110 Recenti Prog Med 2014; 105: 110-114 Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle sindromi mielodisplastiche Cristina Mecucci1 Riassunto. La diagnosi delle sindromi mielodisplastiche (SMD) si basa su parametri ematologici, citopenia/e e morfologia midollare, e citogenetici che forniscono importanti informazioni sia per la dimostrazione della clonalità sia per l’identificazione di aberrazioni tipiche. La ricerca dei riarrangiamenti cromosomici si avvale del cariotipo con bandeggio che può essere integrato con un’analisi genomica a maggiore risoluzione come la FISH e gli array. Un’anomalia cromosomica specifica definisce l’entità clinico-patologica inserita nella classificazione WHO 2008 come SMD con del(5q) isolata. La citogenetica contribuisce anche in modo significativo alla determinazione di punteggi con significato prognostico alla diagnosi di SMD, sia in termini di sopravvivenza sia in termini di evoluzione leucemica. Diagnosis and prognosis in myelodysplastic syndromes. The impact of cytogenetics. Parole chiave. Citogenetica, diagnosi, prognosi, sindromi mielodisplastiche. Key words. Myelodysplastic syndromes, cytogenetics, diagnosis, prognosis. Introduzione la di leucemia acuta, che rappresenta la fase finale nella storia naturale di oltre il 30% delle SMD, con evoluzione clonale. Un interessante apparente paradosso delle sindromi mielodisplastiche è la concomitanza di citopenia periferica e ipercellularità midollare in circa l’80% dei casi di SMD, la cui origine è legata a un fenomeno biologico ben caratterizzato che corrisponde a un aumento dell’apoptosi. Nel restante 20% di SMD con un midollo ipocellulare è importante considerare la diagnosi differenziale con le condizioni, congenite o acquisite, che determinano un’insufficienza midollare1. Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono a tutt’oggi un capitolo problematico dell’ematologia per ciò che concerne la diagnosi e gli indirizzi terapeutici. Le SMD vengono classicamente introdotte come un gruppo eterogeneo di disordini mieloidi la cui diagnosi corretta necessita dell’unione dell’analisi morfologica con quella citogenetica. Il sospetto diagnostico si pone a partire dal sangue periferico che può mostrare una (mono-), due (bi-), tre (pan-) citopenia(e) e segni di displasia a carico di una o più serie cellulari. Con il termine “displasia” sul piano morfologico si intende la presenza di anomalie morfologiche del nucleo e/o del citoplasma evidenziabili nello striscio di sangue periferico e midollare. La morfologia è inoltre indispensabile a valutare la quota di cellule blastiche nella serie mieloide, la cui percentuale va a determinare i cut-off delle distinte entità contemplate sia nella classificazione FAB (French-American-British) sia nella più recente WHO1,2. La crescente percentuale dei blasti nel corso del follow-up dà inoltre ragione dell’esistenza di un continuum tra la condizione di mielodisplasia e quel1Ematologia, Università di Perugia. Pervenuto il 4 dicembre 2013. Summary. Diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS) is based on cytopenia(s), bone marrow morphology, and cytogenetics. Cytogenetics is helpful both to assess clonality and to identify typical aberrations. Chromosomal rearrangements are usually investigated through the karyotype after chromosome banding. Further insights may be obtained from higher resolution genome technologies, such as FISH and SNP arrays. One distinct clinico-pathologic entity diagnosed by the presence of an isolated deletion at chromosome 5q, so-called MDS with isolated del(5q), has been included in the WHO 2008 classification. Cytogenetics is also necessary to calculate prognostic scores at diagnosis of MDS. Chromosome