MINISTERO DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA
Direzione Generale per il Coordinamento e lo Sviluppo della ricerca
Anno 2011 - Protocollo: RBAP10KCNS_004
1.1 Descrizione della struttura e dei compiti dell'Unità di Ricerca
Italiano
La Sezione di Bologna dell’Istituto di Genetica Molecolare del CNR è ospitata attraverso un’apposita convenzione
presso il Laboratorio di Biologia Cellulare Muscoloscheletrica dell’Istituto Ortopedico Rizzoli di Bologna. Sono
attive linee di ricerca sui meccanismi patogenetici delle laminopatie, delle distrofie muscolari e delle malattie
degenerative di interesse ortopedico. La ricerca di base riguarda il ruolo delle proteine del nucleoscheletro,
citoscheletro e matrice extracellulare.
La MADA appartiene al gruppo delle laminopatie, malattie ereditarie dovute a mutazioni nel gene LMNA che
codifica la lamina A/C, o a mutazioni delle proteine che legano la lamina A. La MADA è caratterizzata da alterato
metabolismo del tessuto adiposo, invecchiamento precoce e acro-osteolisi con riassorbimento delle falangi distali
e degenerazione dell’articolazione interfalangea distale, degenerazione clavicolare distale e riassorbimento della
mandibola.
L’anomala processazione della prelamina A causa alterazioni nelle struttura della cromatina, difetti dell’involucro
nucleare e difetti di trascrizione che caratterizzano le cellule MADA. La tossicità della prelamina A è alla base dei
meccanismi patogenetici di questa malattia. Resta da chiarire quali modificazioni post-traduzionali della prelamina
A siano coinvolte nella MADA.
Verranno studiati fibroblasti di pazienti MADA ed i risultati saranno confrontati con quelli ottenuti in cellule affette
da altre laminopatie con accumulo di prelamina A e interessamento dell’apparato scheletrico.
Gli obiettivi della ricerca sono la caratterizzazione biochimica delle modificazioni post-traduzionali della prelamina
A nella Displasia Mandibuloacrale (MADA), delle vie di segnale ad essa correlate e l'identificazione di strategie
terapeutiche per la riduzione della tossicità della prelamina A.
Obiettivi del progetto sono:
1) Identificazione delle modificazioni post-traduzionali della prelamina A in cellule MADA.
2) Correlazione tra i difetti nucleari e le modificazione post-traduzionale della prelamin A
3) Analisi delle principali vie di segnale a valle della prelamina A comprese le vie dipendenti dalla HDAC
4) Valutazione dei possibili effetti terapeutici di farmaci capaci di interferire con la processazione della prelamina
A.
La lamina A e la lamina C sono prodotti dello splicing alternativo del gene LMNA, assieme concorrono alla
formazione della lamina nucleare. Mentre la lamina C viene sintetizzata come proteina matura, la lamina A è
tradotta come precursore proteico soggetto a modificazioni post-traduzionali, tra cui farnesilazione, taglio
endoproteasico (ad opera degli enzimi ZMPSTE24 o RCE1) e metilazione (ad opera dell’enzima
carbossimetiltransferase).
Obiettivo finale dello studio è individuare un approccio farmacologico finalizzato alla terapia, utilizzando sostanze
capaci di interferire con la processazione della prelamina A, come gli inibitori della farnesil transferasi o le statine,
e di migliorare il fenotipo cellulare delle laminopatie. Tali farmaci sono già ampiamente utilizzati per la terapia del
cancro e dell’ipercolesterolemia con effetti collaterali minimi.
Gli esperimenti sono stati pianificati sulla base dei i nostri risultati preliminari. La mutazione omozigote LMNA
R527H è stata identificata quale responsabile della patologia. Le cellule colpite da MADA sono state ampiamente
analizzate dal punto di vista morfologico e hanno dimostrato di avere una lamina nucleare ispessita associata alla
perdita di eterocromatina periferica. Inoltre, i fibroblasti MADA hanno mostrato di accumulare quantità crescenti di
prelamina A, secondo l’età dei pazienti al momento della biopsia e il numero di passaggi in coltura.
Infine, le cellule MADA hanno una ridotta traslocazione nucleare del fattore di trascrizione SREBP1 che si lega alla
prelamina A. Questi risultati suggeriscono un ruolo dell’accumulo della prelamina A nella patogenesi MADA.
Tuttavia, per chiarire il meccanismo patogenetico che porta dalla mutazione del gene della lamina A alla
compromissione del processo di maturazione della prelamina A e agli effetti che ne conseguono
sull’organizzazione della cromatina e la trascrizione, appare necessario caratterizzare la prelamina A e le sue
modificazioni post-traduzionali sul dominio C-terminale.
Alcune indicazioni importanti derivano dalla nostra ricerca più recente. In particolare, le alterazioni della prelamina
A influiscono in vario modo sull’organizzazione dell’eterocromatina.
