Sviluppo di un Ideotipo di Tabacco per la produzione di Seme da

Sviluppo di un Ideotipo di
Tabacco per la produzione di
Seme da usare a fini Energetici
Corrado Fogher
Via Staffolo, 60 - 26041 Vicomoscano
(CR) - Italy
Semi oleaginosi
Secondo il D.M. 9/8/1995 per semi
oleaginosi si intendono:
Arachide, Canapa, Cartamo, Colza, Cotone,
Girasole, Lino, Papavero, Ravizzone,
Ricino, Senape, Sesamo, Soia
Tabacco
• Sorprendentemente il tabacco non è mai stato
considerato una “oleaginosa”:
–
–
–
–
Ha il potenziale per produrre grandi quantità di seme/ha
Ha un seme con il 39-41% olio
E’ una specie agraria conosciuta e molto coltivata
Ha la capacità di crescere su terre marginali
• Infatti il tabacco è coltivato
solo per le foglie, ed è stato
selezionato per ridurre la
quantità si seme prodotta.
• Questo significa che c’è la
possibilità di un notevole
miglioramento della caratteristica
“produzione di seme”.
1997-2003: Glucocerebrosidasi (Gaucher)
Fase preclinica
1998-2001:
1999-2001:
2002-2003:
2002-2003:
2003-2004:
2003-2004:
2004:
2004:
Lattoferrina umana
TAT (replicasi HIV)
α-Galattosidasi (Fabry)
Trombopoietina
α-Glucosidasi (Pompe)
α-1-Antitripsina (deficit polmonare)
Sfingomielinasi (Neimman-Pick)
APO-1 Milano
2002: Linee di tabacco “umanizzate” nel pattern
di glicosilazione
Heterologous proteins production in tobacco
Yield of seed:
500 kg/ha
Yield of protein:
100 kg/ha
Yield of heterologous
protein:
500 g/ha
Cost of production:
2,500 $
Cost of purification: 120,000 $
Ideotipo Tabacco
da Seme
• L’ideotipo di pianta per la
produzione di seme è:
–
–
–
–
–
Altezza 120-140 cm
Sistema radicale profondo
Foglie lanceolate strette ed erette
Stelo robusto con internodi lunghi
Ciclo vegetativo breve (doppio
raccolto)
– Numero di fiori e capsule > 100
– Capsule contenenti > 5.000 semi
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Mutagenesi chimica
Ibridazione intraspecifica
Ibridazione interspecifica
e poliploidizzazione
Variabilità somaclonale
Ingegneria genetica
Ingegneria metabolica
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Mutagenesi chimica
EMS
M1 – M2 – M3
- Forma foglia
- Tricomi gum
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Ibridazione intraspecifica
Incroci tra materiali
Americani, orientali ecc.
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Ibridazione interspecifica
e poliploidizzazione
Incroci tra specie a numero di
cromosomi uguale o diverso
seguito da reincrocio o induzione di
allopoliploidi con colchicina o
formazione di germogli da calli
Origine del
Tabacco
Nicotiana tabacum 2n=4x=48 Allotetraploide antico
Genitore materno, donatore del genoma S
N. sylvestris 2n=2x=24
Genitore paterno, donatore del genoma T
N. tomentosiformis 2n=2x=24
N. otophora 2n=2x=24
Ibrido di introgressione tra i due
Anche se nelle Solanaceae non esistono più specie
con numero base dei cromosomi =6, questo sicuramente è
il numero base a livello evolutivo iniziale seguito da fenomeni
di Anfiploidia e successiva differenziazione.