abnormalities predict both survival and MDS evolution to acute myeloid leukemia. Citogenetica La definizione “storica” si riferisce all’analisi cromosomica corrispondente al cariotipo che classifica i cromosomi sulla base del bandeggio. Tuttavia, nell’accezione moderna l’analisi citogenetica si è arricchita di nuovi approcci mutuati dalla biologia molecolare, quali la fluorescence in situ hybridization (FISH) e i single nucleotide polimorphisms (SNP) array. C. Mecucci: Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle SMD Citogenetica convenzionale L’analisi citogenetica a tutt’oggi clinicamente rilevante nelle SMD è costituita dalla cosiddetta “citogenetica convenzionale”, vale a dire il cariotipo, previo bandeggio cromosomico, che consente di rilevare riarrangiamenti numerici (monosomie e trisomie parziali o di interi cromosomi) e strutturali (inversioni, traslocazioni, delezioni). Una caratteristica importante che, sul piano biologico, differenzia le SMD dalle leucemie acute mieloblastiche (LAM) e dai disordini mieloproliferativi cronici (MPD) è una predominanza di delezioni cromosomiche rispetto a traslocazioni molto più frequenti nelle LAM e nei MPD. L’aplo-insufficienza, intesa come riduzione del prodotto del gene mancante fino al 50% del normale, è il risultato biologico ampiamente confermato nelle delezioni associate a SMD, con particolare riferimento alla del(5q), e ha un ruolo importante nell’inattivazione di geni determinanti nella patogenesi della malattia, inclusi geni soppressori3. A questo proposito è molto importante ricordare che il processo di inattivazione genica nelle SMD è correlato anche a fenomeni epigenetici (metilazione e acetilazione)4. FISH Comunemente indicata anche con il termine citogenetica molecolare, la FISH è di rilievo nella diagnosi delle SMD sia nella ricerca di anomalie criptiche nei nuclei in interfase a complemento di una citogenetica convenzionale fallita o normale, sia nella precisazione della dimensione del clone includendo nell’analisi le cellule non proliferanti. Un ulteriore importante valore aggiunto della FISH è costituito dalla possibilità di utilizzare sonde specifiche per singoli geni ottenendo così una interpretazione molecolare più precisa rispetto alle anomalie cromosomiche. rozigosi senza perdita di materiale genomico (CNV, neutral copy number variations). Nelle sindromi mielodisplastiche neutral CNV a livello del cromosoma 4q, 7q, 11q, sono associate rispettivamente a mutazioni dei geni TET2, EZH2, CBL6-8. Diagnosi di SMD La citogenetica convenzionale mostra un cariotipo anormale nel 40-50% delle SMD. Il tipo e la distribuzione delle anomalie sono riportati nella figura 1, che, accanto a sottogruppi di anomalie ricorrenti, mostra anche anomalie sporadiche o rare in circa il 2% dei casi. Tutte le altre anomalie possono distribuirsi nei diversi sottogruppi FAB o WHO. Sebbene recentemente il sangue periferico sia stato proposto come interessante surrogato per la ricerca di marcatori genetici con FISH o SNP array9, il campione midollare resta indispensabile per la diagnosi di certezza di SMD. La dimostrazione di un’anomalia citogenetica, anche se sporadica, costituisce un elemento determinante per la diagnosi di SMD in quanto dimostrazione di clonalità. Tuttavia, è molto importante sottolineare che la perdita del cromosoma Y, -Y, o la delezione del cromosoma 20, del(20q), o la trisomia 8, se presenti come anomalie cariotipiche isolate, ma in assenza di evidente mielodisplasia, non sono di per sé sufficienti per una conclusione diagnostica verso una SMD. D’altra parte, seppure raramente, una leucemia acuta mieloblastica associata a riarrangiamenti tipici, quali la t(8;21)/AML1/ETO, o traslocazioni del gene MLL