Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein
Codice N. Y 5200
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
Fluorescein-Conjugated Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe è designata per la rilevazione dell’infezione da
EBV latente mediante ibridazione in situ su sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate in formalina. Si è
riscontrato che questa sonda dà segnali positivi in sezioni di tessuti linfoidi di pazienti con linfoma di Burkitt,
linfoma di Hodgkin e mononucleosi infettive, così come nel tessuto epiteliale derivante ad es. da leucoplachia e
carcinoma nasofaringeo. Questa sonda è efficacemente utilizzabile anche in citometria a flusso. Una procedura
è disponibile su richiesta.
Reagente fornito
La Fluorescein-Conjugated Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe è una miscela pronta all’uso di quattro
15-meri. Le sonde individuali ad acido nucleico peptidico (PNA) sono state sintetizzate con un PerSeptive
Biosystem Expedite Synthesizer utilizzando la chimica Fmoc-PNA standard. Le sonde a PNA sono state
marcate con l’aptene 5-carbossi-fluoresceina per la successiva visualizzazione con Dako PNA ISH Detection
Kit, codice n. K 5201. Il reagente è fornito in forma liquida in soluzione di ibridazione contenente formamide
30%, solfato di destrano 10%, pirofosfato di sodio 0,1%, polivinilpirrolidone 0,2%, Ficoll 0,2%, Na2 EDTA 5
mmol/L, Tris/HCl 50 mmol/L, pH 7,5, NaCl 10 mmol/L. Ogni fiala contiene 1 mL, che corrisponde a 40 test (25 µL
per test).
Bersaglio
La EBER PNA Probe è complementare a due EBER RNA codificati dall’Epstein-Barr virus (EBV) (1-3).
Specificità
La specificità è stata accertata testando la sonda su tessuto o cellule contenenti EBV, CMV, HHV-6, HSV, VZV
o HBV. Solo il tessuto infettato da EBV dava un risultato positivo.
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. È importante evitare la contaminazione di tamponi, strumenti di vetro e altra attrezzatura con la RNasi,
poiché la sonda a PNA rileva l’RNA. Questo è particolarmente importante fino alla conclusione della fase di
ibridazione della procedura descritta di seguito. La RNasi non digerisce i duplex PNA-RNA e nucleasi, proteasi
o peptidasi non sono in grado di degradare la sonda a PNA (4). Si consiglia di marcare chiaramente e
immagazzinare in un luogo predisposto strumenti di vetro, di plastica e altri oggetti che devono essere utilizzati
per gli esperimenti con RNA. I metodi di inattivazione della RNasi in soluzione sono descritti in (5). La RNasi
sugli strumenti in vetro può essere inattivata con un’incubazione overnight a 200 °C. Se si utilizzano contenitori
puliti (RNasi-free), per la diluizione delle soluzioni madri e per i lavaggi generalmente è sufficiente usare acqua
sterile, acqua Milli-Q o equivalente.
3. La sonda contiene formamide ≥25-<50% e cloruro di sodio ≥1-<3%. Etichetta riportata sul prodotto:
Pericolo
H360D
P201
P280
P308 + P313
P405
P501
Può nuocere al feto.
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı.
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica.
Conservare sotto chiave.
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali,
azionali e internazionali.
Conservazione
Conservare al buio a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza, stampata sulla fiala. Se i reagenti non
sono conservati secondo le condizioni prescritte, è necessario che l’operatore ne verifichi le condizioni. Non vi
sono segni specifici che possono indicare l’instabilità del prodotto, quindi un controllo positivo deve essere
testato contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora si osservi una colorazione inattesa, che non
può essere giustificata da variazioni delle procedure di laboratorio, e si sospetti un problema del prodotto,
contattare il nostro Servicio Tecnico.
Prodotti associati
Dako fornisce un kit di rilevazione di sonde a PNA coniugate con fluoresceina. Il kit Dako PNA ISH Detection,
codice n. K 5201, contiene tutti i reagenti necessari per l’esecuzione dell’ibridazione in situ. La procedura del kit
è semplice e la maggioranza dei reagenti è pronta all’uso. Dako fornisce anche una Fluorescein-Conjugated
Epstein-Barr Virus (Lytic) PNA Probe, codice n. Y 5203, per la rilevazione dell’EBV in fase litica.
Referimenti bibliografici
1. Kieff E. Epstein-Barr virus and its replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors. Fields Virology.
3rd ed. Philadelphia. New York: Lippincott-Raven; 1996. p. 2343-96.
2. Glickman JN, Howe JG, Steitz JA. Structural analyses of EBER1 and EBER2 ribonucleoprotein particles
present in Epstein-Barr virus-infected cells. J Virol 1988;62:902-11.
3. Wu T-C, Mann RB, Epstein JI, MacMahon E, Lee WA, Charache P, et al. Abundant expression of EBER1
small nuclear RNA in nasopharyngeal carcinoma. A morphologically distinctive target for detection of
Epstein-Barr virus in formalin-fixed paraffin-embedded carcinoma specimens. Am J Pathol
1991;138:1461-9.
