Sistemi a 2 componenti

Sistemi a 2 componenti
Non solo trascrizione: i sistemi a due componenti
regolano motilità cellulare e chemotassi
Il TCRS (Two Components Regulatory System) è la via di
trasduzione del segnale predominante nei procarioti.
Segnale ambientale
(o fisiologico)
input
modulatore
P
P
H
D
transmitter
Histidine protein kinase
(HK)
H= istidina
D= Acido aspartico
receiver
effector
DNA
Monotrico
Peritrico
Response regulator (RR)
In genere tramite un
“helix-turn-helix motif” (HTH)
Run
+ Alta [Glu]
Movimento Forward (run): avanzamento in una direzione
(più frequente in presenza di sostanze “chemioattraenti”;
Basso livello di CheY-P)
Run/Tumble
Movimento Tumble: cambio di direzione; mediato da CheY-P
(più frequente in assenza di sostanze inducenti chemiotassi)
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CheY funge da “navetta” tra strutture cellulari
posizionate a diverse estremità della cellula
Numerosi fattori sono coinvolti nella
determinazione del movimento flagellare
Tar, Tsr, Trg, etc.
Forma non fosforilata:
Interazione con CheA
(risultato: Run)
CheA
CheA= proteina kinasi
CheZ= fosforilasi
CheY(-P)
Forma fosforilata (CheY-P):
Interazione con FliM
(risultato: Tumble)
CheY= response regulator
FliM= “Bersaglio” di CheY-P
Blocco CheA= funzione “run”
• Quindi: una concentrazione alta di
sostanza chemioattraente (es. glucosio)
porta a:
Attività recettori per glucosio
Blocco attività autochinasica della proteina
CheA
Questo blocca però il sistema flagellare sulla
funzione run!
L’istidina-chinasi CheA può
fosforilare diverse proteine
Interazione con il corpo basale
del flagello: alternanza
movimenti run/tumble
Interazione con i recettori
chemiotattici di membrana:
meccanismo di feedback
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Il controllo di feedback del movimento
flagellare ha luogo sui recettori chemiotattici
CheA
Mov. Run
CheR
CheA-P (attività autochinasica)
CheR
Recettore attivo
(non metilato);
Inibisce l’attività
autokinasica di
CheA
CheB-P
Recettore inattivo
(metilato);
Incapace di inibire
l’attività autokinasica
di CheA
I recettori Tsr, Trg, Tar, Aer e Tap vengono costantemente metilati e demetilati
da due enzimi citoplasmatici: CheR e CheB (in forma fosforilata). La mancata
fosforilazione di CheB da parte di CheA porta alla metilazione dei recettori ed
alla loro perdita di attività, ripristinando l’attività autokinasica di CheA e la
trasduzione del segnale.
Inattivazione recettori
chemiotattici
Attivazione recettori
chemiotattici
(inibizione attività
autochinasica di CheA)
Referenze e links
Regolatori di risposta
• Accettori terminali del cascata di
trasduzione del segnale
• Spesso attivatori trascrizionali (presenza
di domini di legame al DNA specifici)
• Possono interagire con altre proteine
bersaglio modulandone o modificandone
l’attività (es. CheY, CheB)
CheY-P (mov. Tumble)
CheB-P
Two component regulatory systems:
•
•
•
•
Pratt and Silhavy. In: “Two-component signal transduction” (1995) pp.
105-126
Ninfa et al., ibidem, pp.67-88.
