8 regolazione - Progetto e

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Una caratteristica fondamentale degli organismi
viventi è l’alto grado di CONTROLLO esercitato
in quasi tutti i loro processi.
Ogni organismo è in grado di rispondere a
modificazioni ambientali, di mantenere
comunicazioni intra- ed extracellulari e di
seguire un ordinato programma di crescita e
sviluppo mediante una grande varietà di
meccanismi di regolazione.
La regolazione viene esercitata ad ogni livello
nei sistemi biologici: dal controllo
dell ’ espressione genica al controllo delle
velocità di reazione degli enzimi.
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Coordinazione di numerosi processi metabolici
CONTROLLO
AL LIVELLO
DEL
SUBSTRATO
CONTROLLO
DELLA
DISPONIBILITA’
quantità
DELL’ENZIMA
Sintesi e
Degradazione
CONTROLLO
NEI VARI
DISTRETTI
CELLULARI
CONTROLLO
DELL’ATTIVITA’
ENZIMATICA
CONTROLLO
IMMEDIATO
Alterazioni
strutturali
che
coinvolgono
il sito attivo
ISOZIMI
O
ISOENZIMI
Variazioni nella
concentrazione
del substrato
MODULATORI
EFFETTORI ALLOSTERICI
L’analogia tra la cellula vivente e una
fabbrica è particolarmente appropriata se
si considera il ruolo degli enzimi. La
cellula ha infatti a disposizione certe
materie prime (substrati) e deve ottenere
specifici prodotti a partire da queste.
I macchinari nella cellula deputati a
questa funzione sono gli enzimi che si
trovano spesso disposti in “catene di
montaggio” in modo da eseguire in
sequenza le fasi necessarie di una
determinata via metabolica.
Tuttavia un complesso industriale efficiente non può essere tale se
ogni sua macchina viene fatta funzionare alla massima velocità.
Prodotti intermedi si accumulerebbero in alcune linee della catena
di montaggio e alcune parti del prodotto finito sarebbero prodotte in
largo eccesso. Risulta chiaro quindi il ruolo fondamentale della
coordinazione e regolazione delle attività enzimatiche.
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Più alta è la concentrazione di substrato e più
rapidamente avviene al reazione enzimatica (fino alla
saturazione dell’enzima), al contrario, alte concentrazioni
di prodotto tendono a inibire la trasformazione del
substrato, in questo caso
il prodotto può agire da
inibitore competitivo.
Glucosio + ATP
glucosio-6-P + ADP
Tuttavia il controllo a livello del substrato non è
sufficiente per la regolazione di molte vie metaboliche,
in altre situazioni è indispensabile che l’enzima sia
regolato da alcune sostanze completamente diverse dal
substrato o dal proprio prodotto.
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In ogni sistema enzimatico, in cui vi sia una sequenza di
reazioni catalizzate da diversi enzimi (il prodotto del primo
enzima diventa il substrato del secondo), vi è almeno un
enzima che influenza in modo determinante la velocità
complessiva in quanto
CATALIZZA LA REAZIONE PIU’ LENTA.
Enzima 1
A
Enzima 2
B
Enzima 3
C
Enzima 4
D
E
Inoltre, in generale, il primo enzima della sequenza
metabolica è un enzima regolatore, in questo modo si evita
di sottrarre metaboliti e energia ad altre sequenze di
reazioni importanti.
La cellula può controllare la formazione del prodotto
finale tramite attivazione o inibizione di un passaggio
della via metabolica. Il sistema più efficiente è quello
di agire sul primo passaggio.
Enzima 1
A
Enzima 2
B
Enzima 3
C
Enzima 4
D
E
La trasformazioni di A in B viene quindi controllata da
E: questo processo è chiamato feedback o, più
precisamente feedback negativo in quanto un
aumento della concentrazione di E ha come
conseguenza una diminuzione della sua velocità di
formazione.
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A
Enzima
1
O
Enzima
2
B
C
Enzima
3
O
A
B
C
Enzima
4
D
E
Feedback negativo
D
E
F
G
K
L
M
N
OO
OO
O
Feedback positivo
INIBIZIONE E ATTIVAZIONE DUE FENOMENI ESSENZIALI
PER LA REGOLAZIONE DEL METABOLISMO
Il termine allosterico deriva dal greco (allos=altro;
stereo= spazio, forma) e significa che gli enzimi così
definiti possono assumere altre conformazioni indotte
dal legame di opportuni modulatori.
