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Indice
Prefazione
Guida alla lettura
XVI
XVIII
Parte 1 Geni e genomi
1 Principi dell’analisi genetica
Introduzione
1.1 Logica dell’analisi genetica: una rassegna storica
1.1.1 I geni sono le unità dell’ereditarietà
o Mendel aveva ragione
– fino a un certo punto
1.1.2 I geni si trovano sui cromosomi
o Morgan e la “stanza delle mosche” avevano ragione
– in gran parte
1.1.3 Un gene-una proteina
o Garrod, Beadle, Ephrussi e Tatum avevano ragione
– in un certo senso
1.1.4 I geni sono composti di DNA
o Watson, Crick, Franklin e Avery-MacLeod-McCarty
avevano ragione
1.1.5 Nuove caratteristiche nella struttura e nell’organizzazione
dei genomi emergono di continuo
1.2 Analisi genetica
Il capitolo in pillole
2 Organismi modello e loro genomi
Introduzione
2.1 Organismi modello: una visione d’insieme
2.1.1 Organismi modello e biologia umana
2.2 L’incredibile potere della genetica del lievito
2.2.1 Il lievito è spesso coltivato in forma aploide
2.2.2 La trasformazione del lievito utilizza plasmidi naturali
2.2.3 Lo smistamento (trafficking) delle proteine è un esempio
di processo fondamentale nelle cellule eucariotiche,
studiato nel lievito mediante analisi genetica
2.2.4 Banca dati del genoma di Saccharomyces, SGD
2.3 Caenorhabditis elegans è suscettibile di analisi genetica
2.3.1 C. elegans ha due sessi, ma non quello femminile
2.3.2 I nematodi hanno un lignaggio cellulare precisamente
definito
2.3.3 La trasformazione di C. elegans è realizzata per
microiniezione
2.3.4 L’analisi genetica di C. elegans utilizza sia le mutazioni sia
gli schemi di lignaggio cellulare
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Indice VII
2.3.5
Queste mutazioni hanno portato all’identificazione di due
diverse vie cellulari coinvolte nel cancro umano
2.3.6 Banca dati del genoma di C. elegans, Wormbase
2.4 Drosophila melanogaster: se avete da chiedere...
2.4.1 D. melanogaster presenta alcuni aspetti peculiari
2.4.2 La trasformazione di Drosophila utilizza un elemento
trasponibile
2.4.3 La determinazione del sesso in Drosophila coinvolge una
serie di splicing alternativi
2.4.4 La determinazione del sesso in Drosophila rivela sia
proprietà universali sia proprietà taxon-specifiche
2.4.5 Banca dati genomica di Drosophila, Flybase
2.5 Arabidopsis thaliana: un’erbaccia con uno scopo
2.5.1 Il ciclo vitale di Arabidopsis è più breve di quello di molte
angiosperme
2.5.2 La trasformazione di Arabidopsis è realizzata utilizzando
Agrobacterium tumefaciens
2.5.3 Grazie all’analisi genetica in Arabidopsis è stato possibile
definire le vie di biosintesi e di segnalazione degli ormoni
brassinosteroidi
2.5.4 Le mutazioni hanno dimostrato la presenza della via dei
brassinosteroidi in Arabidopsis
2.5.5 Risorsa informativa per Arabidopsis
2.6 Mus musculus: il potente topo
2.6.1 Banca dati informatica del genoma del topo
2.7 Cinque organismi modello: un riassunto
2.8 Altri organismi modello utili
2.8.1 Servono altri organismi modello?
2.8.2 Analisi genetica in un organismo non mendeliano
Caso studio 2.1 Rigenerazione in planaria
Il capitolo in pillole
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Parte 2 Geni e mutanti
3 Identificare i mutanti
Introduzione
3.1 Trovare mutazioni: una panoramica
3.2 L’analisi genetica diretta e quella inversa
3.3 Produrre mutazioni
Approfondimento 3.1 Età paterna e mutazioni nell’uomo
3.3.1 I mutageni chimici modificano o sostituiscono le basi
nucleotidiche
3.3.2 Le radiazioni inducono rotture cromosomiche
e riarrangiamenti strutturali
3.3.3 I mutageni inserzionali sono i più utili in laboratorio
3.3.4 Gli elementi trasponibili sono mutageni efficienti
nell’indurre mutazioni in singoli geni
3.3.5 Riassunto degli effetti mutageni
3.3.6 Trovare le mutazioni
Caso studio 3.1 – Parte 1 Trovare un mutante: la segmentazione
nell’embrione di Drosophila
3.3.7 La caccia ai mutanti può incontrare difficoltà ben
conosciute
3.3.8 Come posso ridurre il numero d’individui F1 e F2
da esaminare?
