Diffusione degli xenobiotici nell’organismo
•
•
•
•
•
•
•
•
Il movimento degli xenobiotici nei fluidi biologici e attraverso le membrane biologiche avviene
principalmente per diffusione (passiva).
Il passaggio attraverso le membrane è lo step limitante la velocità di diffusione globale. La
diffusione avviene secondo la legge di Fick:
velocità di diffusione = D x P x A x (c1 – c2)
o flusso molare (moli/sec) d
c1 - c2 = gradiente di concentrazione (moli/l) con c1>c2
D = coefficiente di diffusione (cm2/sec)
P = coefficiente di ripartizione olio/acqua
A = area (della membrana) (cm2)
d = spessore (della membrana) (cm)
DxP = coefficiente di permeabilità
d
Gradiente di concentrazione
La velocità di diffusione dipende dal gradiente di
concentrazione; nel tempo, le 2 concentrazioni
tendono ad equilibrarsi ⇒ diminuisce la velocità di
diffusione ⇒ cinetica di I ordine.
Situazione di equilibrio
c1 = c2
25
Coefficiente di permeabilità
•
•
A parità di gradiente di concentrazione, la velocità di diffusione di sostanze diverse è determinata
dal loro coefficiente di permeabilità.
Il coefficiente di permeabilità attraverso una membrana è determinato dal coefficiente di
diffusione soluzione/membrana, dalle caratteristiche chimico-fisiche della molecola (coefficiente
di ripartizione olio-acqua) e dalla membrana
coefficente di permeabilità = D (c. diffusione) x P (c. ripartizione)
d (spessore membrana)
Lipofilia
•
•
•
•
•
•
Essendo le membrane biologiche composte principalmente da lipidi, esse sono attraversate tanto
più velocemente tanto più elevato è il coefficiente di ripartizione lipidi/acqua, ovvero tanto più
elevata è la ‘lipofilia’.
Dato che non è sperimentalmente possibile determinare il coefficiente di ripartizione
membrana/acqua, si è cercato di utilizzare, per predire la velocità relativa di passaggio attraverso le
membrane, i coefficienti di ripartizione ottanolo/acqua o olio/acqua.
In pratica, è possibile solo descrivere in modo qualitativo, e approssimativo, la dipendenza della
velocità di passaggio dalla ‘lipofilia’ del composto.
Molecole ‘molto poco lipofile’ (con coefficiente di ripartizione ‘molto’ basso) hanno una capacità
‘trascurabile’ di attraversare le membrane. Questi composti possono essere ‘altamente’ idrofili (es.
sali, polioli) oppure essere ‘praticamente’ insolubili sia nei lipidi che in soluzioni acquose (es. molti
peptidi e proteine).
Per molecole estremamente lipofile il fattore limitante è la solubilità nelle soluzioni acquose;
queste molecole possono accumularsi nello strato lipidico delle membrane.
In definitiva, la maggiore velocità di passaggio attraverso le membrane si ha con molecole lipofile
ma con un certo grado di idrofilia che permette loro di passare la membrana (es. paracetamolo).
26
pH e coefficiente di ripartizione
•
•
•
•
•
Acidi e basi deboli ed i loro sali possono esistere sia in forma dissociata (più idrofila) che
indissociata (più lipofila). Il rapporto tra le due forme è determinato dai valori di Ka e di pH
(equazione di Henderson-Hasselbach):
pH = pKa + log [A-]/[AH]
Nell’organismo, il pH del sangue e della maggior parte dei fluidi biologici è normalmente vicino a
7,4. Può spostarsi verso valori acidi o basici in diverse condizioni fisiologiche, patologiche o indotte
da farmaci o tossici (acidosi metabolica, alcalosi respiratoria ecc.).
Per sostanze con valori di pKa o pKb vicini al pH del sangue, variazioni anche lievi del pH possono
far variare considerevolmente il rapporto tra specie dissociata e specie indissociata e, quindi, la
capacità di attraversare le membrane.
