Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle

110
Recenti Prog Med 2014; 105: 110-114
Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi
delle sindromi mielodisplastiche
Cristina Mecucci1
Riassunto. La diagnosi delle sindromi mielodisplastiche
(SMD) si basa su parametri ematologici, citopenia/e e morfologia midollare, e citogenetici che forniscono importanti
informazioni sia per la dimostrazione della clonalità sia per
l’identificazione di aberrazioni tipiche. La ricerca dei riarrangiamenti cromosomici si avvale del cariotipo con bandeggio che può essere integrato con un’analisi genomica a
maggiore risoluzione come la FISH e gli array. Un’anomalia
cromosomica specifica definisce l’entità clinico-patologica
inserita nella classificazione WHO 2008 come SMD con
del(5q) isolata. La citogenetica contribuisce anche in modo
significativo alla determinazione di punteggi con significato prognostico alla diagnosi di SMD, sia in termini di sopravvivenza sia in termini di evoluzione leucemica.
Diagnosis and prognosis in myelodysplastic syndromes. The
impact of cytogenetics.
Parole chiave. Citogenetica, diagnosi, prognosi, sindromi
mielodisplastiche.
Key words. Myelodysplastic syndromes, cytogenetics, diagnosis, prognosis.
Introduzione
la di leucemia acuta, che rappresenta la fase finale nella storia naturale di oltre il 30% delle SMD,
con evoluzione clonale. Un interessante apparente paradosso delle sindromi mielodisplastiche è la
concomitanza di citopenia periferica e ipercellularità midollare in circa l’80% dei casi di SMD, la cui
origine è legata a un fenomeno biologico ben caratterizzato che corrisponde a un aumento dell’apoptosi. Nel restante 20% di SMD con un midollo ipocellulare è importante considerare la diagnosi differenziale con le condizioni, congenite o
acquisite, che determinano un’insufficienza midollare1.
Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono a
tutt’oggi un capitolo problematico dell’ematologia
per ciò che concerne la diagnosi e gli indirizzi terapeutici. Le SMD vengono classicamente introdotte come un gruppo eterogeneo di disordini mieloidi la cui diagnosi corretta necessita dell’unione
dell’analisi morfologica con quella citogenetica. Il
sospetto diagnostico si pone a partire dal sangue
periferico che può mostrare una (mono-), due (bi-),
tre (pan-) citopenia(e) e segni di displasia a carico
di una o più serie cellulari. Con il termine “displasia” sul piano morfologico si intende la presenza di anomalie morfologiche del nucleo e/o del
citoplasma evidenziabili nello striscio di sangue
periferico e midollare. La morfologia è inoltre indispensabile a valutare la quota di cellule blastiche nella serie mieloide, la cui percentuale va a
determinare i cut-off delle distinte entità contemplate sia nella classificazione FAB (French-American-British) sia nella più recente WHO1,2. La
crescente percentuale dei blasti nel corso del follow-up dà inoltre ragione dell’esistenza di un continuum tra la condizione di mielodisplasia e quel1Ematologia, Università di Perugia.
Pervenuto il 4 dicembre 2013.
Summary. Diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS)
is based on cytopenia(s), bone marrow morphology, and
cytogenetics. Cytogenetics is helpful both to assess clonality and to identify typical aberrations. Chromosomal rearrangements are usually investigated through the karyotype after chromosome banding. Further insights may be
obtained from higher resolution genome technologies,
such as FISH and SNP arrays. One distinct clinico-pathologic entity diagnosed by the presence of an isolated deletion
at chromosome 5q, so-called MDS with isolated del(5q), has
been included in the WHO 2008 classification. Cytogenetics
is also necessary to calculate prognostic scores at diagnosis
of MDS. Chromosome abnormalities predict both survival
and MDS evolution to acute myeloid leukemia.
Citogenetica
La definizione “storica” si riferisce all’analisi
cromosomica corrispondente al cariotipo che classifica i cromosomi sulla base del bandeggio. Tuttavia, nell’accezione moderna l’analisi citogenetica si
è arricchita di nuovi approcci mutuati dalla biologia
molecolare, quali la fluorescence in situ hybridization (FISH) e i single nucleotide polimorphisms
(SNP) array.