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VIII Indice
3.3.9
Che cosa fare se la mutazione a cui siamo interessati ha
un fenotipo letale?
Caso studio 3.1 – Parte 2 Trovare un mutante: la segmentazione
negli embrioni di Drosophila
3.3.10 Che cosa succede se la mutazione influisce su fenotipi
diversi?
Approfondimento 3.2 Cromosomi bilanciatori e screen genetici
3.3.11 Che cosa succede se il fenotipo mutante è visibile solo in
alcuni individui omozigoti mutanti?
3.3.12 Che cosa succede se non si osserva alcun fenotipo
mutante?
Sommario
Il capitolo in pillole
4 Classificare i mutanti
Introduzione
4.1 Classificare i mutanti: una panoramica
4.2 Mappatura dei mutanti nei locus genici
4.2.1 Un mutante può essere mappato mediante ricombinazione
4.2.2 Tramite ricombinazione i geni sono anche posizionati
uno rispetto all’altro
Approfondimento 4.1 Mappatura dei geni umani
4.2.3 Una mutazione può essere mappata utilizzando delezioni
e duplicazioni
4.3 Assegnare le mutazioni ai geni con il test
di complementazione
4.3.1 Il test di complementazione può essere utilizzato
per realizzare uno screen alla ricerca di nuovi alleli
di un gene
4.3.2 È possibile valutare statisticamente il numero totale
dei geni che potrebbero essere identificati da una
procedura di mutagenesi
4.3.3 In genere, i nomi dei geni derivano dai fenotipi mutanti
ma non sempre
Caso studio 4.1 – Parte 1 Trovare un mutante: la segmentazione
nell’embrione di Drosophila
Approfondimento 4.2 Stima del numero dei geni
Caso studio 4.1 – Parte 2 Trovare un mutante: la segmentazione
nell’embrione di Drosophila
4.4 Classificazione dei mutanti
4.4.1 Le mutazioni recessive generalmente determinano
una perdita o riduzione della normale funzione del gene
Approfondimento 4.3 Riflessioni sulla dominanza
Approfondimento 4.4 Mutazioni nel gene della microftalmia
nel topo, una serie allelica
Caso studio 4.1 – Parte 3 Trovare un mutante: la segmentazione
nell’embrione di Drosophila
4.4.2 Alleli nulli e ipomorfi di un gene possono essere inseriti
in una serie allelica
Approfondimento 4.5 Mutazioni nel gene microphthalmia
nel topo: mutazioni dominanti
4.4.3 Le mutazioni condizionali sono spesso ipomorfe
4.4.4 In genere, i mutanti dominanti danno luogo a una
sovrapproduzione della funzione normale
4.4.5 Anche mutazioni che provocano la comparsa di funzioni
insolite possono essere dominanti
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Indice IX
4.4.6
I mutanti aploinsufficienti sono dominanti e definiscono
geni dose-dipendenti
Un’analogia volta a riassumere gli effetti delle mutazioni
4.4.7
Sommario
Il capitolo in pillole
5 Collegare un fenotipo a una sequenza di DNA
Introduzione
5.1 Clonare i geni: una panoramica
5.2 Proprietà 1: clonaggio posizionale
5.2.1 Localizzazione di un gene rispetto a marcatori e geni
clonati
5.2.2 Clonaggio della regione tra due marcatori molecolari
Approfondimento 5.1 Mappatura per associazione:
geni per malattie umane e variabilità naturale in Arabidopsis
5.3 Proprietà 2: transposon tagging
5.4 Proprietà 3: recupero fenotipico da trasformazione
5.5 Proprietà 4: clonaggio basato sull’espressione
5.5.1 Clonaggio basato sull’espressione di RNA
5.5.2 Clonaggio basato sull’espressione di proteine
5.5.3 Clonaggio basato su fenotipo ed espressione:
enhancer trap
5.5.4 Riassunto
5.6 Proprietà 5: omologia