Ciò è stato dimostrato sia negli studi di transfezione con costrutti del gene LMNA che esprimono una prelamina A
non processabile sia nei fibroblasti che accumulano prelamina A in seguito a trattamento con l'inibitore della
farnesil transferasi FTI-277 o tramite l'inibizione dell'attività di ZMPSTE24 ottenuta attraverso trattamento con il
farmaco non peptidomimetico AFCMe.
FTI-277 causa la formazione di domini eterocromatina all'interno del nucleo, mentre AFCMe causa la perdita di
eterocromatina e modifica sensibilmente la forma nucleare.
Il quadro che emerge è estremamente complesso. Mentre l'organizzazione della cromatina osservata nei
fibroblasti trattati con AFCMe assomiglia a quella riportata in nuclei HGPS, la perdita di eterocromatina e le
invaginazioni dell’involucro nucleare sono osservate meno frequentemente nelle cellule MADA ed RD. Ipotizziamo
che questa discrepanza sia dovuta ad una diversa processazione della prelamina A nella MADA (o RD) rispetto a
HGPS.
Stabilire con precisione quali siano le modificazioni post-traduzionali subite dalla prelamina A in colture cellulari
può essere utili per comprendere la patogenesi MADA. A tal fine saranno utilizzati due diversi anticorpi antiprelamina A in grado di riconoscere selettivamente diverse forme di maturazione intermedie della prelamina A.
L’anticorpo 1 sarà usato per marcare il dominio C-terminale della prelamina A non processata, e per distinguere le
forme di prelamina A che portano la sequenza completa CaaX da quelle che hanno subito il primo passo
(endoproteolisi) della trasformazione in prelamina A. L’anticorpo 2, diretto contro la sequenza C terminale clivata,
è stato testato in cellule sottoposte a trattamento con inibitori della processazione. L'anticorpo si lega
specificamente alla prelamina A, ma non alla lamina A matura in colture di fibroblasti e produce una marcatura
dell’involucro nucleare.
Infine, un altro aspetto interessante è emerso dai nostri recenti risultati e verrà ulteriormente approfondito nel
progetto. I livelli proteici di prelamina A e anche le quantità di lamina A matura e di lamina C sembrano cambiare
in cellule laminopatiche e nelle cellule indotte ad accumulare prelamina A mediante trattamento con gli inibitori
della maturazione. Il possibile effetto dell’accumulo di prelamina A sul tasso di espressione del gene LMNA stesso
e dei geni delle proteine correlate si rivelerà estremamente interessante per svelare i meccanismi patogeni e
valutare approcci terapeutici utilizzando i farmaci che interferiscono sulla processazione della prelamina A.
Piano sperimentale
1) L’individuazione delle modificazioni post-traduzionali della prelamina A nelle cellule MADA verrà effettuata
mediante analisi in Western Blot e coimmunoprecipitazione delle proteine leganti prelamina A.
2) La correlazione dei difetti nucleari con le modificazioni post-traduzionali della prelamina A sarà determinata
analizzando la distribuzione del marcatore eterocromatinico tri-H3K9 e l'organizzazione ultrastrutturale
dell’eterocromatina.
3) La valutazione delle alterazioni nella processazione della prelamina A nella MADA e delle vie di segnale
connesse, verrà effettuata mediante analisi in Western Blot e coimmunoprecipitazione.
4) I trattamenti con statine e FTIs nelle cellule MADA saranno ottimizzati tramite monitoraggio biochimico ed
immunocitologico della processazione della prelamina A e della distribuzione di marcatori per l’eterocromatina.
Inglese
The Unit of Bologna of the Institute for Molecular Genetics- CNR, is hosted within the Laboratory of
Musculoskeletal Cell Biology in the Rizzoli Orthopedic Institute - Bologna. Its current scientific research is devoted
to pathogenic mechanisms of laminopathies, muscular dystrophies, and orthopaedic degenerative diseases. Basic
research fields are: investigations on functional roles of nucleoskeletal, cytoskeletal and extracellular matrix
structures.
MADA belongs to the group of laminopathies, inherited disorders due to mutations in the LMNA gene encoding
lamin A/C, or to mutations in lamin A−binding proteins. MADA is characterized by altered adipose tissue
metabolism, various degrees of premature aging and acro-osteolysis with distal phalages resorption, distal
interphalangeal joints degeneration, clavicle and mandible resorption .
Impaired prelamin A processing, chromatin and nuclear envelope defects and transcriptional defects characterize
the cellular phenotype of MADA. Overall, there is increasing evidence that prelamin A toxicity is the basis of the
pathogenic mechanisms. However, clear definition of prelamin A post−translational modifications in MADA is
lacking.
Fibroblasts from MADA patients will be included in the research and the results compared with those obtained in
other laminopathic cells accumulating prelamin A and affecting the skeletal apparatus (Restrictive dermopathy,
Hutchinson−Gilford progeria syndrome).
The objectives of the proposed research are the biochemical characterization of the
post−translationalmodifications of the mutated protein (prelamin A) found in Mandibuloacral Dysplasia (MADA), of
the prelamin A dependent signaling pathways and the identification of therapeutic strategies aimed at the
reduction of prelamin A toxicity.
