AIPVet
Associazione Italiana di Patologia Veterinaria
ATTI III Congresso Nazionale
ISSN 1825-2265
con la partecipazione
della Società Italiana di Patologia Tossicologica e Sperimentale
del Gruppo di Patologia Clinica Veterinaria
Pisa, 11-13 Maggio 2006
Associazione Italiana di Patologia Veterinaria – Italian Association of Veterinary Pathologists
www.aipvet.it
ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEL PATTERN ANTIGENICO SU ASPIRATI
LINFONODALI IN CORSO DI LINFOMA CANINO
Gelain Maria Elena, Mazzilli Maria, Comazzi Stefano
Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanità Pubblica Veterinaria, Sezione di Patologia
Generale e Parassitologia Università degli Studi di Milano
I linfomi, neoplasie molto comuni nel cane, costituiscono un insieme eterogeneo di entità patologiche la cui
corretta diagnosi e classificazione è una componente essenziale per la gestione clinica. In medicina umana, la
determinazione dell’immunofenotipo rappresenta uno step essenziale, data la correlazione con il comportamento
biologico e la risposta alla terapia. Anche in medicina veterinaria studi clinici hanno evidenziato come i linfomi
T siano caratterizzati da una prognosi più sfavorevole e una minor risposta alla terapia. L’uso della
citofluorimetria per l’immunofenotipizzazione di campioni linfonodali permette di analizzare materiale ottenuto
attraverso procedure semplici e non invasive come l’aspirazione con ago sottile (fine needle aspiration, FNA) e,
con marcature multiple, possono essere valutate e quantificate le espressioni di più antigeni
contemporaneamente. Scopo di questo lavoro è quello di analizzare il pattern antigenico caratteristico di diversi
tipi di linfoma canino, identificati secondo schemi classificativi morfologici ed immunofenotipici, valutando la
positività ai marker cellulari specifici e definendo le possibili espressioni antigeniche aberranti. In 28 campioni
di FNA di linfonodi di cani con linfoadenomegalia è stata valutata l’espressione degli antigeni panleucocitari
(CD18, CD45), dei principali marker linfoidi (CD3, CD4, CD8, CD21, Cd79a, IgM, IgG), granulocitari e
monocitari (CD11b, CD14) e l’espressione di CD34. L’esame citomorfologico dei campioni è stata eseguito
secondo la classificazione Kiel update.
Sono stati identificati 16 linfomi B (CD21+ CD79a+), 7 linfomi T positivi ad almeno un marker T (CD3, CD4,
CD8) e 2 forme reattive, caratterizzate da popolazioni linfoidi eterogenee e cellule di origine granulocitaria e
monocitaria. In tre casi, la presenza di cellule di dimensioni medie, positive a CD34, accanto ad una popolazione
residua eterogenea ha permesso di identificare forme di leucemia linfoide acuta (ALL) con interessamento
linfonodale. In alcuni casi, si sono notate anomalie fenotipiche come l’espressione contemporanea di marker di
cellule B mature (CD21) e antigeni tipici dei blasti (CD34), la negatività a marker panleucocitari (CD45) o la
doppia positività a CD4 e CD8 in cellule CD3-. L’analisi citofluorimetrica su FNA si è dimostrata utile per
identificare e quantificare in modo corretto le sottopopolazioni linfoidi e determinarne il quadro antigenico con
un panello anticorpale capace di identificare l’origine delle cellule neoplastiche, valutarne il grado di
maturazione e evidenziare la contemporanea presenza di antigeni tipici di linee cellulari diverse o quadri
antigenici aberranti.
Parole chiave: linfoma, citofluorimetria, immunofenotipizzazione,
INTRODUZIONE
I linfomi canini sono neoplasie comuni e molto
eterogenee con presentazioni cliniche e
morfologia variabili(3,10,12). Per questo motivo,
una diagnosi il più corretta e precisa possibile è
essenziale sia per la prognosi sia per un
adeguato approccio terapeutico. In medicina
umana
è
oramai
dimostrato
come
l’associazione tra studio citomorfologico e
immunofenotipizzazione
delle
cellule
neoplastiche, con analisi citofluorimetrica, su
materiale ottenuto tramite prelievo con ago
aspirato (fine needle aspiration, FNA), può
fornire la base per una diagnosi e
classificazione accurata dei linfomi evitando
tecniche bioptiche invasive(1,8). Inoltre, con
marcature multiple, possono essere valutate e
quantificate le espressioni di più antigeni
contemporaneamente. In alcuni casi questo
permette, non solo di identificare l’origine T o
B delle cellule neoplastiche e valutarne il
grado di maturazione, ma anche di evidenziare
la contemporanea presenza di antigeni tipici di
linee cellulari diverse o quadri antigenici
aberranti(15), considerati indicatori certi di
neoplasia e, in medicina umana, fattori
prognostici aggiuntivi(6,11). Scopo di questo
lavoro è stato quello di evidenziare il pattern
citofluorimetrico caratteristico dei diversi tipi
di linfoma canino, classificati in base ai criteri
citomorfologici della classificazione Kiel
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updated,
valutare
eventuali
variazioni
d’espressione antigenica e identificare possibili
espressioni aberranti.