Caso studio 5.1 Clonaggio posizionale del gene della fibrosi
cistica nell’uomo
Caso studio 5.2 Clonaggio del gene patched di Drosophila
Approfondimento 5.2 Dedurre l’omologia dalla similitudine
di sequenza
Sommario
Il capitolo in pillole
6 Trovare il fenotipo mutante dei geni clonati
Introduzione
6.1 Panoramica della genetica inversa, dell’alterazione genica
e della sostituzione genica mirata
6.1.1 La genetica inversa affronta problematiche leggermente
diverse da quelle della genetica classica
6.1.2 Con la genetica inversa applicata al lievito e al topo,
un gene clonato viene inserito in un sito specifico
del genoma
6.2 Inserzioni geniche mirate nel lievito
Approfondimento 6.1 Inserzione genica mirata in Drosophila
6.3 Inattivazione genica mirata nel topo (knock-out)
6.3.1 Cellule staminali embrionali possono generare embrioni
di topo
6.3.2 Le cellule ES possono essere modificate per inserzione
genica usando sia la selezione positiva sia quella negativa
6.3.3 La possibilità di generare knock-out ha cambiato
la genetica del topo
6.3.4 I geni possono essere inattivati con il sistema Cre-lox
o altri sistemi di ricombinazione sito-specifica
Caso studio 6.1 Mutazioni knock-out nel gene patched di topo
6.3.5 Mutazioni tessuto-specifiche possono essere introdotte
regolando l’espressione della Cre
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X Indice
6.3.6
Le mutazioni knock-out sostituiscono la regione
codificante con una funzione alterata
Tecniche alternative di ricombinazione sito-specifica
6.3.7
Sommario
Il capitolo in pillole
7 Screen genomico di mutanti
Introduzione
7.1 Screen genomici di mutanti: una panoramica
7.1.1 Gli screen genomici possono identificare nuovi geni anche
in processi biologici già ben descritti
7.2 Identificare i geni da mutare
Approfondimento 7.1 La predizione dei geni
7.3 Inattivare e alterare i geni
7.3.1 Lo screen su scala genomica nel lievito è stato realizzato
mediante inattivazione genica mirata
7.3.2 Codici a barre molecolari
Approfondimento 7.2 I codici a barre molecolari (molecular bar
codes)
7.4 RNA interference e analisi di mutanti su larga scala
7.4.1 Antecedenti dell’RNAi in altri esperimenti
Approfondimento 7.3 microRNA regolativi
7.4.2 Introduzione del dsRNA in cellule o organismi
7.4.3 Meccanismi dell’RNAi
7.4.4 Limiti dell’RNAi
7.4.5 Il problema della reattività crociata
Approfondimento 7.4 RNAi nelle cellule di mammifero
7.5 Screen di fenotipi mutanti
7.6 Conferma degli effetti
7.7 Insegnamenti degli screen genomici
7.7.1 Lezione 1. Identificazione di nuovi geni anche per
processi ben studiati
7.7.2 Lezione 2. Molti geni non hanno un fenotipo mutante
Sommario
Il capitolo in pillole
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Parte 3 Attività genica
8 Analisi molecolare dell’espressione genica
Introduzione
8.1 Analisi molecolare dell’espressione genica: una panoramica
8.2 Analisi dell’espressione dell’RNA codificato da singoli geni
8.2.1 Il Northern blotting è importante per identificare le varietà
e le dimensioni dei trascritti espressi da un dato gene
8.2.2 La RT-PCR è un altro metodo ampiamente utilizzato
per analizzare la trascrizione dei singoli geni anche
quando i trascritti sono poco abbondanti
8.2.3 L’ibridazione in situ permette di identificare la sede
d’espressione del trascritto nel campione istologico
in esame
Approfondimento 8.1 Metodi di PCR quantitativa
