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Glicazione non enzimatica dell’emoglobina
La glicazione è un processo post-traduzionale per mezzo del quale uno zucchero interagisce con una
proteina con il risultato di ottenere una proteina modificata con uno zucchero legato covalentemente a
uno o più ammino acidi della proteina stessa . La struttura secondaria della proteina è perciò alterata
(rispetto alla proteina non glicata ) spesso dando origine ad un cambiamento della funzione della proteina
glicata . Sebbene avvengano modeste glicazioni in tutte le persone in salute , ad alti livelli di glicazione
possono verificarsi cambiamenti fisiologici e patologici . Come esempio un individuo iperglicemico ha un
alto grado di glicazione e spesso manifesta complicazioni da diabete mellito tipo 2 . In aggiunta , il legame
covalente del glucosio all’estremità N-terminale della valina della emoglobina è servito come marker
della concentrazione di glucosio nel sangue lungo un periodo esteso (2-3 mesi ). Poiché la glicazione delle
proteine ha implicazioni sullo stato di salute , la comprensione del processo di glicazione ha grande valore.
L’obbiettivo di questa lezione è quello di comprendere meglio il primo stadio della glicazione proteica , la
quale consiste nell’iniziale interazione tra lo zucchero e la proteina . In particolare il glucosio sarà lo
zucchero polare che funge da substrato e la forma adulta dell’emoglobina umana (HbA) sarà la proteina
modello in questa lezione .
1. Le proteine possono interagire con i substrati in modo tale che l’interazione proteina/substrato può
essere di natura covalente o non covalente .
Il Riquadro A rappresenta una interazione proteina / substrato che è covalente o non covalente ?
Il Riquadro B rappresenta una interazione proteina/ substrato che è covalente o non covalente ?
2. Quale è l’interazione non covalente dominante tra un substrato e una proteina ?
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Un suggerimento: Nel Riquadro A l’interazione predominante non covalente è raffigurata con una
linea tratteggiata ( tra il paio di elettroni solitario sull’idrogeno del residuo amminoacidico e il
protone sul gruppo – OH del substrato , in questo caso , uno zucchero )
3. Nel legame ad idrogeno ci sono H-legami donatori e H- legami accettori .
a. Nel Riquadro A , il residuo amminoacidico è accettore del legame a idrogeno o donatore del legame
a idrogeno ?
b. Nel Riquadro B , il residuo amminoacidico è accettore del legame a idrogeno o donatore del legame a
idrogeno ?
4. Nel nostro studio sul processo di glicazione , il substrato in questione è il glucosio . Il glucosio non
è una singola specie , ma sono invece cinque strutture che si interconvertono ( il processo di
interconversione è chiamato mutarotazione ) in soluzione acquosa .
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Basandoci sulla abbondanza percentuale della forma ad Anello – Aperto (AA) di glucosio all’equilibrio , la
forma AA è più o meno disponibile ad interagire con una proteina rispetto alle quattro forme ad anello
chiuso (AC) del glucosio ?
5. I ricercatori concordano nel ritenere che la forma AA del glucosio è l ‘unica forma che interagisce
con le proteine nel processo di glicazione . Questo assunto è illustrato nello schema seguente :
Basandoci sulla Fig. 1 , la struttura del glucosio , che è indicata come necessaria per la prosecuzione del
processo , è evidenziata dalla intestazione “Non covalent interactions : Stage 1 “
E’ la forma AA o AC del glucosio?
6. Poiché il processo è chiamato “non covalent “ , quale è la più probabile interazione tra la forma AA
del glucosio è l’ammino acido terminale di HbA (vedi domanda 2 e 3 )?
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7. Il complessivo processo di glicazione è diviso in quattro stadi ( vedi Fig.1) . Da notare che lo stadio 1
è il processo non covalente e gli stadi 2-4 coinvolgono interazioni covalenti . Si conosce molto degli
stadi 2-4 della glicazione e perciò non saranno al centro della nostra attenzione . Invece , il nostro
interesse è nel processo non covalente , l’iniziale legame tra HbA e il glucosio.
Sapendo che il 99.998% del glucosio disponibile in soluzione acquosa non è nella forma AA (da domanda 4),
e che la forma di glucosio che si suppone continui nel processo covalente è la forma AA , dobbiamo allora
porci una domanda . Come possiamo avere una significativa glicazione nonostante sia così piccola la
quantità disponibile , per reagire , di glucosio nella forma AA ?