MATERIALI E METODI
Sono stati analizzati 28 campioni di aspirato
linfonodale di cani con sospetto diagnostico di
linfoma, ottenuto mediante FNA. Sono stati
utilizzati, per l'analisi citofluorimetrica, i
campioni che presantavano una concentrazione
cellulare, determinata con contaglobuli
automatica SEAC H8, di almeno 5000
cellule/µl. Su i campioni è stata valutata
l’espressione degli antigeni panleucocitari
(CD18, CD45), dei principali marker linfoidi
(CD3, CD4, CD8, CD21, CD79a, IgM, IgG),
granulocitari e monocitari (CD11b, CD14) e
l’espressione di CD34. I campioni sono stati
acquisiti con citofluorimetro a flusso
(FACSort, Becton Dickinson) ed analizzati con
software specifico Cell Quest. Si è definita
come espressione aumentata o diminuita
un’espressione antigenica maggiore o minore
rispetto ad un controllo interno, rappresentato
dalla popolazione normale residua presente nel
linfonodo. L'analisi morfologica degli aspirati
linfonodali, eseguita sui vetrini colorati con
May Grünwald-Giemsa, è stata eseguita con
una doppia analisi cieca, in seguito confrontata
e uniformata, secondo la classificazione Kiel
updated.
RISULTATI
Sono stati identificati 16 linfomi B (CD21+
CD79a+), 7 linfomi T, positivi ad almeno un
marker T (CD3, CD4, CD8), 3 forme di
leucemia linfoide acuta (2 B-ALL, 1 T-ALL)
con interessamento linfonodale e 2 forme
reattive, caratterizzate da popolazioni linfoidi
eterogenee e cellule di origine granulocitaria e
monocitaria. Tra i linfomi B, 15 sono stati
classificati come high grade (8 centroblastici
polimorfi, 5 centroblastici monomorfi e 1
linfoma linfoblastico) e solo uno come low
grade (macronucleolated medium sized cell,
MMC).
Un
caso
invece
presentava
caratteristiche morfologiche non previste dalla
classificazione Kiel update. La popolazione
neoplastica era, infatti, costituita da cellule
pleomorfe, di grandi dimensioni, con
citoplasma chiaro e di quantità moderata,
nucleo indentato o convoluto, cromatina
dispersa e nucleoli scarsamente visibili. E’
stato quindi definito come linfoma pleomorfo a
grandi cellule B non classificabile.
Tre linfomi T sono stati considerati high grade
(linfomi pleomorfi a grandi cellule), 3 casi low
grade (small clear cells, 2 casi CD4+, 1 caso
CD8+) e 1 linfoma LGL CD3+CD8+.
Il fenotipo predominante, sia nei linfomi
centroblastici polimorfi sia monomorfi, è
risultato essere CD45+, CD18+, CD79a+,
CD21+. Caratteristica frequente è stata una
sottoepressione di CD79a (Fig.1,2), se
comparata con il residuo di linfociti B presenti
nella popolazione non neoplastica. Espressioni
anomale si sono invece riscontrata nel linfoma
linfoblastico, risultato CD34+ (fig.3) e nel
linfoma pleomorfo non classificabile, le cui
cellule neoplastiche sono risultate CD45- e
CD34+.
I linfomi T pleomorfi a grandi cellule, in due
casi hanno evidenziato, accanto ad un fenotipo
CD3+, CD4+, una parziale positività a CD79a,
marker della linea B. Nel terzo caso invece, la
popolazione neoplastica, oltre ad essere CD45e CD3-, presentava una contemporanea
positività a CD4 e CD8 (fig.4). Nei casi
diagnosticati come ALL con coinvolgimento
linfonodale, si sono potute identificare le
cellule neoplastiche CD34+, accanto ad
popolazione residua più ampia ed eterogenea,
se confronta con il residuo di norma presente
in un linfonodo colpito da linfoma.