o del gene EVI1, può presentarsi con le stigmate morfologiche della SMD, a rapidissima evoluzione leucemica1. Il cariotipo è conditio sine qua non per la diagnosi dell’entità SMD con del(5q) isolato1. L’anomalia cromosomica del(5q) consiste nella perdita di materiale genomico a livello del braccio lungo (q). La delezione è definita interstiziale perché la porzione telomerica è sempre mantenuta, i punti di rottura centromerici e telomerici SNP array È un tipo di analisi che permette di ottenere un cariotipo molecolare ad altissima risoluzione, quando confrontato con il cariotipo con bandeggio, che utilizza sequenze polimorfe a copertura dell’intero genoma. L’approccio è molto informativo per l’identificazione di perdite o acquisizioni dei marcatori genomici (CNV, copy number variations)5. Da questo approccio si ottengono informazioni su un particolare meccanismo che, in seguito a ricombinazione somatica, vede perdita di ete- 2,6% 2,9% 3,4% 1,6% 1,6% 0,5% 0,3% 5,2% 5,7% 7,6% 10% 58,6% Cariotipo normale Cariotipo complesso Del(5q) isolata Anomalie isolate Perdita del cromosoma y Trisomia 8 Del(20q) Del(Sq) +1 anomalia Non complessa -7/del(7q) Del(11q) Trisomia 8 +1 anomalia Cloni indipendenti Figura 1. Distribuzione delle anomalie cariotipiche in una serie consecutiva di 382 MDS (casistica personale). 111 112 Recenti Progressi in Medicina, 105 (3), marzo 2014 sono variabili e, conseguentemente, la dimensione del A B tratto di cromosoma deleto, anche se esiste una regione comune di delezione (CDR) C che caratterizza tutti i caRP11-946D14 10,11. È su questa regione si Orange, RPS14 che si basa l’analisi di FISH con l’utilizzo di sonde che evidenziano la perdita di geni/loci critici e inclusi nella CDR (figura 2). L’analisi di FISH, sebbene molto valida nella valutazione della diD mensione del clone e nell’identificazione di cloni anche molto piccoli, non può essere considerata un surrogato della citogenetica convenmiR-145 5q32 zionale alla diagnosi, perché, 5q32 CSF1R sebbene permetta di identi5q33.1 RPS14 ficare la del(5q), non documenta l’anomalia come iso5q33.1 SPARC lata, non permettendo di escludere la presenza di al5 tre anomalie associate. Da questo punto di vista l’analisi di SNP, che consente di riFigura 2. A. Cariotipo con bandeggio G di un caso di MDS con del(5q) isolata. B. Ideogramma del costruire l’intero assetto crocromosoma 5 con indicazione dei geni rilevanti nella patogenesi e appartenenti alla regione comosomico, è senz’altro molto mune di delezione. C. Esempio di FISH in nuclei in interfase con una sonda fluorescente che ricopiù informativa perché in nosce il gene RPS14 deleto nelle cellule con del(5q): 2 segnali=nucleo con 5q normale; 1 segnale= nucleo con del(5q). D. Esempio di cariotipo con SNP array in un caso con del(5q) isolata. grado di rilevare qualsiasi sbilanciamento cromosomico accompagnante, ma non eventuali traslocazioni bilanciate. Tuttavia, un clone può essere rilevato dapiù importanti fattori prognostici indipendenti nelgli SNP solo se rappresentativo di almeno il 20-30% le SMD14. Il cariotipo contribuisce allo scoring con della popolazione cellulare in esame. A tutt’oggi, anomalie specifiche a basso, intermedio e alto riquindi, il mezzo più potente per la diagnosi delschio (tabella 1). La stratificazione prognostica l’entità WHO con del(5q) rimane la citogenetica IPSS include quattro livelli di rischio: basso (score convenzionale, anche in considerazione della con0); intermedio1 (score 0.5-1); intermedio2 (score comitanza di una quota rilevante di cellule normali 1.5-2.0); alto (score >2.5) e ha avuto un’ampia valialla diagnosi. Importante notare che l’entità WHO dazione clinica in tutto il mondo. Ha anche costicomprende, ma non si