Tecniche della Biologia Molecolare Amaldi Cap 21 (vari paragrafi) Allison Cap 8 e 9 (vari paragrafi) Uso di sonde di DNA per l’identificazione e l’analisi di sequenze nucleotidiche • Ibridazione A saturazione Ibridazione in situ o citologica Southern e Northern Blot Ibridazione su colonia o su placca Microarray (o microchip) Ibridazione in situ o citologica Microarray Tecnologie di base per l’isolamento e la manipolazione dei geni Ingegneria genetica o Tecnologia del DNA ricombinante • Enzimi di restrizione e DNA Ligasi • Vettori di clonaggio • Plasmidi • Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti • Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco • Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti • Batteriofago Lamda • Cosmidi • Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche • Vettori di lievito • Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali • Trasferimento di DNA all’interno di Vegetali Clonaggio Enzimi di restrizione e DNA Ligasi Vettori di Clonaggio • • • • Plasmidi Cosmidi Fagi Cromosomi artificiali: Lievito (YAC) Batterici (BAC) Plasmidici (PAC) • Vettori di espressione in Procarioti, Eucarioti, Piante • Virus Vettori di Clonaggio Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco Vettori di Espressione: E.Coli Batteriofago Lamda Cosmide Vettori di Lievito: vettori plasmidici Vettori di Lievito: YAC Banche di DNA – DNA library • Banche genomiche • Rappresentatività di una libreria di DNA genomico • Libreria di cDNA • Identificazione del clone contenente il DNA di interesse da una libreria PCR – Reazione a catena della polimerasi • Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1983) • Taq Polymerase • Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA Associazione (Annealing) degli inneschi (primer) Sintesi da parte della polimerasi • Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA: 30 sec a 95° Associazione (Annealing) degli inneschi (Primer) 30 sec a 40-60°C per favorire l’associazione specifica degli inneschi (La temperatura deve essere di circa 5°C al di sotto della Tm degli inneschi) Sintesi da parte della polimerasi: 2 min a 72°C che è la temperatura ottimale per la Taq polimerasi RT-PCR & Real Time PCR • RT-PCR = PCR su un campione di DNA retrotrascritto a partire da RNA mediante Reverse Transcriptase • Real Time PCR = PCR in tempo reale, per l’analisi degli amplificati (quantità) durante l’amplificazione, Real Time PCR Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA • Metodo chimico (Maxam & Gilbert) • Metodo enzimatico (Sanger) Principio del seq Metodo chimico - Maxam & Gilbert Metodo enzimatico - Sanger piattaforme di sequenziamento di nuova generazione - NGS In Uso • Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche • Piattaforma Illumina – Genome Analyzer • Sistema SOLiD – Applied Biosystem Altre • Helicos Biosciences • ION Torrent Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche Piattaforma Illumina – Genome Analyzer Sistema SOLiD – Applied Biosystem Campi applicazioni NGS • Sequenziamento de novo e risequenziamento di genomi complessi • Identificazione di siti polimorfici e mutazioni • Analisi del trascrittoma • Studio dell’Interazione DNA- Proteine • Caratterizzazione del metiloma e studio dell’editing • Metagenomica 21.9 Valutazione dell’espressione di un gene 21.10 Inibizione dell’espressione di geni specifici • RNA antisenso • Intereferenza da RNA