Il fenobarbital ha un pKa = 7,4. A valori normali di pH ematico (pH=7,4) ⇒ [A-] = [AH]
pH=pKa+log [A-]/[HA] x cui se pKa=7,4 e pH=7,4, [A-]=[HA]
Se il pH si abbassa a 7,2 ⇒ [A-] = 0,63[AH]
se pKa=7,4 e pH=7,2, pH=pKa+log [A-]/[HA] x cui 7,2-7,4= log [A-]/[HA] e quindi -0,2= log[A-]/[HA]
[A-]/[HA]=10-0,2 = 0,63 quindi [A-] = 0,63[AH]
Si ha quindi un aumento della forma indissociata e quindi un aumento della permeabilità attraverso
le membrane ⇒ tossicità
Nel liquido gastrico, e in misura minore nell’urina, il pH è nettamente diverso da quello del sangue
A pH=1-2 fenobarbital è in forma indissociata e anche nelle urine pH=5-7
27
Capacità di attraversare le membrane
28
Altre modalità di attraversamento delle membrane cellulari
1) Trasporto attivo o facilitato.
29
2) Endocitosi libera o mediata da recettori di membrana
Barriere cellulari
•
•
•
Tutti i tessuti sono estesamente irrorati dai capillari sanguigni. Vi è quindi un’ampia superficie di
scambio tra sangue e tessuti.
In genere, tra le cellule dell’endotelio capillare sono presenti dei pori, che permettono il passaggio
dal sangue al tessuto anche di molecole non lipofile. I pori hanno un diametro di circa 10 nm, che
limita o impedisce il passaggio di molte proteine.
In alcuni organi (SNC, occhio, placenta), l’endotelio capillare è praticamente privo di pori. Inoltre, vi
è scarsissima attività di endocitosi. Nel cervello, inoltre, i capillari sono rivestiti da cellule gliali.
A questo livello vi è quindi una barriera (BEE) che inibisce la diffusione di sostanze attraverso la
membrana cellulare.
Farmaci non lipofili non penetrano significativamente nel SNC e non hanno quindi effetti centrali
(farmaco-terapeutici) ad eccezione di sostanze con PM<500 Dalton passano BEE.
Es. antimuscarinici con gruppo ammonico quaternario, carico positivamente come la scopolamina
butilbromuro e l’ipratropio.
30
Il liquido interstiziale nel SNC ha una composizione nettamente diversa da quella di alti tessuti; in
particolare sono praticamente assenti le proteine plasmatiche.
• A livello della barriera emato-encefalica (e di altre barriere) vi sono numerosi sistemi di trasporto,
che consentono il passaggio di sostanze non lipofile necessarie per il metabolismo del SNC (es.
glucosio, aminoacidi, L-Dopa, ecc).
Nell’encefalo circola il liquido cerebro-spinale, che origina dal sangue a livello dei plessi corioidei, dove
l’endotelio capillare è più fenestrato ed è molto più permeabile che in altre regioni del SNC. Farmaci
idrofili possono quindi passare nel LCS. Tuttavia, data la bassa estensione del circolo del LCS, il
passaggio nel liquido interstiziale è limitato.
Esistono inoltre sistemi di trasporto LCS → sangue come i carriers per aminoacidi, glucosio, trasferrin,
insulina, ecc.
•
•
•
Le zone del SNC vicine ai plessi coroidei e alcune regioni periventricolari sono meno protette dalla
barriera emato-encefalica e più sensibili ai farmaci presenti nel sangue (es. CTZ, Chemoreceptor
Trigger Zone, l’area di ‘innesco’ del riflesso del vomito)
In condizioni patologiche (infezioni con infiammazione delle meningi, febbre elevata, aterosclerosi)
si ha una compromissione anatomico-funzionale della barriera emato-encefalica, con aumento
della permeabilità.
31
La barriera placentare
•
•
•
•
Il sangue fetale è separato da quello materno dal sincizio placentare, dall’interstizio villare e dalle
cellule endoteliali dei capillari villari.