identifica con la cosiddetta tuito la base per linee-guida terapeutiche15. L’IPSS “sindrome 5q”, la cui costellazione clinico-ematoloè stato rielaborato sulla base delle indicazioni forgica è costituita da: prevalenza del sesso femmininite dall’Organizzazione Mondiale della Sanità le, anemia macrocitica, serie eritroide ipoplastica, (WHO), includendo l’esigenza trasfusionale prima, micromegacariociti monolobulati, piastrine nore il grado di anemia, successivamente, come immali o aumentate12. Quest’ultimo parametro emaportanti fattori prognostici insieme alle categorie tologico, non irrilevante sul piano prognostico13, citogenetiche indicate dall’IPSS16. La più moderna non viene precisato nella definizione WHO che può stratificazione prognostica ha ulteriormente rivisiincludere anche casi con piastrinopenia alla diatato il ruolo della citogenetica in quello che oggi viene definito IPSS-R17 che continua a basarsi su cignosi1. togenetica, numero di citopenie periferiche, percentuale di blasti midollari, ma con una citogenetiStratificazione prognostica ca ampliata da tre a cinque sottogruppi (tabella 1). Vengono introdotti i sottogruppi di SMD a prognoLa stratificazione prognostica dei pazienti con si molto buona corrispondenti ai cariotipi -Y e SMD segue le indicazioni del sistema internaziodel(11q), e SMD a prognosi molto cattiva, corrinale di scoring (International Prognostic Scoring spondenti a cariotipi complessi con più di tre anomalie. Numerose esperienze di validazione in stuSystem - IPSS) che identifica la percentuale dei di multicentrici stanno supportando l’IPSS-R come blasti midollari, il numero delle citopenie periferiottimo strumento di stratificazione prognostica alche e le anomalie citogenetiche specifiche come i C. Mecucci: Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle SMD la diagnosi e di scelta dell’indirizzo terapeutico18,19. A Tabella 1. Raggruppamenti prognostici su base citogenetica nell’IPPS e IPPS-R. complemento, altre variabiRischio IPSS IPSS-R li che possono influenzare la prognosi sono rappresen- Molto basso del(11q) -Y tate dai livelli sierici della lattatodeidrogenasi (LDH), Basso cariotipo nl cariotipo nl della ferritina, della ß2-mi-Y del(5q) croglobulina nonché della fidel(5q) del(12p) brosi midollare e dalle codel(20q) del(20q) morbilità del paziente17. Ulanomalie clonali del(7q) teriori importanti contribu- Intermedio no basso/no alto +8 ti alle precisazioni prognoi(17q) stiche sono forniti dalla de+19 finizione del cariotipo moaltre anomalie clonali nosomico e dall’integraziocariotipo complesso (>3 anl) inv(3)/t(3q)/del3q ne dell’analisi molecolare Alto anomalie cromosoma -7/del(7q) della del(5q). Il cariotipo con complesso: 3anl monosomico si definisce come un cariotipo anormale Molto alto cariotipo complesso >3anl che contiene o la perdita di due autosomi, o la perdita di un autosoma più un riarrangiamento strutturale. In altri termini, questa 8. Grand FH, Hidalgo-Curtis CE, Ernst T, et al. Frequent CBL mutations associated with 11q acquired definizione deriva da una sottoclassificazione neluniparental disomy in myeloproliferative neol’ambito dei cariotipi complessi, e, come atteso, la plasms. Blood 2009; 113: 6182-92. presenza di un cariotipo monosomico correla con 9. Mohamedali AM, Alkhatabi H, Kulasekararaj A, et una prognosi sfavorevole20. Nel versante invece al. Utility of peripheral blood for cytogenetic and delle SMD a prognosi relativamente “benigna”, in mutation analysis in myelodysplastic syndrome. Bloparticolare quelle associate a del(5q), il decorso od 2013; 122: 567-70. viene decisamente modificato dalla presenza alla 10. Nofrini V, La Starza R, Crescenzi B, et al. Diffediagnosi di un clone midollare con