Patogenid: sistema di sorveglianza epidemiologica dei patogeni M.N. Losio & P. Boni Dipartimento Alimenti e Sicurezza Alimentare IZSLER Brescia Reggio Emilia 16.10.2007 TECNICHE DI TIPIZZAZIONE TIPIZZAZIONE GENOTIPICA TIPIZZAZIONE FENOTIPICA 9 API 9 Ribotipizzazione 9 Enterotube 9 PFGE 9 Sierotipizzazione 9 AFLP 9 Fagotipizzazione 9 RFLP 9 RAPD 9 PCR 9 Real time PCR 9 Sequenziamento 9… PathogenID 9 9 9 Sistema integrato di elaborazione dati finalizzati al raggiungimento di un livello reale di tracciabilità Programma in rete finalizzato allo scambio di informazioni su ceppi e sottotipi batterici e allo studio della biodiversità e diversità dei ceppi Caratteristica di unicità di PathogenID l’applicazione a carattere nazionale ed europeo è Quali informazioni deve contenere ?? 9 Informazioni generali - Di isolamento e in generale di laboratorio - Di provenienza: animale, alimentare, umano 9 9 9 9 9 9 Immagini di ribotipizzazione PFGE Informazioni sulla sequenza Informazioni PCR Antibiotico-resistenza Informazioni fenotipiche SISTEMA DI IDENTIFICAZIONE/CARATTERIZZAZIONE 16S rRNA Batterico 9 Parte della subunità 30 S del ribosoma batterico 9 Contribuisce alla struttura del ribosoma 9 Ruolo nell’inizio della sintesi proteica e nella disposizione dell’ mRNA 16S rDNA come sistema tassonomico 9 Universale e necessario alla sopravvivenza Batterica 9 Molto stabile, bassa frequenza di mutazioni tra le specie 9 Regioni conservate interdisperse a regioni variabili RIBOTIPIZZAZIONE AUTOMATIZZATA: SISTEMA DI CARATTERIZZAZIONE BATTERICA RIBOPRINTER ® • Tipizza e caratterizza oltre la specie • Velocizza (risultati in 8 ore e 32 campioni/giorno) • Risultati archiviati elettronicamente • Database personalizzabile • Unità di caratterizzazione • Personal Computer • Stampante • Stazione di trattamento termico • Biovortexer • UPS APPLICAZIONI DEL SISTEMA RIBOPRINTER 9 Produzione Alimentare 9 Epidemiologia 9 Medicina Veterinaria 9 Controllo Qualità 9 Studi di ecologia ambientale 9 Ricerca e Sviluppo in Microbiologia PRINCIPI DELLA RIBOTIPIZZAZIONE STRAIN #1 PROBE 16S rRNA Gene X A 23S rRNA 5S Gene Z B B RiboPrint® Pattern generated using an infrequent cutter (one ribosomal RNA operon shown) A Increasing Fragment Size RISULTATO: PROFILO RIBOPRINT ® Ogni “fingerprint” viene definito sulla base di caratteristiche sequenze di acidi nucleici e viene chiamato“profilo RiboPrint®” IMMAGINE DIGITALIZZATA GRAPHICAL FORMATS Waveform Grayscale IDENTIFICAZIONE (basata su un confronto con il database): es. Staphylococcus aureus CARATTERIZZAZIONE (assegna ad un unico RiboGroup): es. 1089-4 ETEROGENEITA’ GENOMICA ALL’INTERNO DELLA STESSA SPECIEÆ IMPOSSIBILE CARATTERIZZARE SU BASE MICROBIOLOGICA Identificazione – Rispetto al Dupont database ANALISI AUTOMATIZZATA DEI PROFILI – CARATTERIZZAZIONE - 9 Permette di confrontare isolati batterici senza la necessità di una preventiva identificazione 9 Fornisce un’informazione oltre il livello della specie 9 E’ un processo dinamico, continuamente aggiornato RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE Assegnazione di un nome della tassonomia classica all’organismo RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE I profili RiboPrint® forniscono indicazioni dei caratteri conservati che mostrano variazioni tra una specie e l’altra RIBOPRINTER: IDENTIFICAZIONE I profili RiboPrint® forniscono indicazioni dei caratteri non conservati che discriminano oltre il livello delle specie Listeria monocytogenes found in product Product Sample Drain Sample Slicer Sample RIBOTIPIZZAZIONE DI CEPPI DI LISTERIA MONOCYTOGENES ISOLATI NEL CORSO DI UN EPISODIO DI LISTERIOSI: CORRELAZIONI N° CAMPIONI 33 11 1 1 1 1 6 6 1 1 1 MATRICE PASTA/ CROSTA CROSTA CROSTA CROSTA CROSTA PAZIENTE PASTA/ CROSTA PASTA/ CROSTA PAZIENTE ID ECOR1 PVUII DUP1045 189-7-S-1 189-39-S-8 DUP1045 DUP1045 DUP1045 DUP1045 DUP1042 189-7-S-1 189-7-S-1 189-7-S-1 189-7-S-1 189-5-S-3 189-39-S-8 189-245-S-5 189-245-S-2 189-245-S-1 189-74-S-2 DUP1044 189-222-S3 189-223-S-3 DUP18645 182-32-S-4 189-39-S-8 DUP18645 182-32-S-4 189-39-S-8 DUP PAZIENTE 189-10-S-4 189-29-S-4 18596 DUP 189-218-SPAZIENTE 189-219-S-1 18611 1 Tali ceppi, confrontati mediante il saggio di patogenicità e di invasività in vitro hanno al contrario evidenziato alcune differenze: 9 il DUP 18645 è apparso in grado di indurre placche ad un titolo medio pari a 5 x 108 mentre tale capacità è apparsa molto più ridotta per i ceppi DUP 1045 (valore medio 105) 9 anche le dimensioni delle placche indotte dal DUP 18645 sono risultate di dimensioni medie significativamente superiori a quelle indotte dagli altri ceppi (rispettivamente 8 e 2 mm) PFGE e RIBOPRINTER caratterizzazione di ceppi di Salmonella PFGE-XbaI 73/1/08 Æ Anatre 73/2/08 348vb Æ Cantina epidemia_garda Æ Umano RIBOPRINTER-PVUII formaggio pazienti