Per aiutare a dare una risposta a questa domanda considereremo un semplificato meccanismo “ chiave e
serratura “ per un substrato che si lega ad una proteina .
a. E’ possibile che la forma AA si adatti al sito di legame meglio delle altre quattro forme AC di
glucosio?
b. Se la forma AA si adatta al sito di legame meglio delle altre forme , è concepibile che AA sia il solo
che si leghi ?
8. Non esiste un metodo sperimentale diretto , accessibile per determinare se la forma AA lega meglio
delle altre quattro forme RC .Tuttavia è possibile risolvere questa questione con l’ausilio del
computer. Si può costruire un modello di substrato e legare questo substrato alla proteina , sotto
definite condizioni , attraverso un modello computazionale . Attraverso questo metodo è possibile
misurare le caratteristiche esoergoniche del legame di qualsiasi substrato a una proteina ( si può
calcolare una teorica ΔG per ciascun substrato che venga legato )
L’energia libera di Gibbs per una reazione (ΔG = ΔH – TΔS ) prende in considerazione sia l’entalpia ΔH che
l’entropia ΔS . Se ΔG è negativo , la reazione (o processo ) sarà spontaneo e sarà chiamato esoergonico .
Data la questione se la forma AA del glucosio si lega meglio ad HbA rispetto alle quattro forme AC del
glucosio , viene progettato un approccio computazionale per rispondere alla domanda 7 . In modo
specifico quale substrato potrebbe essere costruito ? Quale proteina potrebbe essere costruita ? . Che cosa
si fa con la struttura una volta costruita e che cosa si misura ?
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9.
Si dovesse legare ciascuno dei cinque isomeri del glucosio e la forma AA fosse la sola che lega in
modo esoergonico ( mentre le altre si legano in modo endoergonico ) , o la forma AA si lega in
modo più esoergonico che le altre forme AC , come possiamo rispondere alla seguente questione
…..
La forma AA si lega selettivamente ad HbA in presenza delle quattro forme di AC ?
10. Se la esoergonicità del legame dei cinque isomeri del glucosio è circa la stessa , o se la forma AA in
realtà si lega meno bene di quanto faccia la forma AC ( o al meno una delle forme AC ) , come
risponderesti alla seguente domanda …
La forma AA si lega in modo selettivo a HbA in presenza delle quattro forme AC ?
Esperimento 1 : Una serie di calcoli furono eseguite per cui ciascuno dei cinque isomeri furono costruiti e
indipendentemente legati alla catena β di HbA . La esorgonicità del legame in ciascun esperimento è
riportata in Tabella 1 .
11. Basandoci sui dati dell’esperimento 1 (Table1 ) la forma AA ( Ring – opened glucose ) si lega con
una esorgonicità più grande rispetto a tutte le altre forme di AC ?
12. E’ più facile che la forma AA del glucosio lega selettivamente HbA rispetto alle quattro forme di AC?
13. Perciò , dato che la forma AA non è quella che si lega esclusivamente ( in presenza delle quattro
forme di AC ) , il meccanismo della chiave e serratura descritto nella domanda 7 si può applicare
qui?
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14. Se la forma AA non si lega selettivamente , allora sorge una domanda . Come la forma AA finisce
per legarsi ad HbA ? La domanda è importante perché la forma AA del glucosio è la sola forma che
precede la glicazione (Figura 1) però soltanto lo 0.002% rispetto alle forme AC (vedi domanda 4 ) e
inoltre la forma AA non si lega selettivamente . Così di nuovo …. Come la forma AA del glucosio
finisce per legarsi ad HbA ? Per rispondere a questo quesito , consideriamo e rispondiamo a una
serie di relative domande di fondo .
a. Basandoci sui dati della Tabella 1 quale forma di glucosio si lega meglio ?
b. 1.0 – 1.2 kcal/mole di differenza nella esorganicità del legame non è sufficiente per
aspettarci che una specie si legherà, in presenza di un’altra , in modo esclusivo . Perciò
quale isomero potrebbe legarsi insieme al β – piranosio ?
c. Se α- e β- piranosio si legano come l’isomero AA ( anzi meglio ) e la concentrazione di αe β- piranosio è circa 50.000 volte più alta rispetto all’isomero AA , quale isomero del
glucosio quasi esclusivamente si lega inizialmente a HbA ?
