4 lezione

DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI
Cuvetta contenente il
campione di proteina
a concentrazione C
l
I1
I0
Rivelatore
Sorgente
I0
Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’onda λ attraverso un
percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della
luce è assorbita dalla soluzione.
Se l’energia della luce incidente è I0 e l’energia della luce trasmessa (dopo essere
passata attraverso la soluzione) è I1, allora la frazione di luce trasmessa è I1/I0,
nota come trasmittanza T.
Se T = 100%, la sostanza è trasparente.
Se T = 0%, la sostanza è opaca ed assorbe completamente la luce.
L’assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione del
materiale assorbente quando il percorso della luce è mantenuto costante.
A = log10(I0/I1) = εcl
coefficiente di
estinzione
L’assorbanza è adimensionale.
Quando la concentrazione è espressa in molarità (M) ed il percorso della luce in centimetri
(cm), ε è noto come coefficiente di estinzione molare (M-1cm-1) di un dato composto.
ε0.1%280nm è l’assorbanza a 280 nm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in
esame (ad es. una proteina) in una cuvetta lunga 1 cm.
La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l’assorbanza
delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nm (UV)
Il metodo è adoperato comunemente perché non distrugge il campione ed è
molto rapido
La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm per
la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e
fenilalanina (F)
Poiché la composizione in amminoacidi
l’assorbimento molare varierà anch’esso
di questi amminoacidi
delle proteine varia
di molto, a seconda
notevolmente,
del contenuto
Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280
nm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di
assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm.
Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto
l’assorbimento molare.
O
O
H2N
CH
C
CH2
OH
H2N
CH
C
CH2
O
OH
H2N
CH
C
CH2
HN
OH
Trp (Triptofano)
Tyr (Tirosina)
Phe (Fenilalanina)
OH
Determinazione della concentrazione proteica
mediante spettrofotometria
Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina
Assorbimento
Picco di assorbimento di
Tirosine,
Triptofani e
Fenilalanine
220
240
260
280
300
320
340
360
Lunghezza d’onda “λ” (nm)
UV = 200 nm – 350 nm
380
400
Necessità di utilizzare cuvette di quarzo
A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a
280 nm, i risultati saranno poco accurati
Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perché gli anelli purinici e
pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 nm, con un
assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nm
Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione
della proteina può essere stimata adoperando una formula che
corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici:
[proteina] (mg/ml) = 1,55 A280 – 0,76 A260
Non è distruttivo
Consente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una colonna
cromatografica
Il limite di sensibilità può essere aumentato in maniera significativa
misurando i massimi di assorbimento a lunghezza d’onda comprese tra
190 e 220 nm
Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame
alcalino contenente potassio tartrato di sodio
In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso
di coordinazione con quattro gruppi –NH presenti in altrettanti
legami peptidici
Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a
550 nm
R
N
N
O
2+
CU+2
Cu
O
N
N
R
Essendo basato sull’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo
è universabile e molto riproducibile
Scarsa sensibilità: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione
di concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml
Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici
ottenuti per precipitazione con ammonio solfato perché questi campioni
contengono alte concentrazioni di ammonio
Consiste nella reazione del biureto, seguita dalla riduzione in condizioni alcaline
del reagente di Folin-Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstato)
Gli ioni di rame facilitano il processo di riduzione
I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati con rame
(biureto) ed i molibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da
tirosina, triptofano ed amminoacidi polari
Il prodotto della reazione, eteropolimolibdeno, ha una forte colorazione blu,
con un massimo di assorbimento a circa 750 nm
Poco costoso
Di facile esecuzione
Altamente riproducibile
Molto sensibile: è possibile determinare concentrazioni fino a 10 µg/ml
E’ soggetto ad interferenze da parte di una varietà di sostanze, quali Tris,
HEPES ed EDTA
Le curve standard sono lineari solo a basse concentrazioni proteiche
Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibili
La reazione dipende dal pH ed è necessario avere un pH compreso tra 10
e 10.5
Recentemente sono stati introdotti un certo numero
di reagenti alternativi per la determinazione
degli ioni rameici, i quali consentono di effettuare
un saggio più conveniente e riproducibile …
La reazione del BCA (acido bicinconinico) è simile a quella del reattivo
di Lowry
Cu+2 è ridotto a Cu+1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalina
Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu+1)
Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con
un massimo di assorbimento a 562 nm
Proteina + Cu +2
-
Cu +1 +
OOC
OH -
Cu +1
N
N
COO -
N
COO -
Cu +1
2BCA
-
OOC
N
Sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 µg/ml)
Ridotta suscettibilità alla presenza di detergenti
Dopo un’incubazione di 30 minuti a 37°C il colore è sufficientemente stabile
per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti)
Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo
Interferenza da parte di carboidrati
Ecco un elenco di una parte delle sostanze che interferiscono con
il metodo BCA: catecolamine, triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina,
tirosina, saccarosio, glicerolo non puro, H2O2, acido urico e ferro.
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante
da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)
Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine
tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e
tramite forze di van der Waals
Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico
Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio
in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a
595 nm
OCH2CH3
Coomassie Brilliant Blu R
N
HN
SO3Na
N+
SO3Na
La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina
presente in soluzione.
Pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale
alla concentrazione proteica.
In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di
colorante → il saggio è indipendente dal tipo di proteina
Poiché l’intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di
concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una
curva standard per ogni saggio.
1 mg/ml
2 mg/ml
4 mg/ml
X mg/ml
8 mg/ml
16 mg/ml
1 2
4
8
µg di proteina
16
Intensità del colore blu
Assorbanza a 595 nm
Semplicità di preparazione del reattivo
Sviluppo del colore immediato
Stabilità del complesso
Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)
Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,
degli agenti denaturanti come guanidina· HCl 6M e urea 8 M e dei
preservanti come sodio azide
Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere
La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal
contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di
uno standard
Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida
Kjeldahl Method --- Nitrogen Determination
(1) Digestion
+ conc. H2SO4
+ a catalyst
nitrogen converted into an ammonium ion.
(2) Neutralize to get NH3 with NaOH
(3) Steam distillation of NH3 and trap in boric acid.
(4) Titrate with hydrochloric acid.
Calculation:
Gram nitrogen/ gram of sample =
*(ml of sample - ml of blank) × N standard acid × 0.014g/meq
weight of sample
* ml of hydrochloric acid required to titrate sample solution.
Disadvantages: not all N is protein.
Purine
Pyrimidine DNA, RNA, etc.
Urea
Many plant tissues have > 50% non-protein N.
% N × 6.25 = % Protein