Nixon et al. (1986) P.N.A.S. 83, 7850-7854
Aricò et al. (1991) Mol Microbiol 5, 2481-2491
Flagellum:
•
Bren and Eisenbach (2000) J. Bacteriology 182, 6865-6873
•
http://www.ecocyc.org/
(funzione geni/proteine in E. coli)
http://ecoli.aist-nara.ac.jp/gb4/search/xp_analysis/2_components/
(analisi genomica funzionale su mutanti di ogni TCRS di E. coli)
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Molecole segnale e secondi
messaggeri
Nucleotidi modificati: ppGpp, cAMP, di-cGMP
L’accumulo di molecole segnale avviene:
• per stimoli legati alla disponibilità di sostanze
nutritive (carboidrati per cAMP, amino acidi per
ppGpp)
• Per stimoli legati alla densità cellulare (quorum
sensing)
• Per stimoli non ancora identificati legati alla
produzione di sostanze di riserva e/o di
differenziamento cellulare(acetil-fosfato, di-cGMP)
ppGpp
cAMP
LA LORO BIOSINTESI E MECCANISMO D’AZIONE
MOSTRANO CONNESSIONI MOLTO STRETTE CON
SISTEMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE
Di-cGMP
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Procarioti:
Segnale di “fame”
Procarioti:
Segnale di “fame”
Sintetizzato in assenza di glucosio
tramite “coupling” con il sistema di
trasporto PtsG
Sintetizzato in assenza di glucosio
tramite “coupling” con il sistema di
trasporto PtsG
ATP ATP
cAMP
Adenilato
ciclasi
Adenilato
ciclasi
cAMP
σ70
Si lega alla proteina CAP
(regolatore globale) per attivare la
trascrizione di geni per l’utilizzo di
fonti di carbonio alternative al glucosio
(disaccaridi, glicerolo, glicogeno) IN
COMBINAZIONE CON PROTEINE
SPECIFICHE (es. MalT, LacI)
Ruolo più vasto ancora da definire
L’analogo di CAP in Pseudomonas
(Vfr) è un regolatore di fattori di
virulenza
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AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Eucarioti:
Segnale di “fame” nel fegato
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Procarioti:
Segnale di “fame”
Eucarioti:
Segnale di “fame” nel fegato
Sintetizzato in assenza di glucosio
Il suo ruolo è innescare l’attività delle
kinasi dando il via a processi di
trasduzione del segnale
Adenilato
ciclasi
Le adenilato ciclasi sono bersagli di
numerose tossine batteriche
(tossina colerica)
ppGpp: cross-talk tra sintesi proteica e trascrizione
La sintesi di ppGpp è
strettamente collegata alla
disponibilità intracellulare di
amminoacidi per la sintesi
proteica.
Generalmente il sito di
formazione del ppGpp è il
ppGpp
ribosoma.
Eccezione: Mycobacterium
tubercolosis
Secondo messagero: sintesi stimolata
da ormoni (es. adrenalina)
Si lega alla proteina CAP
(regolatore globale) per attivare la
trascrizione di geni per l’utilizzo di
fonti di carbonio alternative al glucosio
(disaccaridi, glicerolo, glicogeno) IN
COMBINAZIONE CON PROTEINE
SPECIFICHE (es. MalT, LacI)
Il suo ruolo è innescare l’attività delle
kinasi dando il via a processi di
trasduzione del segnale o attivare la
trascrizione di geni specifici (VIA
CREB)
Ruolo più vasto ancora da definire
Le adenilato ciclasi sono bersagli di
numerose tossine batteriche
(tossina colerica)
L’analogo di CAP in Pseudomonas
(Vfr) è un regolatore di fattori di
virulenza
L’accumulo di ppGpp blocca la sintesi di
RNA ribosomale
14000
3H-uridine incorporation
Secondo messagero: sintesi stimolata
da ormoni (es. adrenalina)
12000
10000
8000
argH-
6000
argH-; relA-
4000
2000
0
0
10
20
30
40
time (minutes)
RelA/SpoT activation and
ppGpp biosynthesis
Stalled ribosome
Tempo 0: risospensione di un ceppo auxotrofo per arginina in un
terreno privo di questo amminoacido