Specific aims of the project are:
1) Identification of the post−translational modification harbored by prelamin A in MADA cells.
2) Direct correlation of nuclear defects to the post−translational modification harbored by prelamin A.
3) Analysis of the principal signaling pathways downstream prelamin A including HDAC-dependent signaling
4)Evaluation of possible therapeutic effects of drugs known to interfere with prelamin A processing.
Lamin A is encoded by the LMNA gene and forms polymers at the nuclear lamina with lamin C, another splicing
product of the same gene. While lamin C is produced as mature protein, lamin A is translated as a precursor
protein which undergoes four steps of post− translational modifications, including farnesylation, double
endoprotease cleavage and methylation. Following farnesylation, the C-terminal aaX tripeptide is cleaved by
ZMPSTE24 or RCE1 and the C−terminal cysteine carboxymethylated by the carboxymethyltransferase ICMT. The
second ZMPSTE 24−mediated cleavage of 15 amino acids at the C−terminus of prelamin A leads to removal of
the farnesyl residue and yields mature lamin A.
Final aim of the study is to determine the better approach to pharmaceutical intervention, taking advantage of
drugs capable of targeting specific prelamin A modifications such as farnesyl transferase inhibitors or statins,
already shown to improve the cellular phenotype in laminopathies. These drugs are widely used for cancer or
hypercholesterolemia therapy with minimal side effects.
The experiments are planned on our preliminary results detailed below.
The homozygous R527H LMNA mutation has been identified in the available MADA cell cultures. MADA cells
have been extensively analysed from the morphological point of view and have been shown to have altered
nuclear lamina thickness and peripheral heterochromatin loss. Moreover, MADA fibroblasts have been shown to
accumulate increasing amounts of prelamin A depending on the age of patients at biopsy and on the number of
passages in culture.
Finally, MADA cells have been shown to have reduced rate of nuclear import of the transcription factor SREBP1
which binds prelamin A. All these results suggest a major role of prelamin A accumulation in MADA pathogenesis.
However, to address the problem of the pathogenic mechanism leading from the lamin A mutation to impaired
prelamin A processing and downstream chromatin and transcriptional effects, it appears necessary to characterize
prelamin A in order to determine its C−terminus post−translational modification.
Some important hints have derived from our recent research. The first one is that prelamin A modifications
differently affect heterochromatin.
This has been shown both in transfection studies using LMNA constructs expressing unprocessable prelamin A
and in fibroblasts accumulating prelamin A by treatment with the farnesyl transferase inhibitor FTI−277 or by
inhibition of the ZMPSTE24 activity by treatment with the non-peptidomimetic drug AFCMe.
FTI−277 caused formation of heterochromatin domains in the nuclear interior, while AFCMe causes loss of
heterochromatin and significantly alters the nuclear shape.
The emerging picture is extremely complex. While chromatin organization observed in AFCMe−treated fibroblasts
clearly resembles that reported in HGPS nuclei, heterochromatin loss and nuclear envelope invaginations are less
frequently observed in RD and MADA cells. We hypothesize that this discrepancy can be due to different
processing of prelamin A in MADA or RD with respect to HGPS.
Establishing the exact post−translational modifications harbored by prelamin A in cell cultures may be useful to
understand the MADA pathogenesis. To this end, two different prelamin A antibodies able to selectively detect
different prelamin A processing intermediates will be used.
Antibody 1 will be used to detect the full length C−terminus of prelamin A and to distinguish prelamin A forms
which harbor the full CaaX sequence from those that underwent the first cleavage step of prelamin A processing.
Antibody 2, directed against the cleaved C-terminal , has been obtained and it has been validated in cells
subjected to inhibitor treatment. The antibody specifically binds prelamin A but not mature lamin A in cultured
fibroblasts and shows a nuclear rim staining.
Finally, another interesting aspect has emerged by our recent results and it will be further investigated in the
project. Protein levels of prelamin A and even lamin A and lamin C amount appear to change in laminopathic cells
and in cells induced to accumulate prelamin A by treatment with processing inhibitors.
The possible effect of prelamin A accumulation on the expression rate of the LMNA gene itself and of related
protein genes will prove extremely interesting to unravel pathogenic mechanisms and to evaluate therapeutic
approaches using prelamin A processing inhibitors.
Experimental plan
1) Identification of the post−translational modifications harbored by prelamin A in MADA cells will be performed by
Western blot analysis and coimmunoprecipitation.
2) Correlation of nuclear defects to the post−translational modification harbored by prelamin A will be assessed
evaluating the distribution pattern of the heterochromatin marker tri−H3K9, and the ultrastructural organization of
peripheral heterochromatin.
3) Evaluation of changes in prelamin A processing and of realted signaling pathways in MADA will be performed
by Western blot analysis and coimmunoprecipitation studies.
4) Optimization of statins and FTIs treatments in MADA cells will be carried out by biochemical and
immunofluorescence evaluation of prelamin A processing and heterochromatin markers distribution partners.