(128773-001)
P04166IT_01_Y520001-2/2015.09 p. 1/3
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4. Demidov VV, Potaman VN, Frank-Kamenetskii MD, Egholm M, Buchard O, Sönnichsen SH, et al. Stability
of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. Biochem Pharmacol 1994;48:1310-3.
5. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Procedura di un giorno di ibridazione in situ per la rilevazione di RNA con sonde a PNA
La procedura è stata sviluppata per sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate in formalina e fa uso del kit Dako PNA ISH Detection, codice nr.
K 5201. I reagenti inclusi in questo kit, come anche le condizioni di ibridazione e di lavaggio, sono stati modificati al fine di ottenere dei risultati
ottimali con le sonde a PNA coniugate con fluoresceina Dako. Un controllo positivo del tessuto deve essere testato contemporaneamente ai
campioni.
NOTA:
Tutte le incubazioni sono a temperatura ambiente, tranne quando stabilito diversamente.
Reidratazione
Immergere i vetrini del tessuto in xilene.
2 x 5 min
Immergere in etanolo 99%.
2 x 3 min
Immergere in etanolo 95%.
2 x 3 min
Immergere in acqua pura. La vaschetta deve essere RNasi-free1.
3 min
Circondare il campione con Dako Pen, codice nr. S 2002.
Immergere in acqua pura.
Pretrattamento
2 x 3 min
Porre i vetrini in una camera umida (usare guanti puliti).
Appena prima dell’uso, diluire la quantità necessaria di Proteinasi K (fiala nr. 1)
1:10 in TBS, ad es. utilizzando 11 gocce della fiala nr. 1 (o 500 µL) in 4.5 mL di
TBS2.
Aggiungere 150 µL di Proteinasi K diluita a ciascuna sezione3.
Ibridazione
Incubare.
20-30 min
Immergere i vetrini in acqua pura.
2 x 3 min
Immergere i vetrini in etanolo 95%.
~ 10 s
Far asciugare all’aria i vetrini in una camera umida.
~ 5 min
Aggiungere 1-2 gocce di sonda a PNA coniugata con fluoresceina alla sezione di
tessuto. Su sezioni separate aggiungere le sonde di controllo, fiale nr. 2 e 3.
Coprire le sezioni con il vetrino coprioggetto.
Porre l’acqua prima nella camera umida e poi nell’incubatore (per evitare che le
sezioni si secchino).
Porre la camera umida nell’incubatore4.
1½ h a 55 °C
Stringent Wash Solution.
Preriscaldare la soluzione operativa del Stringent Wash Solution, fiala nr. 4, diluita
1:60 a 55 °C a bagnomaria.
Rilevazione
Immergere i vetrini in una soluzione operativa preriscaldata del Tampone per
lavaggio di stringenza.
25 min a 55 °C con
agitatore
Portare i vetrini a temperatura ambiente mediante una breve immersione in TBS.
10 s
Porre i vetrini in una camera umida.
Aggiungere a ogni sezione 2-5 gocce di Anti-FITC/AP, fiala n. 5.
Incubare.
30 min
Rimuovere l’anticorpo.
Immergere i vetrini in TBS.
2 x 3 min
Immergere i vetrini in acqua pura.
2 x 1 min
Porre i vetrini in camera umida.
Aggiungere a ogni sezione 2-3 gocce di Substrato, fiala n. 65.
Incubare.
30-60 min
Rimuovere il Substrato.
Colorazione di contrasto
e montaggio
Immergere i vetrini in acqua di rubinetto.
5 min
Colorare con contrasto con ematossilina, se si desidera
5-10 s
Montare in Faramount, codice n. S 3025 o in Glycergel, codice n. C 0563.
Note procedurali:
1.
Da questo punto e fino alla conclusione dell’ibridazione, è importante evitare la contaminazione delle sezioni con RNasi, i vetrini
dovrebbero essere toccati solo con guanti puliti e monouso (vedere anche “Precauzioni”).
2.
Sciogliere i contenuti di una confezione in alluminio di TBS in 1 l di acqua pura (RNasi-free).
3.
La digestione proteolitica ottimale può variare tra diversi blocchi di tessuto. Per le sezioni congelate e i citospin è necessaria minor
Proteinasi K (in generale 100-1000 volte inferiore), in base alla fissazione.
(128773-001)
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4.
Abbiamo riscontrato che un tempo di incubazione di 1½ ora dà una sensibilità ottimale, comunque si sono ottenuti risultati soddisfacenti
diminuendo tale periodo a 15-30 minuti in base alla quantità del bersaglio presente nel campione.
5.
Abbiamo scoperto che il Substrato (BCIP/NBT/levamisolo), che è incluso nel kit Dako PNA ISH Detection offre la miglior sensibilità, ma
agiscono in modo soddisfacente anche New Fuchsin (codice n. K 0625) e Fast Red con naftolo fosfato (codice n. K 0597)
Le ge nda dei s im boli
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N umero d i catalo go
Limiti di te mp eratur a
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