mutazione del rent boundaries characterize isolated and non-iso21 gene p53 . Il clone con la mutazione si espande lated 5q deletions in myelodysplastic syndromes nell’evoluzione leucemica e non risulta sensibile and acute myeloid leukemias. Haematologica 2012; 97: 792-4. alla lenalidomide, una molecola peraltro capace 11. Boultwood J, Fidler C, Strickson AJ, et al. Narrowdi indurre il miglioramento della crasi eritrocitaing and genomic annotation of the commonly deletria e togliere la dipendenza da trasfusioni nei paed region of the 5q- syndrome. Blood 2002; 99: 4638zienti con SMD e del(5q) isolata. Bibliografia 1. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO classification of tumours od hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC 2008: 88-107. 2. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976; 33: 451-8. 3. Boultwood J, Pellagatti A, McKenzie AN, et al. Advances in the 5q- syndrome. Blood 2010; 116: 580311. 4. Itzykson R, Fenaux P. Epigenetics of myelodysplastic syndromes. Leukemia 2013 Nov 19. doi: 10.1038/ leu.2013.343. [Epub ahead of print] 5. Tiu RV, Gondek LP, O’Keefe CL, et al. Prognostic impact of SNP array karyotyping in myelodysplastic syndromes and related myeloid malignancies. Blood 2011; 117: 4552-60. 6. Delhommeau F, Dupont S, Della Valle V, et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N Engl J Med 2009; 360: 2289-301. 7. Ernst T, Chase AJ, Score J, et al. Inactivating mutations of the histone methyltransferase gene EZH2 in myeloid disorders. Nat Genet 2010; 42: 722-6. 41. 12. Van den Berghe H, Cassiman JJ, David G, et al. Distinct haematological disorder with deletion of long arm of no. 5 chromosome. Nature 1974; 251: 437-8. 13. Jonasova A, Cermak J, Vondrakova J, et al. Thrombocytopenia at diagnosis as an important negative prognostic marker in isolated 5q- MDS (IPSS low and intermediate-1). Leuk Res 2012; 36: 222-4. 14. Greenberg P, Cox C, Le Beau MM, et al. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood 1997; 89: 207988. 15. Santini V, Alessandrino PE, Angelucci E, et al. Clinical management of myelodysplastic syndromes: update of SIE, SIES, GITMO practice guidelines. Leuk Res 2010; 34: 1576-88. 16. Malcovati L, Porta MG, Pascutto C, et al. Prognostic factors and life expectancy in myelodysplastic syndromes classified according to WHO criteria: a basis for clinical decision making. J Clin Oncol 2005; 23: 7594-603. 17. Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, et al. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes. Blood 2012; 120: 245465. 18. Voso MT, Fenu S, Latagliata R, et al. Revised International Prognostic Scoring System (IPSS) predicts 113 114 Recenti Progressi in Medicina, 105 (3), marzo 2014 survival and leukemic evolution of myelodysplastic syndromes significantly better than IPSS and WHO Prognostic Scoring System: validation by the Gruppo Romano Mielodisplasie Italian Regional Database. J Clin Oncol 2013; 31: 2671-7. 19. Mishra A, Corrales-Yepez M, Ali NA, et al. Validation of the revides international prognostic scoring system in treated patients with myelodysplastic syndromes. Am J Hematol 2013; 88: 566-70. Indirizzo per la corrispondenza: Dott. Cristina Mecucci Università di Perugia Ematologia Ospedale Santa Maria della Misericordia Piazzale Menghini 1 06156 Perugia E-mail: [email protected] 20. Patnaik MM, Hanson CA, Hodnefield JM, et al. Monosomal karyotype in myelodysplastic syndromes, with or without monosomy 7 or 5, is prognostically worse than an otherwise complex karyotype. Leukemia 2011; 25: 266-70. 21. Jädersten M, Saft L, Smith A, et al. TP53 mutations in low-risk myelodysplastic syndromes with del(5q) predict disease progression. J Clin Oncol 2011; 29: 1971-9.