PCR - Associazione Studenti di Agraria IAAS Sassari

La reazione PCR
Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria
Corso di Genetica Agraria – Giovanna Attene
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
La reazione a catena della polimerasi (PCR = Polymerase Chain
Reaction) è una tecnica estremamente potente che consente di
amplificare sequenze di DNA milioni di volte in poche ore.
La tecnica venne inventata nel 1983 da K. Mullis che ricevette per
questa scoperta il premio Nobel per la Chimica dieci anni più tardi.
L’idea di Mullis si basa sull’intuizione che tutti i processi di
replicazione del DNA in vivo possono essere fatti avvenire in vitro
e ciclicamente in modo controllato per copiare milioni di volte
(=amplificare) determinate sequenze di DNA
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
In vivo
Elicasi
RNA polimerasi
FASI
Denaturazione
doppia elica
(rottura legami
idrogeno)
Innesco per la
DNA polimerasi
(i primer formano legami
idrogeno con il filamento DNA
in zone di omologia)
DNA polimerasi
+ Nucleotidi
Allungamento
del filamento
In vitro
°C
alte temperature
(94°C)
primer sintetici di DNA
+
Riduzione delle temperature
°C
DNA polimerasi
+ Nucleotidi
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
‰ Risolutiva fu la scoperta che la DNA polimerasi del
batterio Thermus acquaticus (Taq polimerasi) che è
adattato a vivere nelle pozze di acqua bollente in
prossimità dei geysers, resiste anche a temperature
elevate (prossime ai 100 °C) con un ottimo di
funzionamento a 72 °C
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
La PCR consiste fondamentalmente di 3 fasi:
1. DENATURAZIONE
2. APPAIAMENTO
3. ESTENSIONE
• DNA stampo
• Primers
• dNTP
• DNA polimerasi
• Buffer
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
1. Denaturazione del DNA stampo e a doppia elica e (in seguito a riscaldamento).
5’
3’
3’
5’
94-96 °C
5’
3’
3’
5’
2. Appaiamento (annealing) dei primer al DNA stampo
5’
3’
3’
5’
37-68 °C
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
Immaginiamo ora di ripetere per più volte (cicli) la sequenza
denaturazione-innesco-allungamento. Poiché il numero di copie del
DNA “bersaglio” raddoppia ad ogni ciclo denaturazione-innescoallungamento dopo poche ore si ha l’accumulo (amplificazione) di uno
o pochi tratti specifici del DNA stampo secondo una crescita
esponenziale
Denaturazione
Estensione
Inizio
Accoppiamento
(annealing)
35 – 40 cicli:
Æ Animazione
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
Crescita esponenziale della sequenza “bersaglio”
1 (20)
2 (21)
4 (22)
8 (23)
16 (24) …
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
o reazione a catena della polimerasi
Il termociclatore (thermalcycler)
Vista dall’alto