15. Poiché ci sono 50.000 α- e β- piranosio molecole di glucosio AC per 1 AA glucosio disponibile a
legarsi e poiché α- e β- piranosio glucosio strutture si legano meglio rispetto all’isomero AA , è più
facile che il legame non covalente del glucosio AA alla proteina (come mostrato in Figura 1 ) nasca
dal legame diretto del glucosio AA ?
Perciò , poiché la formazione di un legame di AA è necessario perché si vada verso il processo di
glicazione , e esso non nasce da un legame diretto , noi ritorniamo alla nostra precedente
domanda ancora senza risposta ….
Come la forma AA del glucosio finisce per legarsi ad HbA ? Ma ….. ancora non possiamo
rispondere a questa domanda senza rivedere un altro concetto specifico , la mutarotazione del
glucosio .
16. Nella figura sotto , nota gli equilibri . Se si parte con α- piranosio , quale è il solo isomero al quale
possiamo direttamente arrivare ?
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17. Considerate le frecce dell’equilibrio , può l’isomero AA tornare indietro ad α- piranosio ?
18. Una volta che siamo all’isomero AA , l’isomero AA è limitato a ritornare solo all’ α- piranosio ?
19. Quanti sbocchi ci sono dall’isomero AA ( incluso il ritorno all’ α- piranosio ) ?
20. Ancora , osservando le frecce degli equilibri , in particolare in termini delle loro relative dimensioni
e verso, che partono dall’isomero AA , sarà l’isomero AA ad avere una lunga vita o il suo anello si
chiuderà rapidamente in una delle quattro forme AC
21. Dopo aver riesaminato il processo completo di mutarotazione , possiamo ritornare al legame del
glucosio e al processo di glicazione . Se l’isomero AA è la sola specie reattiva che conduce in
direzione della glicazione e, come abbiamo già dimostrato , la forma AA non esiste in grande
concentrazione e non si lega selettivamente ---- Come possiamo arrivare alla specie AA legata ?
Prima di rispondere , ricorda che AC α- e β-piranosio inizialmente si legano ad HbA .
Consideriamo lo schema dell’equilibrio della mutarotazione del glucosio nella domanda 16. In
questo schema, la interconversione tra i quattro isomeri AC e l’isomero AA a vita breve si svolge in
soluzione acquosa . Per il nostro scopo , il mezzo acquoso potrebbe essere il citosol dell’eritrocita
( che contiene la proteina ) . Tuttavia , perché l’isomero del glucosio si interconverta in acqua
( processo di mutarotazione ) è ragionevole supporre che un simile processo di mutarotazione può
avvenire una volta che un isomero AC è legato in modo non covalente ad una proteina ? Se è così ,
è ragionevole asserire che il glucosio AC si lega e poi , mentre è legato , mutoruota e genera un
isomero intermedio AA ?
Se è così , un isomero AA può diventare non legato covalentememte attraverso la mutarotazione
di un isomero AC che si era legato precedentemente alla proteina . Questo forma AA può poi
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muoversi attraverso il resto del processo di glicazione . Per illustrare questo lo schema seguente
rappresenterebbe il legame non covalente di una molecola di AC β- piranosio a una proteina nella
fase della muratotazione per diventare l’isomero AA ( senza mostrare nessun stadio del
meccanismo )
Il riquadro 1 rappresenta la condizione di pre-legame e il riquadro 2 l’iniziale legame non
covalente del β- piranosio alla proteina . Per aiutare la visualizzazione del processo , completa lo
schema disegnando il glucosio AA legato alla proteina nel terzo riquadro …..
Con lo schema precedente in vista possiamo riassumere dove siamo …
Riassunto delle ipotesi per la formazione del legame del Glucosio AA Reattivo :
a. Le strutture di glucosio AC α- e β- piranosio sono gli unici isomeri vicini che inizialmente si legano ad
HbA non covalentemente .
E’ questo elemento della nostra ipotesi convalidato dai dati ?