C. Mecucci: Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle SMD
Citogenetica convenzionale
L’analisi citogenetica a tutt’oggi clinicamente
rilevante nelle SMD è costituita dalla cosiddetta
“citogenetica convenzionale”, vale a dire il cariotipo, previo bandeggio cromosomico, che consente di
rilevare riarrangiamenti numerici (monosomie e
trisomie parziali o di interi cromosomi) e strutturali (inversioni, traslocazioni, delezioni). Una caratteristica importante che, sul piano biologico, differenzia le SMD dalle leucemie acute mieloblastiche (LAM) e dai disordini mieloproliferativi cronici (MPD) è una predominanza di delezioni cromosomiche rispetto a traslocazioni molto più frequenti nelle LAM e nei MPD. L’aplo-insufficienza,
intesa come riduzione del prodotto del gene mancante fino al 50% del normale, è il risultato biologico ampiamente confermato nelle delezioni associate a SMD, con particolare riferimento alla
del(5q), e ha un ruolo importante nell’inattivazione di geni determinanti nella patogenesi della malattia, inclusi geni soppressori3. A questo proposito è molto importante ricordare che il processo di
inattivazione genica nelle SMD è correlato anche a
fenomeni epigenetici (metilazione e acetilazione)4.
FISH
Comunemente indicata anche con il termine citogenetica molecolare, la FISH è di rilievo nella
diagnosi delle SMD sia nella ricerca di anomalie
criptiche nei nuclei in interfase a complemento di
una citogenetica convenzionale fallita o normale,
sia nella precisazione della dimensione del clone
includendo nell’analisi le cellule non proliferanti.
Un ulteriore importante valore aggiunto della
FISH è costituito dalla possibilità di utilizzare sonde specifiche per singoli geni ottenendo così una
interpretazione molecolare più precisa rispetto alle anomalie cromosomiche.
rozigosi senza perdita di materiale genomico (CNV,
neutral copy number variations). Nelle sindromi
mielodisplastiche neutral CNV a livello del cromosoma 4q, 7q, 11q, sono associate rispettivamente a
mutazioni dei geni TET2, EZH2, CBL6-8.
Diagnosi di SMD
La citogenetica convenzionale mostra un cariotipo anormale nel 40-50% delle SMD. Il tipo e la distribuzione delle anomalie sono riportati nella figura 1, che, accanto a sottogruppi di anomalie ricorrenti, mostra anche anomalie sporadiche o rare in
circa il 2% dei casi. Tutte le altre anomalie possono
distribuirsi nei diversi sottogruppi FAB o WHO.
Sebbene recentemente il sangue periferico sia stato proposto come interessante surrogato per la ricerca di marcatori genetici con FISH o SNP array9,
il campione midollare resta indispensabile per la
diagnosi di certezza di SMD. La dimostrazione di
un’anomalia citogenetica, anche se sporadica, costituisce un elemento determinante per la diagnosi
di SMD in quanto dimostrazione di clonalità. Tuttavia, è molto importante sottolineare che la perdita del cromosoma Y, -Y, o la delezione del cromosoma 20, del(20q), o la trisomia 8, se presenti come
anomalie cariotipiche isolate, ma in assenza di evidente mielodisplasia, non sono di per sé sufficienti
per una conclusione diagnostica verso una SMD.
