Programma Genetica Applicata

SECONDA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI
Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie
Indirizzo: Industriale e ambientale
Programma del Corso di: GENETICA APPLICATA
(2 crediti – esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE - 3° anno)
a.a. 2010-2011 – docente: Flavia Cerrato
1. LE TECNICHE DI BASE
Elettroforesi in gel di agarosio. Il trasferimento degli acidi nucleici su
membrana (blotting). Southern blotting. Ibridazione di acidi nucleici. Northern blotting
L’autoradiografia. La reazione a catena della DNA polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR). RT-PCR (PCR su
RNA retrotrascritti). PCR quantitativa in tempo reale
2. TAGLIO E SALDATURA DI MOLECOLE DI DNA
Sistemi di restrizione-modificazione. I siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione
Le metilasi di E. coli e delle cellule eucariote.La saldatura di molecole di DNA. Le DNA ligasi
Linkers e Adattatori. Sintesi di code omopolimeriche con la terminal transferasi. Clonaggio di frammenti prodotti
mediante PCR
3. VETTORI DI CLONAGGIO
Caratteristiche essenziali dei plasmidi e vettori plasmidici di base. Il numero di copie dei plasmidi
La purificazione del DNA plasmidico. Caratteristiche desiderabili dei plasmidi come vettori di clonaggio. pBR322, il
capostipite dei vettori. Plasmidi di nuova generazione. La α-complementazione dell’attività β-galattosidasica. Il
batteriofago λ. Ciclo vitale. Vettori λ di sostituzione e di integrazione.
L’impaccamento in vitro del DNA di λ. Clonaggio in vettori a DNA a singolo filamento. Vettori per il clonaggio di
grandi frammenti di DNA. Vettori cosmidici. I vettori BAC e PAC. Cromosomi artificiali di lievito. Vettori di
espressione. Vettori per la preparazione di sonde a RNA.
4. GENOTECHE GENOMICHE, CROMOSOMICHE E DI cDNA
Il clonaggio di DNA genomico. Le genoteche di DNA genomico. La PCR come alternativa al clonaggio di DNA
genomico. Il clonaggio di cDNA. Il clonaggio di cDNA interi. La PCR come alternativa al clonaggio di cDNA. Le
expressed sequence tags (EST). Strategie di analisi (screening) delle genoteche. Analisi di genoteche basata sulla
sequenza dei cloni. Clonaggio posizionale, chromosome walking. Analisi delle genoteche di espressione (clonaggio di
espressione). Clonaggio funzionale. Clonaggio differenziale.
5. SEQUENZIAMENTO E MUTAGENESI
Le tecniche di base per il sequenziamento di DNA. Il sequenziamento automatico di DNA. Sequenziamento di interi
genomi. Cenni sul Progetto Genoma Umano. I database di sequenze. La mutagenesi sito-specifica. Mutagenesi a
cassetta. Mutagenesi per estensione di un primer. Metodi di mutagenesi sito-specifica
basati sulla PCR.
6. MODIFICAZIONI GENETICHE DI CELLULE E ORGANISMI ANIMALI
Panoramica sulle strategie di trasferimento genico. Trasformazione mediata da DNA. Tecniche di trasformazione.
Trasformazione con vettori contenenti repliconi. Trasferimento genico mediante trasduzione virale. Marcatori. Vettori
virali. Adenovirus. Vettori retrovirali. Metodi per la produzione/generazione di topi transgenici. Microiniezione di DNA
nell’embrione. Gene targeting in cellule ES. Progressi delle tecniche di transgenesi. La ricombinazione sito-specifica.
Creazione di mutanti condizionali nel topo mediante l’utilizzo del sistema Cre-loxP. Applicazioni. Animali transgenici
come bioreattori. Animali geneticamente modificati come modello di patologie umane.
7. MODIFICAZIONI GENETICHE DI CELLULE E ORGANISMI VEGETALI
Il callo e la coltivazione in vitro di cellule vegetali. Panoramica sulle strategie di trasferimento
Genico. Trasformazione mediata da Agrobacterium. Plasmidi che inducono tumori: i plasmidi Ti. Il trasferimento del TDNA. Plasmidi Ti disarmati come vettori per il trasferimento genico nelle piante. Marcatori di selezione nelle piante.
Agrobacterium e le monocotiledoni.Vettori binari ad alta capacità. Trasferimento diretto di DNA alle piante.
Trasformazione di protoplasti. Bombardamento con particelle. Trasformazione di cloroplasti. I virus delle piante come
vettori. Piante transgeniche. Le piante come bioreattori. Resistenza a erbicidi. Protezione da insetti e virus.
Miglioramento delle caratteristiche agronomiche.
Testi consigliati:
1- S. Primrose, R. Twyman, B. Old. Ingegneria genetica. Zanichelli.
2- R. J. Reece. Analisi dei geni e genomi. EdiSES.
3- E. Boncinelli, A. Simeone. Ingegneria Genetica – Seconda edizione. Idelson-Gnocchi.