Se così , da dove traiamo i dati a sostegno ?
b. Una volta legatosi , le strutture del glucosio α- and β-piranosio possono aprire l’anello per dare
l’isomero AA reattivo così che si dirige verso il processo di glicazione ( questo è descritto sopra nel
disegno che hai completato )
Le nostre ipotesi complessive per la formazione del glucosio AA reattivo legato non fanno
riferimento alla natura della reattività del legame del glucosio AA , perciò dobbiamo domandarci
come il glucosio AA legato reagisce per procedere nel processo di glicazione .
22. Per gli artefatti , andiamo a rivedere la Figura 1.
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La transizione dallo Stadio 1 allo Stadio 2 richiede che si formi un legame covalente . Il legame covalente
formatosi deve essere il risultato di un nucleofilo verso un elettrofilo .
Nelle due illustrazioni seguenti , lo zucchero AA agisce come nucleofilo o elettrofilo ?
Nelle due illustrazioni seguenti , il doppietto solitario di NH2 nel residuo amminoacidico agisce come
nucleofilo o elettrofilo ?
Se il residuo amminoacidico nella seguente illustrazione è protonato ( così che è NH3+ ) la reazione non
procederebbe . Perché è necessario per il residuo amminoacidico che sia deprotonato per agire da
nucleofilo ?
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23. Lo scopo dei due precedenti schemi (domanda 22 ) è di stabilire che un residuo amminoacidico (Nterminale o gruppo R- ) deve agire come nucleofilo per formare un legame covalente guidando verso la
glicazione . Così … quale amminoacido interno , in generale , può agire come un nucleofilo ?
suggerimento : solo quelli il cui gruppo R ha un atomo che possiede una coppia di elettroni ….
Nel segmento di proteina mostrato sotto , quale residuo amminoacidico ( catene laterali nei riquadri ) può
servire come nucleofilo ?
Tra gli amminoacidi precedenti , quale residuo amminoacidico in una proteina come HbA potrebbe essere
glicosilato ? Spiega .
Nota : I soli residui amminoacidici interni glicati in HbA noti sono residui di lisina , che è coerente con la
nostra ipotesi .
Data la conoscenza acquisita con le ultime due domande , quale è poi il ruolo del glucosio legato AA nel
processo di glicazione ----- è nucleofilo o elettrofilo ?
24. Il disegno seguente differisce dal segmento di proteina precedente in quanto tale segmento non è un
segmento interno ma è piuttosto l’estremità N-terminale di una proteina .
Basandoci su questo disegno e su cosa conosciamo del meccanismo di glicazione , può la valina terminale
agire come nucleofilo ?
Che cosa accadrebbe alla reattività della valina terminale se l’ NH2 terminale fosse protonato a NH3+ ?
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( aumenterebbe o diminuirebbe )
25. I ricercatori hanno sostenuto storicamente che l’isomero AA del glucosio è la sola forma del glucosio
reattivo che procede verso il processo di glicazione per produrre la base aldimmina /Schiff ( transizione
Stadio 1 – Stadio 2 ) . Basandoci sulle nostre nuove dimostrazioni che il glucosio legato è l’elettrofilo , quale
è il miglior elettrofilo , l’iniziale anello chiuso del glucosio legato o il glucosio legato come AA che si genera
dalla mutarotazione dell’iniziale glucosio ad anello chiuso ? Perché ? ( vedi la figura sotto )
26. Fino ad ora noi sappiamo che :
a. La specie legata inizialmente è un anello chiuso α- o β- piranosio
b. La struttura legata inizialmente del glucosio α- o β-pyranosio, mentre si lega ,
genera l’isomero del glucosio AA .
c. La sola forma reattiva del glucosio legato che procede verso la glicazione è
l’isomero AA del glucosio .
d. L’isomero AA del glucosio agisce come elettrofilo ed è attaccato da un residuo
amminoacidico nucleofilo di lisina ( o il terminale N dell’ammino acido ) sulla
proteina per formare la base aldimmina /Schiff ( transizione Stadio 1 – Stadio ),
così …
L’iniziale isomero AC del glucosio apre l’anello prima o dopo l’attacco nucleofilo ?
27. Come si apre l’anello del glucosio legato α- o β-pyranosio mentre si sta legando?
Per rispondere a questo è necessario alcuni principi .
Basandoci sulla mutarotazione in soluzione , il meccanismo dell’apertura dell’anello del glucosio è
teoricamente acido o base catalizzato .
a. Nel meccanismo seguente , chi agisce come un acido ( l’ α-piranosio o il
fosfato inorganico ) ?