A livello del sincizio placentare sono presenti molti sistemi di trasporto e di endocitosi mediata da
recettore (es. transferrina, IgG, peptidi, proteine)
La barriera placentare è meno selettiva di quella emato-encefalica. Inoltre, il sangue materno
circola molto lentamente ⇒ aumenta il tempo di scambio.
Quasi tutti i farmaci (tranne farmaci idrofili di grosse dimensioni molecolari) possono raggiungere il
feto, anche se lentamente e a concentrazioni più basse rispetto a quelle materne.
32
Assorbimento e vie di esposizione
•
•
•
•
•
•
•
Effetti locali e assorbimento sistemico.
Una sostanza che viene a contatto con una certa area del corpo (cute, intestino, polmoni, tessuto
sottocutaneo ecc.) può:
esercitare effetti locali e/o
essere assorbita nel sangue, a livello dei capillari, dopo avere attraversato uno o più strati di cellule
(assorbimento sistemico), ed esercitare quindi effetti su organi distanti dal sito di assorbimento.
Dalla via di assorbimento (o via di esposizione) dipendono:
il tipo di molecole assorbite, in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche; ad esempio, molecole
idrofile non vengono assorbite per via gastroenterica (via enterale) o cutanea;
l’influenza dello stato fisico della sostanza sull’assorbimento (polveri, aerosol, soluzioni ecc.)
la velocità di assorbimento
l’entità dell’assorbimento
Entità e velocità di assorbimento sono parametri differenti; la relazione tra i due parametri è
variabile.
L’entità dell’assorbimento è la quantità di sostanza che viene effettivamente assorbita; tale
quantità non può essere misurata direttamente. Un indice dell’entità è l’area sotto la curva (AUC,
Area Under the Curve) del grafico concentrazione-tempo. L’AUC, tuttavia, dipende anche da altri
parametri (velocità di eliminazione, volume di distribuzione).
Area sotto la curva (AUC) dopo somministrazione endovenosa
•
La velocità dell’assorbimento è la variazione nel tempo della concentrazione del farmaco al sito di
assorbimento (es. fluido intestinale): vass = - δ c/ δ t. Più facilmente, e più praticamente, può essere
definita come la variazione nel tempo della concentrazione nel sangue: vass = δ csangue/ δ t.
La velocità di assorbimento è un processo di I ordine; è quindi proporzionale alla concentrazione
cass del farmaco al sito di assorbimento: vass = δ csangue/δ t = ka x cass
33
•
•
Come detto, l’AUC, che è un indice dell’entità dell’assorbimento, dipende anche dagli altri processi
(distribuzione, eliminazione) che determinano la curva concentrazione-tempo del farmaco. Il valore
dell’AUC è quindi determinato, oltre che dalla velocità di assorbimento, anche dal volume di
distribuzione e dalla velocità di eliminazione.
La relazione tra velocità di assorbimento ed AUC è quindi variabile, in dipendenza dei valori di kel
(costante di eliminazione) e Vd (volume di distribuzione).
Se due sostanze hanno uguale velocità di eliminazione ed uguale volume di distribuzione, quella con
maggiore ka ha anche maggiore AUC:
34
Tuttavia se le due sostanze hanno diversi valori di Kel o di Vd, una maggiore velocità di assorbimento
può non corrispondere ad una maggiore AUC:
•
•
La frazione (o percentuale) della dose che viene assorbita è definita biodisponibilità (F).
F = AUC os
AUC ev
La biodisponibilità dopo somministrazione per una data via (es. orale), può essere valutata dal
rapporto tra l’AUC dopo somministrazione per quella via e l’AUC dopo somministrazione
endovenosa. Nella somministrazione endovenosa non vi è infatti una fase di assorbimento; l’AUC
dopo somministrazione endovenosa corrisponde quindi ad un assorbimento completo
(biodisponibilità = 1, o 100%).
35
Concentrazione di picco (Cmax), tempo di picco (tmax)
•
Il valore della concentrazione plasmatica massima o concentrazione di picco è importante in
quanto indica se lo xenobiotico raggiunge o meno effetti tossici dopo singola esposizione
Il valore di tmax è importante per farmaci che devono avere azione rapida (es. analgesici).