8.2.4 I geni reporter possono essere usati in modo specifico
per monitorare la trascrizione
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Indice XI
8.3
8.4
8.5
8.6
Caso studio 8.1 Analisi molecolare dell’espressione genica
durante la segmentazione di Drosophila
8.2.5 Una buona proteina reporter può essere facilmente
monitorata e quantificata
8.2.6 I costrutti reporter includono la maggior parte
delle sequenze regolatrici del gene di interesse
8.2.7 I geni reporter trascrizionali sono utili per determinare
l’importanza di specifiche sequenze regolatrici necessarie
per la trascrizione
8.2.8 L’impiego dell’enhancer trap rappresenta una delle
possibili applicazioni dei reporter trascrizionali
Analisi dell’espressione di proteine codificate da un singolo
gene
8.3.1 Gli anticorpi possono essere impiegati per monitorare
l’espressione di una proteina
8.3.2 Il Western blotting utilizza gli anticorpi per studiare
l’espressione di una proteina negli estratti cellulari
8.3.3 L’immunofluorescenza usa anticorpi contro la proteina
di interesse per monitorarne l’espressione in campioni
fissati
8.3.4 I geni reporter traduzionali possono essere impiegati
per monitorare l’espressione delle proteine
I profili d’espressione delle proteine e degli RNA non sempre
coincidono
8.4.1 Il movimento della proteina SHORT-ROOT nelle radici
di Arabidopsis
8.4.2 Il movimento della proteina controlla l’inizio riproduttivo
di Arabidopsis
I microarray e l’analisi trascrizionale su scala genomica
8.5.1 I microarray registrano simultaneamente il profilo
d’espressione di molti geni
8.5.2 I microarray sono versioni modificate del Northern
blotting, in grado di determinare simultaneamente i profili
di trascrizione di migliaia di geni
8.5.3 I microarray a due canali sono coibridizzati con due
campioni bersaglio marcati differentemente
8.5.4 I microarray a un solo canale sono ibridizzati
con un singolo campione bersaglio
8.5.5 Confronto fra array a un canale e array a due canali
8.5.6 Numerosi avanzamenti tecnici hanno aumentato
la tipologia, la sensibilità, la stringenza e la riproducibilità
degli esperimenti con i microarray
Interpretare i dati dei microarray
8.6.1 Il processo di normalizzazione corregge i valori numerici
grezzi d’espressione per eliminare i possibili artefatti
sperimentali
8.6.2 I dati normalizzati vengono analizzati statisticamente per
identificare quei geni la cui espressione differisce in modo
significativo tra i campioni e tra i cluster di geni
coespressi
8.6.3 Analisi funzionale dei dati dei microarray
8.6.4 I microarray possono aiutare a identificare geni
precedentemente ignoti, coinvolti funzionalmente
in un dato processo biologico
8.6.5 I profili d’espressione possono diventare marcatori
biologici applicabili alla ricerca e alla medicina
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XII Indice
Caso studio 8.2 Microarray e profili d’espressione delle cellule
tumorali
8.6.6 I microarray possono aiutare a rispondere a domande
circa la struttura e l’espressione dei geni
8.7 Altri saggi per lo studio dell’espressione su scala genomica
8.7.1 Il sequenziamento degli RNA su larga scala è un metodo
alternativo ai microrray
8.7.2 Gli approcci di proteomica possono essere usati
per lo studio globale dell’espressione proteica
8.8 Quanto è biologicamente significativo un cambiamento
nell’espressione genica?
