Nei sistemi modello approcci di modificazione
genetica che producono o sequenze genetiche
alterate o espressione genetica alterata
fenotipo alterato.
Correlazione tra fenotipo alterato, o a livello
cellulare, o di un embrione precoce, o di un
organismo intero, con cambiamenti di un gene
specifico indizi sul funzionamento normale
di un gene.
Nei sistemi modello sono stati usati due tipi di
analisi:
Genetica classica o in avanti (fenotipo gene);
Genetica inversa (gene fenotipo).
Organismo modello: topo.
Cellule umane in coltura (HeLA e HEK293).
Inattivazione genica selettiva (knock-out
genico).
Tecnologia antisenso (know-down).
Si
progettano RNA od oligonucleotidi che
hanno una sequenza complementare a quella
dei trascritti di RNA prodotti da un gene di
interesse. Ibridandosi con i trascritti senso, i
costrutti antisenso bloccano l’espressione
genica (knock-down genico).
La tecnologia antisenso è stata sviluppata
negli anni ’80:
RNA antisenso;
Oligodesossinucleotidi antisenso (più stabili);
Morfolino oligonucleotidi antisenso.
E’ il metodo principale per valutare la funzione
di un gene nelle cellule di mammifero in coltura.
Sfrutta una via metabolica naturale delle cellule
nella quale la formazione di un dsRNA induce
un’inattivazione genica specifica.
RISC: RNA-incuced
silencing complex
Alterare direttamente un gene endogeno
Modificazione del gene
Gene mutato: per
cambiare un aa, o
motivi, o
scambiare domini,
ecc.
A livello del DNA:
know-out genico
cambiamento
della linea
germinale.
Inattivazione
del gene
A livello del RNA:
know-down
genico.
Inattivazione del
gene
A livello proteico: blocco della
proteina legandosi ad altre
molecole x eliminare la funzione
Dominanti
negativi
aptameri
Intracorpi
Inattivazione
del gene
A livello del RNA
knock-down genico
Interferenza
dell’RNA
(iRNA)
Oligonucleotidi
morfolino
antisenso
Inattivazione
del gene
A livello del DNA
knock-out genico
Knock-out casuali del
gene: matagenesi
casuale usando
mutageni chimici
Knock-out genico mirato:
inattivazione di un gene
predeterminato
Aggiungere una copia di
un gene esogeno
Espressione del
transgene
Sovra-espressione:
accoppiandolo ad un
promotore forte
Espressione ectopica: in
cellule non usuali od in
tempi diversi
I modelli animali sono molto preziosi per aiutarci a
capire la funzione di un determinato gene e i
processi che portano ad una malattia, permettendo
dettagliate analisi fisiologiche, o biomolecolari, e
cellulari di una patologia. Sono anche fondamentali
per studiare l’effetto di farmici o nuove terapie
cliniche prima di passare alla sperimentazione
sull’uomo.
Primati non umani, altri mammiferi (topi, ratti), altri
vertebrati (polli, rane, pesce zebrafish), ed
invertebrati (C. elegans, D. melanogaster).
I roditori, in quanto mammiferi, sono abbastanza
simili all’uomo sotto l’aspetto fisiologico, biochimico
e genetico, ed hanno dei grossi vantaggi pratici.
Organismo
transgenico: organismo che porta
materiale genetico trasferito che è stato
inserito in un sito casuale del suo genoma
(acquisizione di funzione).
Gene
targeting: la sostituzione o la
mutazione di un gene fornisce il mezzo per
creare ceppi di organismi “knockout” con
mutazioni praticamente in qualunque gene.
La
clonazione: la produzione di animali
geneticamente identici mediante
trasferimento del nucleo di una cellula
somatica adulta in un uovo non fecondato.