Caratteristiche del sito di assorbimento che influenzano velocità ed entità dell’assorbimento
•
•
•
Estensione della superficie assorbente
Permeabilità della superficie assorbente: spessore e natura dello strato cellulare che separa la
superficie esterna dai capillari: epitelio monostratificato (es., intestino, polmoni), epitelio
stratificato (es. faringe), epitelio stratificato cheratinizzato (cute). La permeabilità può essere
alterata in condizioni patologiche (es. lesioni cutanee)
Vascolarizzazione: es. sottocutanea vs. intramuscolare
36
Epitelio intestinale monostratificato
Caratteristiche dello xenobiotico che influenzano velocità ed entità dell’assorbimento
Lipofilia
Stato fisico: velocità di dissoluzione. L’assorbimento di sostanze presenti in forma solida (polveri,
particolato) o come sospensioni è costituito da 2 fasi:
1) disgregazione-dissoluzione
2) assorbimento attraverso la mucosa
•
•
Disgregazione-dissoluzione
Se il processo di disegregazione-dissoluzione è il passaggio ‘lento’, limitante la velocità complessiva di
assorbimento, i fattori che influenzano il processo di disgregazione-dissoluzione controllano la velocità
dell’intero processo.
In caso di assunzione orale, sostanze che si dissolvono molto lentamente hanno una bassa
biodisponibilità, in quanto vengono evacuati prima di essere assorbiti.
37
La velocità di dissoluzione dipende, per una data sostanza, dalla superficie totale delle particelle
(cristalli) di sostanza. Minori sono le dimensioni delle particelle, maggiore è la superficie, maggiore è
l’assorbimento (biodisponibilità).
Assorbimento gastrointestinale
Estesa superficie assorbente; l’assorbimento avviene prevalentemente nel piccolo intestino, che ha
la superficie maggiore (circa 200 m2) ed il maggior flusso ematico (~ 1 l/min) (stomaco: superficie 1
m2; flusso ematico 0,15 l/min)
Influenza delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza:
Le sostanze anfifiliche (lipofile e idrofile) sono assorbite più estesamente e rapidamente
(diffusione). Per queste sostanze il fattore limitante è il flusso ematico intestinale.
Sostanze che hanno struttura simile a quella di nutrienti possono essere assorbite mediante
trasporto attivo (levodopa, tallio, piombo) ; sostanze idrofile possono essere trasportate anche
mediante trasporto passivo paracellulare (es. PAM).
Sostanze molto lipofile (DDT) possono essere assorbite tramite la ‘via dei lipidi (emulsione con acidi
biliari)
38
39
Fattori che diminuiscono l’assorbimento GI
1) Suscettibilità al pH acido, agli enzimi GI e alla flora intestinale.
• pH. Sostanze acido-labili possono essere inattivate nello stomaco (es. catecolamine, antibiotici).
• Enzimi e flora intestinale. Gli enzimi digestivi ed i batteri della flora intestinale possono
metabolizzare gli xenobiotici proteici; il risultato è in genere la perdita di attività (es. veleno di
serpenti)
2) Eliminazione pre-sistemica
• Eliminazione dagli enterociti da parte della glicoproteina P ed altri trasportatori
• Trasformazione metabolica nelle cellule GI.
• La selettività per lo stesso substrato combinata con la loro localizzazione negli stessi tessuti
suggeriscono che queste 2 proteine (glicoproteina P e CYP450) cooperano costituendo una barriera
per l’assorbimento dei xenobiotici tossici.
P-glicoproteina 1 o P-gp
La P-glicoproteina 1 (glicoproteina di permeabilità) o P-gp anche nota coma proteina di resistenza
multifarmaco 1. E’ una proteina proteina codificata dai geni ABC (ATP-binding cassette). Appartiene
alla superfamiglia dei trasportatori ABC che trasportano varie molecole attraverso le membrane intraed extracellulari. E’ una glicoproteina di membrana con funzione di pompa di efflusso ATP-dipendente
che accetta substrati con diverse strutture, per questo si ritiene che si sia evoluta come meccanismo di
difesa contro le sostanze tossiche.