DISCUSSIONE
L’uso di tecniche capaci di identificare,
quantificare e tipizzare le cellule neoplastiche
acquista sempre più importanza per lo studio
del linfoma, data l’elevata incidenza di questo
tipo di neoplasie nel cane. Nel nostro lavoro,
così come precedentemente segnalato(3,10,12,15), i
linfomi B sono risultati le forme più frequenti.
Tra questi, il gruppo patologico più comune è
stato il linfoma centroblastico pleomorfo, nel
quale, l’analisi semiquantitativa dei livelli
d’espressione antigenica, ha evidenziato una
tendenza alla sottoespressione di CD79a. E’
stato inoltre possibile individuare quadri
antigenici aberranti come la positività a CD34
in un linfoma linfoblastico e in un linfoma
pleomorfo di origine B. L’espressione di CD34
è caratteristica delle leucemie acute, sia
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linfoidi sia mieloidi, ed è utilizzata per
distinguerle dalle forme croniche o dai linfomi
leucemici(13), ma già altri autori hanno
segnalato la possibilità di una sua espressione
anomale in corso di linfoma(14). Anche nei
linfomi T high grade si sono notate espressioni
antigeniche particolari come la coespressione
di marker appartenenti a linee cellulari diverse
(CD3 e CD79a) o una doppia positività
CD4+CD8+ in cellule con evidenti segni
d’immaturità, quali la negatività a CD45 e
CD3. La presenza di doppie positività anomale
è di norma associata ad un’atipica
proliferazione dei linfociti T(5) e a tempi di
sopravvivenza ridotti(7,9).
2.
3.
4.
5.
6.
CONCLUSIONI
In
medica
umana,
l’uso
combinato
dell’aspirazione con ago sottile, come tecnica
di
prelievo
citologico,
e
l’analisi
citofluorimetrica
ha
significativamente
influenzato diagnosi, prognosi e terapia delle
neoplasie
linfoproliferativa(1,5,8,11,16).
In
medicina veterinaria, al contrario, sono ancora
pochi i lavori in cui si utilizzano queste
tecniche per la diagnosi e classificazione dei
linfomi(2,4,12,14,15). Lo studio da noi condotto ha
evidenziato come l’analisi citoflurimetrica e
citomorfologica consenta di diagnosticare il
linfoma in tempi brevi, renda possibile una
corretta classificazione delle varie entità
patologiche e permetta di delineare in modo
preciso il quadro antigenico della popolazione
neoplastica. La possibilità di usare un ampio
pannello anticorpale e di paragonare i livelli di
espressione tra popolazione neoplastica e
normale, consente inoltre di identificare in
modo
agevole
alterazioni
antigeniche
qualitative e quantitative, spesso considerate
fattori prognostici importanti. La definizione
precisa del quadro antigenico delle cellule
neoplastiche è inoltre di fondamentale utilità
per una stadiazione accurata della patologia,
nonché per l’identificazione della malattia
minima residua dopo terapia.
7.
8.
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Figura 1. Linfoma centroblastico pleomorfo. Analisi
citofluorimetrica. A: forward scatter (FSC)/ side
scatter (SSC), B:FSC/CD21 (FL2), C: FSC/CD45
(FL1), D: FSC/CD79a (FL2).
Figura 2. Linfoma centroblastico monomorfo. A:
forward scatter (FSC)/ side scatter (SSC), B:
FSC/CD79a (FL2).
Figura 3. Linfoma linfoblastico. A: forward scatter
(FSC)/ side scatter (SSC), B:FSC/CD45 (FL2), C:
FSC/CD21 (FL1), D: FSC/34 (FL2).
Figura 4. Linfoma T-cell pleomorfo a grandi cellule. A:
forward scatter (FSC)/ side scatter (SSC), B:FSC/CD45
(FL2), C: CD4(FL1)/CD8 (FL2).
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FLOW CYTOMETRIC EVALUATION OF ANTIGENIC PATTERN IN CANINE
LYMPHOMA
The use of fine needle aspiration (FNA) could be useful to evaluate cytomorphologic features and the
immunophenotype in canine lymphoma. Twenty-eight FNA of canine lymph node with lymphoadenomegalia
were analyzed by flow cytometry (FC) to assess the immunophenotype. The morphological criteria for cytology
examination were based on the update Kiel classification. 16 B-cell lymphoma, 7 T-cell lymphoma were
identified. Two samples were classified as reactive and the presence of CD34+ medium cells in 3 samples were
consistent with acute lymphoid leukaemia with lymph node involvement. The use of FC to analyse CD antigen
expression on FNA samples could be useful to distinguish lymphoid malignancies to reactive processes and to
identify aberrant expression.
Keywords: lymphoma, flow cytometry, immunophenotype
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