Specie diverse di
Tabacco
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
N. gossei
2n = 36
Origine del
Tabacco
N. langsdorffii
2n = 18
Origine del Tabacco
N. rustica
2n = 48
Origine del Tabacco
N. quadrivalvis
2n = 48
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
Origine del
Tabacco
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Ingegneria genetica
Tecnologia del DNA ricombinante
Trasformazione genetica con
Agrobacterium
Linee transgeniche
-Resistenza agli insetti
(Bt e Kunitz)
-Resistenza ai diserbanti:
-Glifosate (AroA)
-Glufosinate ammonio
(BAR e PAT)
Tabacco geneticamente modificato
resistente a Spodoptera (PC, 1995)
Trasformazione
Genetica Tabacco
PLT103 - N. tabacum
PLT112 - N. rustica
PLT18 – N. quadrivalvis
PLT20 – N. noctiflora
PLT37 – N. debneyi
PLT42 – N. arentsii
PLT49 – N. paniculata
PLT51 – N. rustica
PLT56 – N. setchelli
Tecniche utilizzate
per la selezione
“Tabacco da Seme”
Ingegneria metabolica
Contenuto
In olio
Composizione
In acidi grassi
dell’olio
Golden
Rice
Metabolic engineering
of Tobacco
By way of example, the oil quantity and the
fatty acids composition of the same,
may be modified by modifying the expression
of genes coding for enzymes
such as, merely by way of example:
1. acetyl-CoA carboxylase (ACCase),
2. diacyl-glycerol acyltransferase (DGAT),
3. lysophosphatidate acyl transferase (LPAT),
4. Phosphatidate phosphohydrolase (PAPase)
5. acyl protein carrier (ACP),
6. malonyl-CoA:ACP transacylase,
7. ketoacyl-ACP synthase (KAS),
8. ketoacyl-ACP reductase,
9. 3-hydroxyacyl-ACP dehydrase,
10. enoyl-ACP reductase,
11. stearoyl-ACP desaturase,
12. acyl-ACP thioesterase,
Caratteri a base
genetica
- Numero capsule
- Dimensioni capsule
- N° semi per capsula
- N° foglie
- Altezza pianta
- Contenuto olio
- Composizione olio
- Ecc.
Usi del Seme di
Tabacco
• Fonte Energetica
– Olio
– Panello
• Farmaci prodotti
in pianta
–
–
–
–
Conservazione
Facilità estrazione
Alto livello di espressione
Non necessità di
lavorazione biomassa
fogliare
Tabacco come
pianta da olio
Confronto con le piante energetiche Europee
a
Colza
Girasole
Soia
Tabacco
Produzione Seme (T/ha)
3,3a
1,9 a
1,5-3,3 a
5,7 b
% Olio nel Seme
33,2-47,6 %
32-45 %
21-22 %
39-41 %
Produzione Olio (T/ha)c
0,88-1,14
0,49-0,68
0,25-0,58
1,77-1,87
Densita’ (kg/L)
0,9115
0,9161
0,9138
0.,9286
Volume Olio estratto (L/ha)
965-1.250
534-742
274-635
1.906-2.013
Based on 2004 average EU-25 production (from “Agriculture in the European Union Statistical and economic information 2005”)
b Based on field trials of improved high-yielding tobacco varieties in Italy.
c Assuming 80% extraction efficiency
Composizione in acidi
grassi: Tabacco vs. altri
Oli Vegetali U.E.
FA name
caproic acid
caprylic acid
capric acid
Lauric acid
myristic acid
Palmitic acid
Palmitoleic acid
margaric acid
Margaroleic acid
Stearic acid
Oleic acid
Linoleic acid
Linolenic acid
Arachidic acid
Eicosenoic acid
Eicosadienoic acid
Behenic acid
Erucic acid
Lignoceric acid
FA struc Tobacco Oil Rapeseed Oil Sunflower Oil Soybean Oil
C6:0
ND
ND
ND
ND
C8:0
ND
ND
ND
ND
C10:0
ND
ND
ND
ND
C12:0
ND
ND
ND-0.1
ND-0.1
C14:0
ND
ND-0.2
ND-0.2
ND-0.2
C16:0
8.0-9.7
1.5-6.0
5.0-7.6
8.0-13.5
C16:1
0.1-0.2
ND-3.0
ND-0.3
ND-0.2
C17:0
ND
ND-0.1
ND-0.2
ND-0.1
C17:1
ND
ND-0.1
ND-0.1
ND-0.1
C18:0
2.4-3.2
0.5-3.1
2.7-6.5
2.0-5.4
C18:1
10.6-12.1
8.0-60.0
14.0-39.4
17.0-30.0
C18:2
75.0-76.8
11.0-23.0
48.3-74.0
48.0-59.0
C18:3
0.9-1.4
5.0-13.0
ND-0.3
4.5-11.0
C20:0
0.1
ND-3.0
0.1-0.5
0.1-0.6
C20:1
0.2
3.0-15.0
ND-0.3
ND-0.5
C20:2
ND
ND-1.0
ND
ND-0.1
C22:0
ND
ND-2.0
0.3-1.5
ND-0.7
C22:1
ND
2.0-60.0
ND-0.3
ND-0.3
C24:0
ND
ND-2.0
ND-0.5
ND-0.5
Data for rapeseed, sunflower, and soybean derived from Codex Standard for Named Veg. Oils, Codex-Stan 210
Data for tobacco generated from analysis of 6 tobacco seed lots by Stazione Sperimentale per le Industrrie degli
Oli e Grassi (Milano, Italy).