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b. Chi agisce come una base ?
c. Il meccanismo porta all’apertura dell’anello ?
d. Il meccanismo di apertura dell’anello è acido catalizzata o base catalizzata
(Basato su che cosa significa il reagente non zucchero ) ?
28. Una seconda alternativa è un meccanismo acido catalizzato .
a. In questo caso ( mostrato sotto ) quale è l’acido ?
b. Quale è la base ?
c. Il risultato è l’apertura dell’anello ?
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29. Abbiamo bisogno di progettare un esperimento ( o esperimenti ) per stabilire se l’anello che si sta
aprendo del glucosio legato alla proteina è catalizzato da un acido o una base . Questo è molto difficile da
realizzare con una proteina realmente coinvolta . Così , una serie semplificata di esperimenti può essere
compiuta per aiutarci a rispondere alla domanda .Consideriamo la serie di sperimenti seguenti ….
Esperimento 2 : Verifica per la Catalisi Acida .
Se si dovesse condurre la reazione dell’apertura dell’anello dell’α-piranosio in funzione del tempo in D2O
con l’aggiunta di acido acetico glaciale ( vedi struttura seguente ) fino a un pH di circa 4.5 , sarà disponibile
acido in questa reazione che non era disponibile in una reazione a pH = 7 ( la reazione standard in
condizioni fisiologiche ) ?
( Si o no )
Acido acetico
Se si eseguivano altri due esperimenti ---- uno dove l’acido acetico è addizionato fino a pH circa 3 e l’altro
dove l’acido acetico è addizionato fino a pH circa 1 , avremmo tre serie di dati con una concentrazione
sempre maggiore di acido disponibile . Perciò , potresti confrontare la velocità di apertura dell’anello in
funzione del’ aumento della concentrazione di acido ?
Se l’apertura dell’anello dell’ α- piranosio può essere catalizzata da acidi , la relativa velocità dovrebbe
aumentare o diminuire se l’acidità aumenta ? Spiega .
Se l’apertura dell’anello dell’ α- piranosio non può essere catalizzata da acidi , che cosa potrebbe accadere
alla relativa velocità se l’acidità aumenta ? Spiega .
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Basandoci sui dati della Tabella 2 , può l’apertura dell ‘ anello di α-piranosio essere catalizzata da acidi ? ( Si
o no )
Esperimento 3 : Verifica per la Catalisi Basica
Se noi misuriamo la velocità dell’ apertura dell’anello di α- piranosio in funzione della forza della base
aggiunta , possiamo valutare se l’apertura dell’anello può essere catalizzata dalla base . Specificamente ,
tre basi fisiologiche sono esaminate : fosfato , bicarbonato , e lattato ( i pKa per queste basi sono circa 12.1,
10.3 , e 3.9 rispettivamente ) .
Se l’apertura dell’anello dell’ α-piranosio può essere catalizzata da una base , la relativa velocità dovrebbe
aumentare o diminuire se cresce la forza della base ?
Se l’apertura dell’anello dell’ α-piranosio non può essere catalizzata da una base , che cosa dovrebbe
accadere alla relativa velocità se la forza della base cresce ?
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Basandoci sui dati della Tabella 3 , può l’apertura dell’anello dell’ α-piranosio essere catalizzata da una
base? ( Si o no )
30. Basa doci sui dati della Tabella 2 e 3 , l’apertura dell’anello del glucosio può essere catalizzata sia da un
acido che una base . Così quale è meglio ----- la catalisi acida o basica ? Per aiutare in questa risposta ,
consideriamo che la reazione standard in entrambe le Tabelle 2 e 3 sono le stesse , cioè , la prima
annotazione in ciascuna tabella riflette la stessa velocità . Perciò , i numeri delle Tabelle 2 e 3 possono
essere direttamente confrontati .
a.
Perciò , addizionando un acido , la velocità di apertura dell’anello del glucosio è accelerata più o
meno rispetto all’aggiunta di una base ?
b. Perciò , cosa catalizza meglio un acido o una base ?
c. Quali condizioni sono responsabili per l’apertura più veloce dell’anello ? ( Acidità o Basicità )
31. Sebbene la β- catena di HbA ha meno residui di lisina , i residui glicati sono Lis 17 , 59 , 61, 66, e 82 .
Perché solo questi ? Perché non tutti i residui di Lisina contenuti nell’intera proteina ?
