti vendita regolarmente registrati
Disegno sperimentale
1.
MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL
TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN
MOLLUSCHI BIVALVE
2.
RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE
RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE
CAMPANIA
3.
BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS
3.
BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS
IFREMER
( Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer )
Centro di Nantes (Francia)
Sezione di Virologia (Laboratorio di Microbiologia - MIC)
Dicembre 2009 - Maggio 2010
È stata studiata l’attività
metabolica di bioaccumulo nelle
ostriche dei due più comuni
genotipi virali di Norovirus :
• NoVs GI.1
• NoVs GII.3
BIOACCUMULO DI NOROVIRUS
IN CAMPIONI DI CRASSOSTEA GIGAS
• Gli esemplari di Crassostea gigas
provenivano da allevamenti siti
lungo le coste della Bretagna.
• Un grosso lotto di ostriche è stato
prelevato e posto in un’ area lungo
le coste della baia di Brest.
• Le ostriche sono state trasportate
in cassette di legno
tramite
automezzi refrigerati presso i
laboratori di ricerca dell’IFREMER
di Nantes.
Stoccaggio dei campioni
•
I campioni sono stati stoccati in camera fredda
termostatata all’interno di vasche contenenti acqua
di mare pulita, entro 24 ore dalla raccolta.
•
Temperature della camera e dell’acqua sono state
preimpostate a 9°C
•
Lo stoccaggio dei campioni è durata 24 ore per
permettere ai molluschi di reidratarsi, rivitalizzarsi
e adattarsi alle nuove condizioni ambientali.
•
L’acqua di mare, proveniente da cisterne interne
dell’IFREMER, era pulita e non contaminata da virus.
Preparazione dei Norovirus utilizzati negli esperimenti
di bioaccumulo
•
Sospensioni virali di Norovirus
•
Virus estratto da feci diarroiche provenienti da pazienti
ospedalizzati
•
I campioni di feci hanno evidenziato la presenza di NoVs GI.1 e
NoVs GII.3
•
Le soluzioni virali preparate per i test di bioaccumulo sono
state stoccate in frigo a 4°C
(106
virus / g di feci)
GI. 1 e Norovirus
GII. 3
Esperimenti di bioaccumulo
•
No. 8 esperimenti

Il bioaccumulo dei due singoli genotipi è stato testato in 3
repliche

Il bioaccumulo del cocktail contenente i due genotipi è stato
testato in 2 repliche
• Ogni esperimento:
– durata complessiva di dieci giorni (da 0 a 9)
– utilizzo di tre vasche (A, B, C), più una quarta vasca contenente i campioni di
Crassostea gigas utilizzati come controllo negativo
– l’acqua delle vasche (300 mL per campione) e’ stata cambiata ogni 24 h con
acqua di mare pulita
– controllo quotidiano dei parametri ambientali prefissati e della vitalità degli
esemplari di Crassostea gigas
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9)
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
Giorno 0
vasca A : 32 campioni e soluzione NoVs
vasche B e C : 8 campioni rispettivamente
A
B
C
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A
Giorno 0
vasca A : 32 campioni e soluzione di NoVs
Vasca A :
• Aggiunta di NoVs ogni 24h
• Prelievo di 8 campioni per valutare il bioaccumulo
i giorni 1
106virus/g feci
3
3x106virus/g feci
6
6x106virus/g feci
9
9x106virus/g feci
B
C
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A
Giorno 0
vasche B e C : 8 campioni rispettivamente
Vasca B :
• Aggiunta di una soluzione di NoVs
virus/g di feci il giorno 8 NoVs il giorno 8
106
• I campioni sono stati analizzati il giorno 9
dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale.
• Verifica dei parametri di vitalità e attività di
filtrazione delle ostriche
B
C
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A
Giorno 0
vasche B e C : 8 campioni rispettivamente.
Vasca C :
• Aggiunta di una soluzione di NoVs 9 x 106
virus/g di feci il giorno 8
• I campioni sono stati analizzati il giorno 9
dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale
• Differenze dose-dipendenti dell’attività di
bioaccumulo di Crassostea gigas.
B
C
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3
Giorno 0
vasche A, B e C : 16 campioni rispettivamente
Vasca A :
•Aggiunta ogni 24h di cocktail di NoVs
Vasca B :
•Aggiunta ogni 24h di NoVs GI.1
Vasca C :
•Aggiunta ogni 24h di NoVs GII.3
•
Vasca A analisi del bioaccumulo del cocktail virale.
•
Vasche B e C controllo per evidenziare
competizione nell’attività di bioaccumulo tra i due
genotipi virali
A
B
C
Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A
Vasche A, B e C :
• Prelievo di 8 campioni rispettivamente i giorni:
1
106virus/g feci dopo 24 h di bioaccumulo
e
9
9x106virus/g feci dopo 9 gg di bioaccumulo
B
C
Estrazione acidi nucleici
10µL mengo
Dissezione
del tessuto
digestivo
1,5g tessuto
digestivo
sminuzzato
Eluizione dei
virus:
•glycine pH 9,5
•chloroformebutanol
•cat floc T
Concentrazione
dei virus:
•PEG
•agitation 1h; 4°C
Lisi dei virus:
(Nuclisens Lysis
Buffer,
Biomérieux®)
Eluizione degli
acidi nucleici
100 µL
Purificazione degli acidi
nucleici
(Minimag Biomérieux ®)
Protocollo Real-Time PCR
Profilo termico:
• Mix RT-PCR
(kit Platinum Quantitative
RT-PCR ThermoScript OneStep System –
INVITROGEN)
 2x Thermoscript reaction
mix
 Primer 1 (12,5 μM)
 Primer 2 (22,5 μM)
 Probe (6,5 μM)
 ROX (50x)
 ThermoScript Plus /
Platinum Taq
 Acqua
 RNA
Step
description
Temperature
and time
Number
of cycles
RT
55°C
1 h
1
Preheating
95°C
5 min
1
Amplification
Denaturation
Annealingextention
95°C
15 sec
60°C 1 min
65°C 1 min
45
3.
BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS
RISULTATI
NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs GI.1
106/g stool
10/03/2010
Vasca A
Vasca B
13/04/2010
Vasca C
1,8x103
Vasca A
Vasca B
27/04/2010
Vasca C
Vasca A
Vasca B
Vasca C
1,0x104
2,0x105
9,5x103
8,5x103
D1
7,5x103
9,1x103
4,5x104
D3
3,5x104
4,5x104
7,1x104
D6
6,5x104
4,5x103
3,9x104
3,5x104
5,4x104
7,7x104
9,5x104
D9
Vasca A :
I risultati nei giorni 1, 3, 6 e 9 si discostano di poco nelle tre repliche,
variando tra loro di meno di un logaritmo.
La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni ha seguito un trend positivo
RISULTATI
NoVs GII.3 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs II.3
106/g stool
16/02/2010
Vasca A
D1
D3
D6
D9
Vasca B
10/03/2010
Vasca C
Vasca A
1,3x106
1,2x104
2,8x106
1,3x105
3,2x106
1,4x105
9,6x106
1,1x106
1,7x107
3,4x105
Vasca B
13/04/2010
Vasca C
Vasca A Vasca B
Vasca C
5,2x104
3,3x105
6,0x105
2,1x105
7,0x105
4,9x105
6,1x104
8,5x105
Vasca A :
La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni è costantemente in
crescita in tutte e tre le prove
Concentrazioni di virus più alte sono state evidenziate nella prima
prova (mese di febbraio).
RISULTATI
NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs GI.1
106/g feci
10/03/2010
Vasca A
Vasca B
13/04/2010
Vasca C
Vasca A
Vasca B
27/04/2010
Vasca C
Vasca A
1,8x103
9,5x103
8,5x103
7,5x103
9,1x103
4,5x104
3,5x104
4,5x104
7,1x104
Vasca B
Vasca C
1,0x104
2,0x105
D1
D3
D6
6,5x104
4,5x103
3,9x104
3,5x104
5,4x104
7,7x104
9,5x104
D9
Vasca B
La capacità di filtrazione permane immodificata fino all’ultimo giorno della
sperimentazione, le condizioni ambientali erano ottimali, bioaccumulo maggiore di
quello osservato nelle ostriche in vasca A il giorno 1.
Vasca C
Le ostriche hanno bioaccumulato in 24h una quantità di virus pari o di poco
superiore a quanto evidenziato nella vasca A
RISULTATI
NoVs GI.1 (106/ grammo di feci)
• Nelle stesse condizioni di
sperimentazione e a parità di
concentrazione virale, i campioni
di Crassostea gigas tendono a
bioaccumulare maggiormente
NoVs GII.3.
• La differenza tra i risultati di
bioaccumulo è infatti di circa un
logaritmo.
NoVs GII.3 (106/ grammo di feci)
RISULTATI
Cocktail (NoVs GI.1 + NoVs GII.3) concentrato 106/ grammo di feci
NoVs
GI.1+GII.3
106/g stool
27/04/2010
Vasca A
18/05/2010
Vasca B
Vasca C
GI.1
GII.3
D1
1,0x104
2,5x104
8,5x103
D9
2,0x105
1,4x105
9,5x104
Vasca A
Vasca B
Vasca C
9,5x104
5,0x103
6,4x105
2,7x106
6,0x105
1,5x106
GI.1
GII.3
8,1x104
1,1x104
4,0x105
3,2x105
• Riconfermata la maggiore capacità di bioaccumulo di NoVs GII. 3 sia se
miscelato nel cocktail, sia se aggiunto singolarmente.
CONCLUSIONI
•
Metodica Real Time RT PCR efficace per la ricerca dei Norovirus (Nota
MinSan 24/11/2009)
•
Vasta circolazione di Norovirus in molluschi bivalve raccolti e
commercializzati nella Regione Campania (57% di positività)
•
Presenza di Norovirus appartenenti ai genogruppo II in tutti i campioni
positivi
•
Presenza di Norovirus in allevamenti di area A
•
Più del 50% di positività in campioni provenienti da punti vendita
autorizzati
•
I campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato una quantità di virus
costantemente in crescita
•
Il genotipo GII. 3 è il patotipo del genere Norovirus più stabile nel
tessuto digestivo dei molluschi filtratori
•
In compresenza di Norovirus GI. 1 e GII. 3, i campioni di Crassostea
gigas hanno bioaccumulato entrambi i genotipi virali
(non esiste immunità crociata per NoVs)