0 to 5%
5 to 10%
10 to 30%
30 to 50%
50 to 75%
75 to 85%
Estrazione Olio
Tabacco
•
Estrazione con presse a freddo
– Estrazione superiore 80% del totale presente nel seme, nonostante le
piccole dimensioni
•
1 Tonnellata di seme di tabacco
– Olio estratto: 349 L (324 kg)
– Panello: 10% olio + 35% proteine
Uso del Panello
Usi Potenziali Olio
di Tabacco
• Componente miscele per
Bio-diesel
• Olio combustibile
• Fonte altamente produttiva di
acido linoleico
– Salute, saponi, emulsionanti,
linoleum, oli ad asciugatura
rapida
• Fonte di glicerina e acidi
grassi
• Potenziale olio alimentare
(non contiene nicotina)
Principali caratteristiche dell’olio di tabacco(1)
Analisi Olio di Tabacco
Punto di Infiammabilita'
Densita' a 15
o
Viscosita a 40
Composizione Acidi Grassi:
UNI EN ISO 2719-05
UNI EN ISO 12185-99
o
UNI EN ISO 3104-00
Punto di scorrimento (automatico)
Numero di acidita'
Idrogeno
Potere Calorifico Inferiore
Fosforo
Potassio
ISO 3016-94
ASTM D 664
ASTM D 5291-07
ASTM D 240-07
UNIEN14107
UNIEN14538
o
ƒ 75%-77% acido linoleico
258 C
3
928,6 kg/m
2
32,1 mm /s
-21
3,88
11,4
8820
13,8
2,4
o
C
mg KOH/g
% m/m
kcal/kg
mg/kg
mg/kg
ƒ 11%-12% acido oleico
ƒ 8%-10% acido palmitico
ƒ 2%-3% acido stearico
Applicazioni:
ƒ Produzione di biodiesel in impianti di prima e seconda
generazione
ƒ Cogenerazione energia elettrica e termica
ƒ Applicazioni industriali
(1) Prove sperimetali effettuate presso la Stazione Sperimentale per i Combustibili (gennaio 2008)
6
Esperienze di
semina diretta del
Tabacco
Ray Long – Crop Science Dept., N.C. State
University.
Investimento 3.500.000/ha, 482 g/ha di seme,
considerando 10.000 semi per grammo,
85% germin., 85% sopravvivenza.
Produzione biomassa: 146 T/ha, 29,2 T/ha
SS, 4 sfalci.
M.K. Chakraborty – Dept. Biochemistry,
Anand Agric. University, India.
300.000/ha, 500 g/ha, e raccolte successive
di piante (83, 117, 160 DAS) per arrivare
alla densità indicata, produzione totale
150,5 T/ha
Esperienze di
semina diretta del
Tabacco
Corrado Fogher – Istituto Botanica e
genetica, Università Cattolica,
Facoltà Agraria, PC.
Investimento 250.000/ha, 30 g/ha di
seme, considerando 10.000 semi
per grammo, 98% germin., 85%
sopravvivenza.
Idrosemina.
Idro Semina
Ditta Casella, www.casella.it
…
…
…
…
…
Company specialising in plant-based biotechnology
Created in 1995, Plantechno's facilities include 1500 m2 of laboratory,
growth room, and research facilities, 400 m2 of greenhouse space
Patents on technology to express human therapeutic and nutraceutical
proteins in plants, and reduction of the allergenic potential of certain
foods.
