ribotipizzazione

Patogenid: sistema di
sorveglianza epidemiologica dei
patogeni
M.N. Losio & P. Boni
Dipartimento Alimenti e Sicurezza Alimentare IZSLER Brescia
Reggio Emilia 16.10.2007
TECNICHE DI TIPIZZAZIONE
TIPIZZAZIONE
GENOTIPICA
TIPIZZAZIONE
FENOTIPICA
9 API
9 Ribotipizzazione
9 Enterotube
9 PFGE
9 Sierotipizzazione
9 AFLP
9 Fagotipizzazione
9 RFLP
9 RAPD
9 PCR
9 Real time PCR
9 Sequenziamento
9…
PathogenID
9
9
9
Sistema integrato di elaborazione dati finalizzati
al raggiungimento di un livello reale di tracciabilità
Programma in rete finalizzato allo scambio di
informazioni su ceppi e sottotipi batterici e allo
studio della biodiversità e diversità dei ceppi
Caratteristica di unicità di PathogenID
l’applicazione a carattere nazionale ed europeo
è
Quali informazioni deve contenere ??
9
Informazioni generali
- Di isolamento e in generale di laboratorio
- Di provenienza: animale, alimentare, umano
9
9
9
9
9
9
Immagini di ribotipizzazione
PFGE
Informazioni sulla sequenza
Informazioni PCR
Antibiotico-resistenza
Informazioni fenotipiche
SISTEMA DI
IDENTIFICAZIONE/CARATTERIZZAZIONE
16S rRNA Batterico
9 Parte della subunità 30 S del ribosoma batterico
9 Contribuisce alla struttura del ribosoma
9 Ruolo
nell’inizio della sintesi proteica e nella
disposizione dell’ mRNA
16S rDNA come sistema tassonomico
9 Universale
e necessario alla sopravvivenza
Batterica
9 Molto stabile, bassa frequenza di mutazioni tra le
specie
9 Regioni conservate interdisperse a regioni variabili
RIBOTIPIZZAZIONE
AUTOMATIZZATA:
SISTEMA DI CARATTERIZZAZIONE BATTERICA RIBOPRINTER ®
• Tipizza e caratterizza
oltre la specie
• Velocizza (risultati in 8 ore
e 32 campioni/giorno)
• Risultati archiviati elettronicamente
• Database personalizzabile
• Unità di caratterizzazione
• Personal Computer
• Stampante
• Stazione di trattamento termico
• Biovortexer
• UPS
APPLICAZIONI DEL SISTEMA
RIBOPRINTER
9
Produzione Alimentare
9
Epidemiologia
9
Medicina Veterinaria
9
Controllo Qualità
9
Studi di ecologia ambientale
9
Ricerca e Sviluppo in Microbiologia
PRINCIPI DELLA RIBOTIPIZZAZIONE
STRAIN #1
PROBE
16S rRNA
Gene X
A
23S rRNA
5S
Gene Z
B
B
RiboPrint® Pattern generated
using an infrequent cutter (one
ribosomal RNA operon shown)
A
Increasing
Fragment Size
RISULTATO: PROFILO RIBOPRINT
®
Ogni “fingerprint” viene definito sulla base di caratteristiche sequenze di acidi
nucleici e viene chiamato“profilo RiboPrint®”
IMMAGINE DIGITALIZZATA
GRAPHICAL FORMATS
Waveform
Grayscale
IDENTIFICAZIONE (basata su un confronto con il database): es. Staphylococcus aureus
CARATTERIZZAZIONE (assegna ad un unico RiboGroup): es. 1089-4
ETEROGENEITA’
GENOMICA ALL’INTERNO
DELLA STESSA SPECIEÆ
IMPOSSIBILE
CARATTERIZZARE SU
BASE MICROBIOLOGICA
Identificazione – Rispetto al Dupont database
ANALISI AUTOMATIZZATA DEI PROFILI
– CARATTERIZZAZIONE -
9 Permette di confrontare isolati batterici senza la
necessità di una preventiva identificazione
9 Fornisce un’informazione oltre il livello della specie
9 E’ un processo dinamico, continuamente aggiornato
RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE
Assegnazione di un nome della tassonomia classica all’organismo
RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE
I profili RiboPrint® forniscono indicazioni dei caratteri
conservati che mostrano variazioni tra una specie e l’altra
RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE
I profili RiboPrint® forniscono indicazioni dei caratteri non
conservati che discriminano oltre il livello delle specie
Listeria monocytogenes found in product
Product Sample
Drain Sample
Slicer Sample
RIBOTIPIZZAZIONE DI CEPPI DI LISTERIA
MONOCYTOGENES ISOLATI NEL CORSO DI
UN EPISODIO DI LISTERIOSI:
CORRELAZIONI
N°
CAMPIONI
33
11
1
1
1
1
6
6
1
1
1
MATRICE
PASTA/
CROSTA
CROSTA
CROSTA
CROSTA
CROSTA
PAZIENTE
PASTA/
CROSTA
PASTA/
CROSTA
PAZIENTE
ID
ECOR1
PVUII
DUP1045
189-7-S-1
189-39-S-8
DUP1045
DUP1045
DUP1045
DUP1045
DUP1042
189-7-S-1
189-7-S-1
189-7-S-1
189-7-S-1
189-5-S-3
189-39-S-8
189-245-S-5
189-245-S-2
189-245-S-1
189-74-S-2
DUP1044 189-222-S3 189-223-S-3
DUP18645 182-32-S-4
189-39-S-8
DUP18645 182-32-S-4 189-39-S-8
DUP
PAZIENTE
189-10-S-4 189-29-S-4
18596
DUP
189-218-SPAZIENTE
189-219-S-1
18611
1
Tali ceppi, confrontati mediante il
saggio di patogenicità e di invasività
in vitro hanno al contrario evidenziato
alcune differenze:
9 il DUP 18645 è apparso in grado di
indurre placche ad un titolo medio pari
a
5 x 108 mentre tale capacità è
apparsa molto più ridotta per i ceppi
DUP 1045 (valore medio 105)
9 anche le dimensioni delle placche
indotte dal DUP 18645 sono risultate
di dimensioni medie significativamente
superiori a quelle indotte dagli altri
ceppi (rispettivamente 8 e 2 mm)
PFGE e RIBOPRINTER caratterizzazione
di ceppi di Salmonella
PFGE-XbaI
73/1/08
Æ Anatre
73/2/08
348vb Æ Cantina
epidemia_garda Æ Umano
RIBOPRINTER-PVUII
formaggio
pazienti