D’altra parte, seppure raramente, una leucemia
acuta mieloblastica associata a riarrangiamenti tipici, quali la t(8;21)/AML1/ETO, o traslocazioni del
gene MLL o del gene EVI1, può presentarsi con le
stigmate morfologiche della SMD, a rapidissima
evoluzione leucemica1. Il cariotipo è conditio sine
qua non per la diagnosi dell’entità SMD con del(5q)
isolato1. L’anomalia cromosomica del(5q) consiste
nella perdita di materiale genomico a livello del
braccio lungo (q). La delezione è definita interstiziale perché la porzione telomerica è sempre mantenuta, i punti di rottura centromerici e telomerici
SNP array
È un tipo di analisi che
permette di ottenere un cariotipo molecolare ad altissima risoluzione, quando confrontato con il cariotipo con
bandeggio, che utilizza sequenze polimorfe a copertura dell’intero genoma. L’approccio è molto informativo
per l’identificazione di perdite o acquisizioni dei marcatori genomici (CNV, copy
number variations)5. Da
questo approccio si ottengono informazioni su un particolare meccanismo che, in
seguito a ricombinazione somatica, vede perdita di ete-
2,6%
2,9%
3,4%
1,6%
1,6%
0,5%
0,3%
5,2%
5,7%
7,6%
10%
58,6%
Cariotipo normale
Cariotipo complesso
Del(5q) isolata
Anomalie isolate
Perdita del cromosoma y
Trisomia 8
Del(20q)
Del(Sq) +1 anomalia
Non complessa -7/del(7q)
Del(11q)
Trisomia 8 +1 anomalia
Cloni indipendenti
Figura 1. Distribuzione delle anomalie cariotipiche in una serie consecutiva di 382 MDS (casistica
personale).
111
112
Recenti Progressi in Medicina, 105 (3), marzo 2014
sono variabili e, conseguentemente, la dimensione del
A
B
tratto di cromosoma deleto,
anche se esiste una regione
comune di delezione (CDR)
C
che caratterizza tutti i caRP11-946D14
10,11. È su questa regione
si
Orange, RPS14
che si basa l’analisi di FISH
con l’utilizzo di sonde che
evidenziano la perdita di geni/loci critici e inclusi nella
CDR (figura 2). L’analisi di
FISH, sebbene molto valida
nella valutazione della diD
mensione del clone e nell’identificazione di cloni anche molto piccoli, non può essere considerata un surrogato della citogenetica convenmiR-145 5q32
zionale alla diagnosi, perché,
5q32
CSF1R
sebbene permetta di identi5q33.1
RPS14
ficare la del(5q), non documenta l’anomalia come iso5q33.1
SPARC
lata, non permettendo di
escludere la presenza di al5
tre anomalie associate. Da
questo punto di vista l’analisi di SNP, che consente di riFigura 2. A. Cariotipo con bandeggio G di un caso di MDS con del(5q) isolata. B. Ideogramma del
costruire l’intero assetto crocromosoma 5 con indicazione dei geni rilevanti nella patogenesi e appartenenti alla regione comosomico, è senz’altro molto
mune di delezione. C. Esempio di FISH in nuclei in interfase con una sonda fluorescente che ricopiù informativa perché in
nosce il gene RPS14 deleto nelle cellule con del(5q): 2 segnali=nucleo con 5q normale; 1 segnale=
nucleo con del(5q). D. Esempio di cariotipo con SNP array in un caso con del(5q) isolata.
grado di rilevare qualsiasi
sbilanciamento cromosomico accompagnante, ma non
eventuali traslocazioni bilanciate. Tuttavia, un clone può essere rilevato dapiù importanti fattori prognostici indipendenti nelgli SNP solo se rappresentativo di almeno il 20-30%
le SMD14. Il cariotipo contribuisce allo scoring con
della popolazione cellulare in esame. A tutt’oggi,
anomalie specifiche a basso, intermedio e alto riquindi, il mezzo più potente per la diagnosi delschio (tabella 1). La stratificazione prognostica
l’entità WHO con del(5q) rimane la citogenetica
IPSS include quattro livelli di rischio: basso (score
convenzionale, anche in considerazione della con0); intermedio1 (score 0.5-1); intermedio2 (score
comitanza di una quota rilevante di cellule normali
1.5-2.0); alto (score >2.5) e ha avuto un’ampia valialla diagnosi. Importante notare che l’entità WHO
dazione clinica in tutto il mondo. Ha anche costicomprende, ma non si identifica con la cosiddetta
tuito la base per linee-guida terapeutiche15. L’IPSS
“sindrome 5q”, la cui costellazione clinico-ematoloè stato rielaborato sulla base delle indicazioni forgica è costituita da: prevalenza del sesso femmininite dall’Organizzazione Mondiale della Sanità
le, anemia macrocitica, serie eritroide ipoplastica,
(WHO), includendo l’esigenza trasfusionale prima,
micromegacariociti monolobulati, piastrine nore il grado di anemia, successivamente, come immali o aumentate12. Quest’ultimo parametro emaportanti fattori prognostici insieme alle categorie
tologico, non irrilevante sul piano prognostico13,
citogenetiche indicate dall’IPSS16. La più moderna
non viene precisato nella definizione WHO che può
stratificazione prognostica ha ulteriormente rivisiincludere anche casi con piastrinopenia alla diatato il ruolo della citogenetica in quello che oggi viene definito IPSS-R17 che continua a basarsi su cignosi1.
