Infezioni da HPV:
prime esperienze nel campo della
Biologia Molecolare
Dott.ssa Rosa Tripaldi
Taranto, 3 Novembre 2004
HPV
Dr.ssa Rosa Tripaldi
2
Papovaviridae
• 2 Genera:
– Papillomaviruses:
• Human, Rabbit, Bovine, Canine, Equine
– Polyomaviruses:
• Mice, BK & JC viruses (man), RK virus (rabbit), SV40
(monkey)
• ds DNA, 45nm, non-enveloped, icosahedral
• Cyclic, infectious when separated from capsid
Dr.ssa Rosa Tripaldi
3
Human Papillomavirus (HPV)
General:
• Ether-resistant, acid & heat stable
• Circular dsDNA ~8kb, non-enveloped
• Icosahedral,72 capsomeres, 55nm diameter
• Surface Antigen
• Over 100 genotypes*, High & Low Risk strains
• Causes warts; transforms cells
• Polycistronic, 8 ORF
• Genome: 3 Regions
• Replicates in Nucleus
• Plasmid-like state
Incidenza e distribuzione dei tumori da HPV
Dr.ssa Rosa Tripaldi
5
Il primo tumore solido che è stato
riconosciuto essere di origine virale è
il carcinoma della cervice …
e l’ HPV ne è l’agente causale
Dr.ssa Rosa Tripaldi
6
Ruolo dell’HPV nel tumore cervicale
“ A partire dalla seconda metà degli anni ‘90 numerosi studi hanno dimostrato che il
Papilloma Virus Umano (HPV) è presente nella quasi totalità dei tumori cervicali
“ La persistenza di alcuni tipi virali aumenta la probabilità di sviluppo di un tumore
cervicale
“ Attualmente sono stati identificati 200 tipi di HPV, di cui 85 genotipi ben
caratterizzati
“I genotipi HPV coinvolti nelle infezioni genitali sono circa una trentina, distinti in
basso e alto rischio oncogeno
Dr.ssa Rosa Tripaldi
7
La prevalenza dell’HPV nei Carcinomi
della cervice è praticamente totale: 99.8%
Una relazione più forte di quella
tra tabacco e CA polmonare
tra epatite B e CA epatico
Dr.ssa Rosa Tripaldi
8
A livello mondiale il carcinoma cervicale è la prima causa di morte per tumore
nella popolazione femminile:
470 mila nuovi casi/233 mila decessi all’anno
In Europa è la seconda, dopo il tumore al polmone:
65 mila nuovi casi/28 mila decessi all’anno
Dr.ssa Rosa Tripaldi
9
Struttura del virus
HPV: virus a dsDNA circolare di circa 8000 bp con capside proteico
3 Regioni:
LLR=Long Regulatory Region (non coding)
E=Early Region (encodes proteins)
L=Late Region (encodes capsid proteins)
HPV: Life Cycle
Copyright © 1999 Academic Press
Dr.ssa Rosa Tripaldi
11
HPV Genome: Proteins
•
•
•
•
•
•
•
•
E1: Initiation of DNA replication (helicase)
E2: Transcriptional regulation/DNA replication
E4: Late NS protein; Disrupts cytoskeleton
E5: Transforming protein, interacts with growth
factor receptors, e.g. PDGF
E6: Transforming protein, binds to p53 leading to
degradation
E7: Transforming protein, binds to pRB
L1: Major capsid protein (capsomeres)
L2: Minor capsid protein
Dr.ssa Rosa Tripaldi
12
Dr.ssa Rosa Tripaldi
13
La persistenza dell’infezione da HPV
è condizione necessaria allo sviluppo
del cervicocarcinoma
Dr.ssa Rosa Tripaldi
14
Progressione a Carcinoma indotta da HPV
“ L’HPV è responsabile della alterata regolazione del ciclo cellulare
che conduce alla trasformazione maligna
“ La presenza persistente di HPV è condizione essenziale…
…anche se da sola non basta allo sviluppo del Carcinoma cervicale
HPV
infezione
HPV
infezione
persistente
Fattori
Immunologici
Alterata
regolazione
cellulare
CIN
“High grade
Co-carcinogeni
Carcinoma
Invasivo
Progressione della malattia:
dall’infezione HPV a Cervicocarcinoma : > 10 anni
Persistenza
(oltre 1 anno)
Cervice
normale
Infezione
Clearance
Cervice
con
Progressione
Lesione
precancerosa
Infezione
HPV
Cancro
Invasione
Regressione
Risoluzione spontanea
6-13 anni
nell’ 80 % delle infezioni
Anormalità citologiche
moderate
Dr.ssa Rosa Tripaldi
16
“Lo sviluppo del tumore cervicale è preceduto dalla comparsa di lesioni pre-cancerose che
impiegano molti anni ad evolvere in carcinoma invasivo
“poiché sono lesioni asintomatiche possono essere rilevate solo grazie a programmi di
screening
“se rilevate per tempo possono essere eliminate con intervento ambulatoriale di efficacia quasi
del 100%
UN CORRETTO PROGRAMMA DI SCREENING POTREBBE ELIMINARE
COMPLETAMENTE IL TUMORE CERVICALE
Dr.ssa Rosa Tripaldi
17
Terminologia
“ CIN: cervical intraepithelial neoplasia, di grado I, II o III stabilito in seguito a prelievo bioptico
ed esame istologico
“ ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance; è la forma più lieve di anomalia
citologica
“ LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion (CIN I nel vecchio sistema di classificazione) di