Precedentemente abbiamo stabilito che l’apertura dell’anello è facilitata dalla base ( vedi domanda 27, 30 ).
Se in presenza di una base aumenta la velocità di apertura dell’anello di uno zucchero legato , la presenza di
un amminoacido basico ( in aggiunta alla presenza di un nucleofilo ) dovrebbe giocare un ruolo nella
velocità .
a. Potrebbe la presenza di un amminoacido basico aumentare o diminuire la concentrazione di uno
zucchero AA legato ?
b. Potrebbe la presenza di un amminoacido basico aumentare o diminuire la concentrazione di un
elettrofilo legato nella reazione ?
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c. Se la concentrazione dell’elettrofilo legato è aumentata , che cosa potrebbe accadere alla velocità
della glicazione ?
Nel segmento di proteina mostrato sotto , quale residuo amminoacidico ( catene laterali nelle caselle ) può
comportarsi da base ?
32. In HbA , la sola tasca della proteina che lega il glucosio che ha sia una Lisina ( che agisce come un
nucleofilo ) e una istidina basica ( che catalizza l’apertura dell’anello ) sono queste associate con Lisina 17,
59 , 61 , 66 , e 82 . Da notare , queste sono i residui predominanti di Lisina che sono conosciuti nella
reazione di glicazione .
Ci sono molte altri residui di Lisina in HbA legata al glucosio , ma non sono glicati . Perché ?
Per procedere allo stadio covalente del processo di glicazione , una tasca della proteina deve :
a. Legare α- o β-piranosio
b. Possedere un lisina localmente ( o l’N-terminale di un amminoacido come la valina ) che possa agire
come nucleofilo
c. Possedere una base localmente come una istidina per legare α- o β-piranosio ad anello aperto per
legare l’isomero AA ( anello aperto ) del glucosio come elettrofilo reattivo .
Se la tasca di una proteina lega il glucosio e ha una lisina localmente ma non una istidina , non potrà
procedere allo stadio covalente di glicazione perché è mancante quale dei seguenti :
La base per generare AA elettrofilo o il nucleofilo ?
Se la tasca di una proteina lega il glucosio e ha una istidina localmente ma non una lisina sempre
localmente , non può procedere lo stadio covalente della glicazione perché è mancante quale dei seguenti :
La base per generare AA elettrofilo o il nucleofilo ?
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Perché sono necessari sia una istidina che una lisina nella stessa tasca che lega il glucosio in modo che
avvenga la glicazione ?
33. Sommario del Meccanismo : Il meccanismo seguente è una potenzialw descrizione del processo di
glicazione . Rispondete alle domande che si basano su questo meccanismo .
Nel riquadro A:
Lo zucchero è legato covalentemente o non covalentemente ?
L’iniziale legame dell’ anello dello zucchero è nella forma aperta o chiusa ?
Nell’iniziale legame dello zucchero c’è un carbonio carbonilico ?
Nell’iniziale legame lo zucchero è un buon elettrofilo tale che la lisina può
attaccare come nucleofilo e procedere nel processo della glicazione ?
Quale ruolo gioca l’istidina quando interagisce con lo zucchero ?
( acido o base )
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Quale ruolo gioca l’acido aspartico ( indicato come asp ) ?
Suggerimento : L’acido aspartico rende l’istidina più o meno acida ?
Nel riquadro B :
Lo zucchero è legato in modo covalente o non covalente ?
Lo zucchero legato è AA o AC ?
Nel legame iniziale lo zucchero è un buon elettrofilo tale che
la lisina può attaccare come un nucleofilo e procedere alla glicazione ?
C’è un buon nucleofilo vicino ?
Se così , che cosa può agire da nucleofilo ?
Nel riquadro C :
Lo zucchero è legato in modo covalente o non covalente ?
Sta avvenendo un attacco nucleofilo ?
Chi sta agendo come nucleofilo ?
Chi sta agendo come un elettrofilo ?
Nel riquadro D :
Quale nuove specie si sono formate dall’ attacco nucleofilo ?
Lo zucchero è legato in modo covalente o non covalente ?