Metodo di
introduzione del
DNA
Cellula
Risultato
ricevente
Uso comune
nell’analisi di
espressione
genica
Tecnologia
Transgenica
Microiniezione nel
pronucleo
Uovo
fecondato
Integrazione
casuale del
transgene
Analisi di
guadagno di
funzione
Gene targeting
Ricombinazione
Embrione
omologa in cellule
allo stato
staminali embrionali di
blastocisti
Interruzione
o mutazione
del gene
bersaglio
Analisi di perdita
di funzione
Clonazione
mediante
trasferimento
nucleare
Trasferimento
dell’intero nucleo
Individuo
geneticament
e identico al
nucleo
donatore
Analisi della
riprogrammazione
del genoma
Uovo non
fecondato
enucleato
I
transgeni possono essere inseriti nella linea
germinale per trasferimento genico diretto
nello zigote, nei gameti o nelle cellule
embrionali o somatiche.
Tre
passaggi principali per creare topi
transgenici:
1. Microiniezione di DNA nel pronucleo di un
uovo fecondato di topo.
2. Impianto dell’embrione microiniettato in
una madre surrogata.
Analisi dei cuccioli della prima e successive
generazioni per stabilire l’integrazione
stabile e l’espressione del transgene.
Espressione
inducibile di
un transgene
Espressione del
transgene
regolata dal
sistema inducibile
della tetraciclina
XX
Sistema
di induzione che agisce a livello
post-trascrizionale, ovvero direttamente sul
controllo dell’attività della proteina di
interesse. Sistema di induzione rapido.
Regolazione post-trascrizionale del recettore
degli estrogeni.
targeting: 1990 Mario Capecchi topi
omozigoti per la perdita del protoncogene
int-1 con gravi anomalie dello sviluppo del
cervello e del cervelletto.
I cambiamenti mirati sono introdotti nella
sequenza della regione codificante o degli
elementi regolatori a monte del gene.
Sistemi di espressione inducibile e
condizionale per il gene bersaglio.
Gene
Dobbiamo conoscere la sequenza completa del
DNA del gene di interesse.
Si suddivide in cinque fasi principali:
1. costruzione del vettore di targeting;
2. gene targeting in cellule staminali embrionali
(ES);
3. selezione delle cellule in cui il gene targeting
ha avuto successo;
4. introduzione delle cellule ES modificate in
embrioni di topo ed impianto di in una madre
surrogata;
5.analisi ed incrocio dei topi chimerici.
Topo
knockout
(neo: neomicina fosfotransferasi; tk: timidina kinasi di herpesvirus)
Topi
knockin: espressione di transgeni o
modificazione del gene di interesse. Questo
approccio è usato spesso per la mutagenesi
sito-specifica in vivo. L’allele knockin
sostituisce la regione codificante dell’allele
endogeno mentre sono mantenuti gli
elementi di regolazione endogeni.
Topi knockdown: inattivazione o
modificazione dei livelli di espressione di un
gene, modificando gli elementi regolatori cisagenti. Si possono creare sostituzioni o
delezioni di singole basi. La regione
codificante del gene è intatta, quella
endogena.
I
geni knockout possono determinare letalità
embrionale necessità di mutazione
condizionale del gene bersaglio.
DNA ricombinasi sito-specifiche famiglia
Int delle ricombinasi uno dei membri più
noti è la ricombinasi Cre del batteriofago P1.
Cre riconosce specificamente un sito di 34 bp
nel genoma del P1, lox, e catalizza la
ricombinazione reciproca tra coppie di siti
lox.
Knockout
genetico
condizionale
La
clonazione si divide in quattro passaggi:
1. preparazione delle cellule donatrici;
2. enucleazione delle uova non fecondate;
3. trasferimento nucleare mediante fusione
cellulare;
4. impianto dell’embrione in una madre
surrogata ed analisi dei cloni.
Il trasferimento nucleare
somatico è inefficiente
Clonazione per ottenere
cellule staminali
Le
terapie basate su cellule staminali
permettono di trasformare il potenziale dei
trapianti.
Cellule staminali embrionali.
Cellule staminali da tessuto adulto.
Terapia cellulare eterologa e autologa.
Riprogrammazione nucleare
pluripotenza indotta in cellule somatiche.