8.8.1 Livello del rumore di fondo biologico
Sommario
Il capitolo in pillole
9 Uso dei mutanti per l’analisi dell’attività genica
Introduzione
9.1 Analisi dell’attività genica mediante mutanti: una panoramica
9.2 Interpretare i fenotipi mutanti
9.2.1 Mutazioni letali causano un arresto dello sviluppo
dell’organismo in particolari stadi
9.2.2 Le mutazioni possono colpire cellule, tessuti e organi
differenti
9.3 Mutazioni condizionali e momento dell’attività genica
9.3.1 Esperimenti che utilizzano cambi di temperatura possono
aiutarci a definire il tempo approssimativo in cui compare
l’attività genica
Approfondimento 9.1 HSP90 esercita un effetto tampone contro
i cambiamenti genetici e ambientali
9.3.2 Il ciclo cellulare del lievito è stato analizzato utilizzando
mutanti termosensibili
9.4 Analisi dei mosaici e localizzazione dell’attività genica
9.4.1 Le chimere sono il risultato di una manipolazione fisica
delle cellule
Caso studio 9.1 Analizzare i periodi termosensibili
9.4.2 I marcatori cellula-autonomi sono utilizzati per analizzare
l’attività di altri geni
9.4.3 Gli organismi mosaico sono generati attraverso l’impiego
di varie differenti tecniche genetiche
9.4.4 Organismi mosaico possono essere generati in C. elegans
dalla perdita di un frammento cromosomico
9.4.5 Costruzione di mosaici in Drosophila dovuti a perdita del
cromosoma X
9.4.6 Molte delle analisi di mosaici in Drosophila si basano
sul crossing-over somatico
Caso studio 9.2 Analisi dei mosaici relativi all’espressione
di patched nell’ala
9.4.7 Il crossing-over somatico può essere utilizzato anche
per stimare il tempo dell’attività genica
9.4.8 L’analisi del mosaico può fornire altre informazioni circa
l’attività genica e lo sviluppo normale dell’organismo
9.4.9 Il mosaicismo può essere indotto anche in organismi
transgenici
Sommario
Il capitolo in pillole
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Indice XIII
Parte 4 Interazioni geniche
10 Usare un gene per trovarne altri
Introduzione
10.1 Usare un gene per trovare altri geni coinvolti nello stesso
processo biologico: una visione generale
10.2 Usare un fenotipo mutante come strumento per trovare geni
tra loro funzionalmente correlati
10.2.1 I soppressori e gli enhancer modificano il fenotipo di
un’altra mutazione
Caso studio 10.1 – Parte 1 Analisi genetica della morfogenesi del
fuso nel lievito gemmante
10.2.2 La nomenclatura dei geni di soppressione e degli enhancer
può generare confusione
10.3 Mutazioni di soppressione: più simili al selvatico
10.3.1 Le mutazioni di soppressione possono essere intrageniche
o extrageniche
Approfondimento 10.1 Una strategia generale per mappare
un soppressore
10.3.2 I soppressori extragenici possono essere raggruppati in tre
classi funzionali
10.3.3 I soppressori d'interazione sono specifici sia per il gene
sia per l’allele
10.3.4 I soppressori informazionali influenzano la lesione
molecolare dell’allele specifico, ma non riguardano
la funzione del gene
10.3.5 I soppressori gene-specifici influenzano molti differenti
alleli di un gene ma generalmente nessuno
o pochi altri geni
10.3.6 La soppressione per alto numero di copie coinvolge l’uso
di un gene selvatico clonato
Caso studio 10.1 – Parte 2 Analisi genetica della morfogenesi
del fuso nel lievito gemmante
10.4 Enhancer sintetici: mutazioni di modificazione che rendono
più severo il fenotipo della mutazione originale
Caso studio 10.1 – Parte 3 Analisi genetica della morfogenesi
del fuso nel lievito gemmante
10.4.1 Gli enhancer sintetici corrispondono a mutazioni
che intensificano l’effetto della mutazione originale
10.4.2 L’enhancement sintetico può coinvolgere geni paraloghi
o duplicati
10.4.3 L’enhancement sintetico e la soppressione per bypass
possono rappresentare due facce della stessa medaglia
10.4.4 L’enhancement sintetico può riguardare vie biologiche
parallele
10.4.5 La non-complementazione non-allelica riguarda un tipo
di enhancement sintetico che avviene quando entrambe
le mutazioni sono in eterozigosi
Approfondimento 10.2 Non-complementazione non-allelica
Caso studio 10.1 – Parte 4 Analisi genetica della morfogenesi
del fuso nel lievito gemmante
10.5 Riassunto: trovare geni tra loro correlati usando fenotipi
mutanti
10.6 Usare un gene clonato per trovare altri geni coinvolti
nello stesso processo biologico
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XIV Indice