solito a regressione spontanea
“ HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion; è l’anomalia non cancerosa più grave e
richiede trattamento immediato
“ Displasia: anomalie nella divisione cellulare o nella morfologia
“ Carcinoma in situ: forma di HSIL refertata al Pap test come tumore cervicale
Prevalenza di HPV
100
90
80
HPV 70
DNA 60
50
%
40
30
20
10
0
88.8%
>95%
72.9%
55.0%
11.2%
Normal
ASCUS
Low-CIN High-CIN Invasive
Cancer
Dr.ssa Rosa Tripaldi
19
Contatto con HPV: quasi sempre regressione spontanea
La persistenza di HPV ‚high risk‛ può condurre a stati pre-cancerosi
(CIN)
La presenza di HPV e CIN3 è condizione necessaria per l’accumulo di
mutazioni random che possono portare allo sviluppo del tumore
cervicale
Dr.ssa Rosa Tripaldi
20
Sensibilità relativa delle tecniche di analisi
degli acidi nucleici
Dr.ssa Rosa Tripaldi
21
PCR
1984 Kary Mullis at Cetus
Dr.ssa Rosa Tripaldi
22
Tipologia di campione
• Materiale istologico
sezioni tagliate al microtomo di materiale fissato
ed incluso
• Materiale cellulare a fresco prelevato in
sede cervico-vaginale
sospensione di cellule prelevate mediante
Bactopick o Cytobrush dall’eso-endocervice,
fornici e vagina
Dr.ssa Rosa Tripaldi
23
Percorso diagnostico
HPV DNA screening
Se positivo
HPV Genotipizzazione
Dr.ssa Rosa Tripaldi
24
Fasi del processo analitico
HPV DNA screening
• Estrazione
• Amplificazione
• Rilevazione
Dr.ssa Rosa Tripaldi
25
Estrazione
• In generale l’acido nucleico è
liberato dalla cellula per digestione
con proteinasi K, lisi con agenti
caotropici, lisi osmotica a caldo o
lisi alcalina a caldo.
• A questa prima fase può seguire
una purificazione con solventi
organici, resine, matrici di silice,
precipitazione in alcoli.
Dr.ssa Rosa Tripaldi
26
Amplificazione
.
• Viene utilizzata una
sequenza della
regione L1, comune a
circa 40 tipi di HPV,
compresi tutti quelli
d’interesse clinico.
Dr.ssa Rosa Tripaldi
27
HPV Genome
8 ORF
Dr.ssa Rosa Tripaldi
28
Rivelazione
• La rivelazione degli
amplificati è condotta
mediante elettroforesi
in gel di agarosio, in
tampone TBE 1x,
colorato con bromuro
di etidio
Dr.ssa Rosa Tripaldi
29
standard interno 600 bp
Frammento
specifico 450 bp
Dr.ssa Rosa Tripaldi
30
HPV GENOTIPIZZAZIONE
• Sui casi positivi si esegue la tipizzazione:
alto rischio (16,18,31,33,35,45,52,58)
basso rischio (6,11)
Dr.ssa Rosa Tripaldi
31
Strategie di tipizzazione dell’HPV
Dr.ssa Rosa Tripaldi
32
HPV – Genotipizzazione
Dr.ssa Rosa Tripaldi
33
HPV ” Genotipizzazione
Dr.ssa Rosa Tripaldi
34
1.
Organizzazione di
Laboratorio e
strumentazione
necessaria
2. Aspetti
pre-analitici
4. Il Sistema di
Garanzia di
Qualità Totale
3. Fattori interferenti
con le procedure
analitiche
Dr.ssa Rosa Tripaldi
35
Ricevimento e
accettazione del campione
Flusso di lavoro unidirezionale
Preparazione
del campione
Preparazione
del reagente e
conservazione
Pre-amplificazione
reazione iniziale
Conservazione
del kit
Amplificazione
Area priva del prodotto PCR
Area contenente il prodotto PCR
Analisi del
prodotto
della PCR
Stoccaggio concentrato
di controlli positivi
conservati
Dr.ssa Rosa Tripaldi
36
Abbinamento dello screening con Pap test
e conferma con HPV
Citologia cervicale di routine: Pap test
ASC-US: diagnosi citologica
HPV DNA test sui campioni cellulari
Positivo
Negativo
Eseguire Colposcopia
Ripetere il Pap Test entro 6 mesi
Risultati Pap Anomali,
ASC-US
e HPV
positivo
Eseguire Colposcopia
Risultati Normali
Pap test
ASC-US Pap
e HPV
negativo
citologia cervicale
di screening
citologia cervicale
di screening
Dr.ssa Rosa Tripaldi
* Source: ACCSP Guidelines – JAMA
37
Linee guida dell’ESIDOG (European Society for Infectious and Immunological Diseases in
Obstetrics and Gynaecology)
L’impiego di test HPV è stato valutato per le seguenti categorie:
“donne > 30 anni: screening primario del tumore cervicale in combinazione con l’esame
citologico
“ pazienti con referti citologici indefiniti (ASC-US)
“ pazienti con stadi precancerosi lievi e moderati (LSIL, HSIL) per prevederne la regressione, la
persistenza o la progressione
“ pazienti già sottoposte a trattamento per CIN (displasia) e carcinoma cervicale
Dr.ssa Rosa Tripaldi
38
Attuale utilizzo clinico accettato del test
HPV DNA :
“ Conferma dei casi ASCUS ( TRIAGE )
“ Follow up dei casi CIN 2, 3 per predire la regressione ”
progressione
“ Dopo trattamento per displasia per predire la possibilità di recidive
Dr.ssa Rosa Tripaldi
39