togenetica, numero di citopenie periferiche, percentuale di blasti midollari, ma con una citogenetiStratificazione prognostica
ca ampliata da tre a cinque sottogruppi (tabella 1).
Vengono introdotti i sottogruppi di SMD a prognoLa stratificazione prognostica dei pazienti con
si molto buona corrispondenti ai cariotipi -Y e
SMD segue le indicazioni del sistema internaziodel(11q), e SMD a prognosi molto cattiva, corrinale di scoring (International Prognostic Scoring
spondenti a cariotipi complessi con più di tre anomalie. Numerose esperienze di validazione in stuSystem - IPSS) che identifica la percentuale dei
di multicentrici stanno supportando l’IPSS-R come
blasti midollari, il numero delle citopenie periferiottimo strumento di stratificazione prognostica alche e le anomalie citogenetiche specifiche come i
C. Mecucci: Importanza della citogenetica per la diagnosi e la prognosi delle SMD
la diagnosi e di scelta dell’indirizzo terapeutico18,19. A Tabella 1. Raggruppamenti prognostici su base citogenetica nell’IPPS e IPPS-R.
complemento, altre variabiRischio
IPSS
IPSS-R
li che possono influenzare
la prognosi sono rappresen- Molto basso
del(11q)
-Y
tate dai livelli sierici della
lattatodeidrogenasi (LDH),
Basso
cariotipo nl
cariotipo nl
della ferritina, della ß2-mi-Y
del(5q)
croglobulina nonché della fidel(5q)
del(12p)
brosi midollare e dalle codel(20q)
del(20q)
morbilità del paziente17. Ulanomalie clonali
del(7q)
teriori importanti contribu- Intermedio
no basso/no alto
+8
ti alle precisazioni prognoi(17q)
stiche sono forniti dalla de+19
finizione del cariotipo moaltre anomalie clonali
nosomico e dall’integraziocariotipo complesso (>3 anl)
inv(3)/t(3q)/del3q
ne dell’analisi molecolare Alto
anomalie cromosoma
-7/del(7q)
della del(5q). Il cariotipo
con complesso: 3anl
monosomico si definisce come un cariotipo anormale Molto alto
cariotipo complesso >3anl
che contiene o la perdita di
due autosomi, o la perdita
di un autosoma più un riarrangiamento strutturale. In altri termini, questa
8. Grand FH, Hidalgo-Curtis CE, Ernst T, et al. Frequent CBL mutations associated with 11q acquired
definizione deriva da una sottoclassificazione neluniparental disomy in myeloproliferative neol’ambito dei cariotipi complessi, e, come atteso, la
plasms. Blood 2009; 113: 6182-92.
presenza di un cariotipo monosomico correla con
9. Mohamedali AM, Alkhatabi H, Kulasekararaj A, et
una prognosi sfavorevole20. Nel versante invece
al. Utility of peripheral blood for cytogenetic and
delle SMD a prognosi relativamente “benigna”, in
mutation analysis in myelodysplastic syndrome. Bloparticolare quelle associate a del(5q), il decorso
od 2013; 122: 567-70.
viene decisamente modificato dalla presenza alla
10. Nofrini V, La Starza R, Crescenzi B, et al. Diffediagnosi di un clone midollare con mutazione del
rent boundaries characterize isolated and non-iso21
gene p53 . Il clone con la mutazione si espande
lated 5q deletions in myelodysplastic syndromes
nell’evoluzione leucemica e non risulta sensibile
and acute myeloid leukemias. Haematologica
2012; 97: 792-4.
alla lenalidomide, una molecola peraltro capace
11. Boultwood J, Fidler C, Strickson AJ, et al. Narrowdi indurre il miglioramento della crasi eritrocitaing and genomic annotation of the commonly deletria e togliere la dipendenza da trasfusioni nei paed
region of the 5q- syndrome. Blood 2002; 99: 4638zienti con SMD e del(5q) isolata.