La sua attività è di estrudere dal citoplasma sostanze anfipatiche neutre o debolmente basiche
penetrate nella cellula come ad esempio alcuni farmaci (responsabile del diminuito accumulo di
farmaci= resistenza ai farmaci).
Distribuzione
La P-gp è distribuita in modo estensivo nella barriera ematoencefalica (svolge un ruolo protettivo per il
SNC), negli enterociti soprattutto a livello del colon (riduce l'assorbimento di sostanza tossiche), e poi in
placenta (protegge il feto), ovaie, testicoli e cellule tumorali, epatociti, cellule tubulari renali.
La P-gp trasporta vari substrati attraverso la membrana cellulare, tra cui:
• Farmaci come la colcichina, e la chinidina
• Chemioterapici come la doxorubicina e la vinblastina
• Lipidi, steroidi, xenobiotici, bilirubina
• Glicosidi cardiotonici come la digossina
40
•
•
•
Immunosoppressori
Glucocorticoidi come il desametasone
Agenti antiretrovirali per l'HIV.
Ruoli della P-gp:
• Regolazione della distribuzione e della biodisponibilità dei farmaci
• L'accresciuta espressione di P-gp riduce l'assorbimento di farmaci che sono suoi substrati. Ne
conseguono ridotta biodisponibilità ed mancato raggiungimento delle concentrazioni plasmatiche
terapeutiche di farmaco. D'altra parte concentrazioni plasmatiche di farmaco troppo elevate e
conseguente tossicità possono derivare da una diminuita espressione genica di P-gp.
• Trasporto attivo di antitumorali che genera resistenza multifarmaco.
• Rimozione di metaboliti tossici e xenobiotici dalle cellule verso l'urina, la bile ed il lume intestinale.
• Trasporto di composti fuori dal cervello attraverso la BEE e questo fa sì che i farmaci hanno
maggiore difficoltà nel raggiungere la concentrazione terapeutica.
• Uptake di digossina
• Protezione delle cellule staminali ematopoietiche da tossine.
La P-gp può inibire alcuni farmaci come:
• Antracicline e paclitaxel sono solo alcuni dei substrati della P-gp la cui conc. all'interno delle cellule
tumorali può essere aumentata del 40-50% inibendo la funzione della P-gp.
I farmaci capaci di inibire l'attività della P-gp sono:
• calcio antagonisti, antipsicotici, antiaritmici, antimalarici, immunosoppressori ossia farmaci già in
uso con altre indicazioni che inibiscono la funzione della P-gp se somministrati ad alte dosi alle quali
però presentano elevata tossicità.
• farmaci di terza generazione: dotati di attività specifica verso la P-gp, attualmente in
sperimentazione (biricodar, elacridar, tariquidar, zosuquinidar).
Altri aspetti della P-gp:
Alcuni farmaci* sono in grado di indurre l’espressione genica sia della P-gp che del CYP3A poiché i geni
di entrambi hanno recettori nucleari in comune. Quindi l’induzione del CYP3A aumenta la velocità di
eliminazione dei farmaci metabolizzati da quest’ultimo mentre l’induzione della P-gp accelera
l’estrusione dei farmaci che sono substrati del trasportatore.
Ne consegue il rischio che il farmaco (substrato di entrambi CYP3A e P-gp) risulti completamente
inefficace. Tuttavia la P-gP rappresenta un importante meccanismo protettivo contro la potenziale
tossicità degli xenobiotici.
* L’iperforina, il principale principio attivo dell’iperico (sostanza naturale da banco usata nella
depressione) è induttore sia dell’espressione del CYP3A che del P-gp, ne consegue che la
somministrazione di iperico insieme ad un anticoncezionale come l’etinil estradiolo (substrato di CYP3A
e P-gp) aumenta il rischio di una inefficace contraccezione.
41
42