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Il ppGpp influenza la trascrizione mediante
un’interazione diretta con l’RNA polimerasi
Dissociazione dell’RNA polimerasi
(E) dal fattore sigma principale
Eσ70
E+ σ70
Stimolazione dell’assemblaggio
dell’RNA polimerasi (E) con fattori
sigma alternativi (σS, σN)
Principali effetti del ppGpp sui
processi cellulari
Principali effetti del ppGpp sui
processi cellulari
Proteine asociate
con i ribosomi
(cross-talk regolativo
traduzione/trascrizione)
Effetto negativo:
Blocco della sintesi
proteica e della
biosintesi dei ribosomi
Il di-c-GMP: da Cenerentola delle molecole
segnale a segnale primario di differenziamento
Proteine asociate
con i ribosomi
(cross-talk regolativo
traduzione/trascrizione)
Ridirezione
dell’espressione genica
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Il di-c-GMP viene identificato originariamente
come segnale di produzione della cellulosa
Meccanismo di attivazione della sintesi di
cellulosa da di-c-GMP
In Glucanacetobacter xylinum
l’intensa produzione di cellulosa
comporta la formazione di “foglietti
galleggianti” in culture statiche
La produzione di cellulosa nei batteri è relativamente ben conservata:
Agrobacterium tumefaciens (patogeno vegetale)
E. coli (compresi ceppi patogeni)
Salmonella typhi
Dove la cellulosa funge da agente di protezione contro stress ambientali
e come meccanismo di colonizzazione dell’ospite
Modulazione della produzione di
cellulosa in Salmonella
Attivazione della cellulosa sintasi
tramite legame con di-c-GMP
Motivi GGDEF ed EAL
GGDEF
diguanilato ciclasi
EAL
fosfodiesterasi
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Motivi DUF-1 (GGDEF) e
DUF-2 (HD-GYP) si
ritrovano in un numero
significativo di proteinachinasi, sensori di sistemi
a due componenti e ad
altre famiglie di proteine.
La funzione del di-c-GMP
trascende quindi la
semplice funzione di
regolatore della sintesi
della cellulosa; sembra
invece avere un ruolo
importante in diversi
processi cellulari,tra cui:
Formazione del biofilm
Espressione di fattori di
virulenza
Conservazione delle DCG nei batteri
• Le di-c-GMP-sintetasi sono altamente conservate e
rappresentate in grande numero nei microrganismi:
Specie
Vibrio vulnificus
Shewanella oneidensis
Escherichia coli
Nr. DCG
GGDEF
59
41
27
18
nd
EAL
nd
16
Esempi:
rpfG (Xanthomonas campestris): produzione enzimi extracellulari
wspR (Pseudomonas aeruginosa): formazione del biofilm
hmsT (Yersinia pestis): colonizzazione della pulce (ospite)
pleD (Caulobacter crescentus): divisione cellulare
Differenziamento
Altre molecole segnale dello stato
fisiologico ed energetico della cellula
Referenze x molecole segnale
• cAMP:
Kolb et al., Annu. Rev. Bioch. 1993, 62:749-765
Johansson et al., Cell, 2000, 102:475-485
Acetil-fosfato (prodotto da
intermedio della glicolisi)
Omoserin-lattoni (indicatori di
densità cellulare e derivati dalla
biosintesi degli aminoacidi)
• ppGpp
Chatterji and Ojha, Curr. Opin. Microbiology 2001, 4:160–165
Gentry et al., Journal Bacteriol. 1993, 175:7982-7989
• di-c-GMP:
Ross et al., Microbiological reviews, 55:35-58, 1991
Jenal, Current Opinion in Microbiology 2004, 7:185–191
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Extracellular adhesion
factors
Curli
Cellulose
OM
IM
CsgD
Activation
Repression
- Fimbriae and cellulose csg, ymdA, adrA
- Metabolism pyrBI, gat, metA
- Signalling system c-di-GMPadrA, gsk, yoaD
- Porin ompF, ompT
- Iron-sensing fecR, fhuE
Cell aggregation
Surface attachment
(Metabolic adaptation to
new growth conditions)
- Cold-shock csp, infA
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