Bibliografia
1. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO
classification of tumours od hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC 2008: 88-107.
2. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias.
French-American-British (FAB) co-operative group.
Br J Haematol 1976; 33: 451-8.
3. Boultwood J, Pellagatti A, McKenzie AN, et al. Advances in the 5q- syndrome. Blood 2010; 116: 580311.
4. Itzykson R, Fenaux P. Epigenetics of myelodysplastic syndromes. Leukemia 2013 Nov 19. doi: 10.1038/
leu.2013.343. [Epub ahead of print]
5. Tiu RV, Gondek LP, O’Keefe CL, et al. Prognostic impact of SNP array karyotyping in myelodysplastic
syndromes and related myeloid malignancies. Blood
2011; 117: 4552-60.
6. Delhommeau F, Dupont S, Della Valle V, et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N Engl J Med
2009; 360: 2289-301.
7. Ernst T, Chase AJ, Score J, et al. Inactivating mutations of the histone methyltransferase gene EZH2 in
myeloid disorders. Nat Genet 2010; 42: 722-6.
41.
12. Van den Berghe H, Cassiman JJ, David G, et al.
Distinct haematological disorder with deletion of
long arm of no. 5 chromosome. Nature 1974; 251:
437-8.
13. Jonasova A, Cermak J, Vondrakova J, et al. Thrombocytopenia at diagnosis as an important negative
prognostic marker in isolated 5q- MDS (IPSS low
and intermediate-1). Leuk Res 2012; 36: 222-4.
14. Greenberg P, Cox C, Le Beau MM, et al. International scoring system for evaluating prognosis in
myelodysplastic syndromes. Blood 1997; 89: 207988.
15. Santini V, Alessandrino PE, Angelucci E, et al. Clinical management of myelodysplastic syndromes: update of SIE, SIES, GITMO practice guidelines. Leuk
Res 2010; 34: 1576-88.
16. Malcovati L, Porta MG, Pascutto C, et al. Prognostic
factors and life expectancy in myelodysplastic syndromes classified according to WHO criteria: a basis
for clinical decision making. J Clin Oncol 2005; 23:
7594-603.
17. Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, et al. Revised international prognostic scoring system for
myelodysplastic syndromes. Blood 2012; 120: 245465.
18. Voso MT, Fenu S, Latagliata R, et al. Revised International Prognostic Scoring System (IPSS) predicts
113
114
Recenti Progressi in Medicina, 105 (3), marzo 2014
survival and leukemic evolution of myelodysplastic
syndromes significantly better than IPSS and
WHO Prognostic Scoring System: validation by the
Gruppo Romano Mielodisplasie Italian Regional
Database. J Clin Oncol 2013; 31: 2671-7.
19. Mishra A, Corrales-Yepez M, Ali NA, et al. Validation of the revides international prognostic scoring
system in treated patients with myelodysplastic syndromes. Am J Hematol 2013; 88: 566-70.
Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Cristina Mecucci
Università di Perugia
Ematologia
Ospedale Santa Maria della Misericordia
Piazzale Menghini 1
06156 Perugia
E-mail: [email protected]
20. Patnaik MM, Hanson CA, Hodnefield JM, et al. Monosomal karyotype in myelodysplastic syndromes,
with or without monosomy 7 or 5, is prognostically
worse than an otherwise complex karyotype. Leukemia 2011; 25: 266-70.
21. Jädersten M, Saft L, Smith A, et al. TP53 mutations in low-risk myelodysplastic syndromes with
del(5q) predict disease progression. J Clin Oncol
2011; 29: 1971-9.