10.6.1 Il saggio dei due ibridi nel lievito utilizza un approccio
genetico per scoprire interazioni proteina-proteina
Caso studio 10.1 – Parte 5 Analisi genetica della morfogenesi
del fuso nel lievito gemmante
10.6.2 Il saggio dei due ibridi nel lievito è stato usato per
esaminare il segnale del brassinosteroide di Arabidopsis
10.6.3 La co-immunoprecipitazione è un metodo standard per
studiare le interazioni proteina-proteina
10.6.4 Forza delle interazioni proteiche: un esempio preso
dalla patologia vegetale
Sommario
Il capitolo in pillole
11 Epistasi e vie genetiche
Introduzione
11.1 Epistasi e vie genetiche: una panoramica generale
11.1.1 La logica dell’epistasi richiede una particolare attenzione
11.2 Combinare i mutanti con i saggi molecolari d’espressione
11.2.1 Una mutazione di ptc modifica il profilo d’espressione
di altre proteine espresse nell’ala
11.3 Epistasi e vie genetiche
11.3.1 Nel lievito gemmante, la regolazione generale
della biosintesi degli aminoacidi è controllata da due tipi
di gene
11.3.2 La determinazione del sesso in C. elegans coinvolge
interazioni sia positive sia negative
11.3.3 Le vie negative coinvolgono mutazioni con fenotipi
opposti
11.3.4 Le vie positive coinvolgono mutazioni con fenotipi simili
11.3.5 Usare le sottili differenze tra i fenotipi dei mutanti
11.3.6 Illustrare le vie positive usando esempi di natura
non-biologica
11.3.7 Ritorniamo alla determinazione del sesso nelle cellule
somatiche
11.3.8 Usare un allele dominante per confermare i dati
11.3.9 La via dedotta dall’analisi epistatica può aiutare
a programmare altri esperimenti per comprendere
la determinazione del sesso
11.3.10 L’analisi epistatica ha limitazioni note
Caso studio 11.1 Epistasi e la via di patched
11.4 Una via complessa è responsabile dello sviluppo della larva
dauer in C. elegans
11.4.1 L’analisi di soppressione è stata usata per trovare altri geni
che influenzano la formazione della dauer
11.4.2 Le interazioni tra mutazioni dauer non sono sempre
semplici da interpretare
11.4.3 Gli enhnacer sintetici sostengono l’ipotesi delle due vie
11.4.4 Le due vie hanno passaggi comuni
11.5 La via svelata
Il capitolo in pillole
12 Vie, reti e sistemi
Introduzione
12.1 Vie, reti e sistemi: una panoramica
12.1.1 La biologia dei sistemi è resa possibile dalla genomica
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Indice XV
12.2 Proprietà delle reti: background e definizioni
12.2.1 La rete può essere utilizzata per dedurre le funzioni
dei suoi componenti
12.2.2 Le reti biologiche non possono essere descritte
presumendo un numero casuale di connessioni tra i nodi
12.2.3 La definizione di hub è nota da altre reti
12.3 Interazioni tra i fattori di trascrizione e le sequenze di DNA
12.3.1 Identificazione delle interazioni tra i fattori di trascrizione
e i loro siti di legame
12.3.2 L’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un
approccio basato sulle proteine per rilevare siti di legame
in tutto il genoma
12.3.3 I saggi di ChIP su scala genomica hanno dato finora
la maggior parte delle informazioni sulla regolazione
trascrizionale di lievito
12.3.4 Il saggio del monoibrido nel lievito è un approccio
centrato sul gene per identificare i fattori di trascrizione
che legano specifiche regioni regolative
12.3.5 Gli approcci computazionali genomici per trovare
le interazioni regolative sono promettenti, ma necessitano
un miglioramento
12.4 Interazioni tra proteine
12.4.1 Gli interattomi rivelano possibili funzioni per geni
non noti
12.4.2 La rete di proteine è rappresentata da un grafico
12.4.3 Gli hub hanno proprietà biologiche importanti
12.5 Hub e robustezza
12.5.1 La robustezza ha numerose origini possibili
12.5.2 La robustezza è fondamentale per l’evoluzione
12.6 Limitazioni degli interattomi
12.7 Reti di regolazione genica
12.7.1 Una rete di letalità sintetica è il miglior progresso verso
una rete completa di un tipo di interazione genetica
Caso studio 12.1 Un’analisi di sistema della via di segnalazione
del TGF-β in C. elegans
12.7.2 I risultati di screen per letalità sintetica sono comparabili
ai risultati ottenuti per singoli geni
12.8 Robustezza, interazioni e fattori di rischio: speculazioni
12.8.1 Le interazioni genetiche potrebbero influire sul rischio
di sviluppare molte malattie genetiche
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Crediti
C1
Glossario
G1
Indice analitico
I1