Development of platform technologies
… chloroplast expression of transgenes in cereals, modification of
Agrobacterium virulence factors
Participation in Past EU projects (Oliv-Track, DNA-Track, EURice)
Laboratory
Protein purification room
(0°C to 15°C)
Protezione intellettuale
• Brevetti depositati
Nazionale
RM2007A000129 – Piante di tabacco mutagenizzate come
coltura da seme per la produzione di olio da usare ai fini
energetici, industriali e alimentari – 14/03/2207
Internazionale
PCT/IB2007/053412 – Mutagenized tobacco plant as seed
culture for the production of oil for energetic, industrial and
alimentary uses – 27/08/2007
Direttiva 98/44/CE
D.L. 10 gennaio 2006, n.3
Protezione intellettuale
• La nuova specie agraria “Tabacco da
seme” è protetta da brevetto
Risponde ai requisiti:
– Novità
– Attività inventiva
– Applicabilità industriale
Protezione intellettuale
•
La nuova specie agraria “Tabacco da seme” è
protetta da brevetto
Requisito di Novità:
Il materiale biologico, pur essendo già esistente in natura,
non è ancora identificato nei suoi caratteri e nella sua
funzionalità
1. Un elemento naturale è stato modificato da un intervento di
ingegneria genetica ed è pertanto nuovo
2. Il risultato della attività di ricerca è un prodotto preesistente,
non modificato dall’uomo, ma semplicemente identificato nelle
sue caratteristiche funzionali, isolato e reso utilizzabile
Protezione intellettuale
•
La nuova specie agraria “Tabacco da seme” è
protetta da brevetto
Requisito di Novità: Oli di Semi
L’olio ottenuto dalla estrazione a mezzo solvente o dalla
pressione meccanica di semi oleosi.
O.M. 6.6.1985
D. M. 9.8.1995
Per semi oleaginosi s’intendono:
arachide, canapa, cartamo, colza, cotone, girasole, lino,
papavero, ravizzone, ricino, senape, sesamo e soia.
Protezione intellettuale
•
La nuova specie agraria “Tabacco da seme”
è protetta da brevetto
Requisito di Attività inventiva
Valutare se l’invenzione è ovvia per una persona
esperta nel settore
L’esaminatore EPO fa le seguenti considerazioni:
1. Era necessario combinare parecchi campi non
strettamente correlati per arrivare all’invenzione
2. L’invenzione mostra un inaspettato vantaggio
3. L’invenzione supera un pregiudizio tecnico generale
Protezione intellettuale
• La nuova specie agraria “Tabacco da
seme” è protetta da brevetto
Requisito di Applicabilità industriale
Un risultato della ricerca è applicabile
industrialmente quando nel brevetto è
indicata la sua utilizzazione
Protezione intellettuale
•
La nuova specie agraria “Tabacco da seme”
è protetta da brevetto
D.L. 3/2006
Art. 3:
E’ brevettabile un’invenzione riguardante piante
ovvero un insieme vegetale, se la loro
applicazione non è limitata, dal punto di vista
tecnico, all’ottenimento di una determinata
varietà vegetale e non siano impiegati per il loro
ottenimento soltanto procedimenti
essenzialmente biologici.
Protezione intellettuale
•
La nuova specie agraria “Tabacco da seme”
è protetta da brevetto
D.L. 3/2006
Art. 5:
L’utilizzo da parte dell’agricoltore, per la
riproduzione o la moltiplicazione in proprio nella
sua azienda, di materiale brevettato di origine
vegetale, avviene nel rispetto di quanto previsto
dall’art. 14 del Regolamento CE 2100/94.
Protezione intellettuale
La nuova specie agraria “Tabacco da seme” è protetta da brevetto
Regolamento CE 2100/94
Art. 14:
1. In deroga all’art. 13 e ai fini della salvaguardia della produzione agricola,
gli agricoltori sono autorizzati ad utilizzare nei campi a fini di
moltiplicazione, nelle loro aziende, il prodotto del raccolto che hanno
ottenuto piantando, nelle loro aziende, materiale di moltiplicazione di una
varietà… che benefici di una privativa comunitaria per ritrovati vegetali.
2. Le disposizioni del paragrafo 1 si applicano unicamente alle specie di
piante agricole di:
a)
Piante da foraggio (8-10 specie)
b)
Cereali (9 specie)
c)
Patate
d)
Piante da olio e da fibra:
Brassica napus – Colza
Brassica rapa – Rapa
Linum usitatissimum – Lino da seme
Telerilevamento del
Tabacco da Seme