Gli enzimi allosterici sono proteine oligomeriche
costituite da diverse subunità e con parecchi siti attivi. Le
interazioni allosteriche ( cooperative ) avvengono
quando il legame di un ligando ad un sito specifico viene
influenzato dal legame di un altro ligando, detto effettore
o modulatore, a livello di siti diversi nella proteina.
Se i ligandi sono identici l’effetto viene definito
omotropico, mentre se i ligandi sono diversi, viene
detto eterotropico. Questi effetti possono essere sia
positivi che negativi a seconda che il ligando aumenti o
diminuisca l’affinità del legame alla proteina.
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Gli enzimi non allosterici hanno un andamento iperbolico
delle curve di V in funzione di [S].
Gli enzimi allosterici che legano il substrato in modo
cooperativo danno curve di tipo sigmoide. A basse
concentrazioni di [S] l’enzima si comporta come se avesse
una debole capacità di legame (KM elevata), all’aumentare
di [S] viene indotto un aumento di quantità di substrato
legato e quindi l’efficienza catalitica dell’enzima.
Effetto
Omoallosterico
Estremo
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Come l’emoglobina, l’enzima
allosterico presenta una curva
sigmoidale. Ma se per l’emoglobina
la curva spiega sia l’efficienza di
legame che di rilascio
dell’ossigeno, per l’enzima
allosterico, rende più efficace il
controllo al livello del substrato
Nelle curve che descrivono l’andamento delle
velocità iniziali di reazione (V0) in funzione di [S]
di un enzima allosterico, il valore di
concentrazione di substrato a cui si ha una
velocità pari a metà della Vmax viene definito
[S]0.5 o K0.5.
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Gli Enzimi allosterici possono presentare diversi tipi di
regolazione.
Gli effettori eterotropici
possono agire in due
modi diversi:
Effettori eteroallosterici
positivi: determinano un
aumento della
cooperatività di legame
del substrato.
Effettori eteroallosterici
negativi: determinano
una diminuzione della
cooperatività di legame
del substrato.
Sono stati sviluppati diversi modelli allo scopo di
descrivere i meccanismi molecolari mediante i quali
viene modulata l’attività delle proteine allosteriche.
Il modello più noto per descrivere il legame
cooperativo di un ligande ad una proteina è il
modello simmetrico dell’allosterismo, sviluppato
nel 1965 da J. Monod, J. Whyman e J.P.
Changeaux (detto MWC).
In questo modello l’enzima deve esistere solo in
due conformazioni, una ad alta affinità e una a
bassa affinità. In assenza di substrato
praticamente tutte le molecole sono nella forma
a bassa affinità.
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una proteina allosterica è un
oligomero costituito da protomeri
(subunità) simmetricamente
correlati;
ogni protomero può esistere in due
stati conformazionali, chiamati T
(tensed) e R (relaxed) in
EQUILIBRIO TRA LORO;
- Il legame del ligando sposta
l’equilibrio in favore di R.
-il cambiamento conformazionale è
concertato perché è esclusa la
formazione di specie intermedie
con parte delle subunità a bassa e
alta affinità.
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Nel modello simmetrico dell’allosterismo gli effettori
omotropici (substrato) ed eterotropici (attivatori)
positivi si legano preferenzialmente alla forma R
stabilizzandola, mentre gli effettori eterotropici
negativi (inibitori) si legano allo stato T rendendolo
più stabile.
T
R
Il modello simmetrico fornisce una ragionevole
razionalizzazione delle proprietà di legame del ligando in
parecchie proteine ed enzimi. Vi sono però diverse valide
obiezioni a questo modello:
1)  E’ difficile credere che la simmetria oligomerica sia
invariabilmente conservata in tutte le proteine a
seguito del legame del ligando;
2) Il modello può descrivere solo effetti omotropici
positivi, ma non quelli negativi.
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Koshland, Nemethy e Filmer nel 1966 proposero un modello
confermato in molti enzimi mediante analisi ai raggi X.
Essi adottarono l’ipotesi dell’adattamento indotto per
spiegare gli effetti allosterici. Nel modello sequenziale il
legame del substrato induce una modificazione
conformazionale in un protomero (subunità); le interazioni
cooperative derivano dagli effetti che queste variazioni
conformazionali hanno sulle subunità vicine. L’affinità
dell’enzima per il legame del substrato varia con il numero di
molecole di substrato legate, passando attraverso una serie
di forme intermedie ad affinità diversa.
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Il modello simmetrico (MWC) IMPLICITAMENTE assume il
modello si Fischer a “chiave serratura” per il legame dei
ligandi. In questo modello i siti di legame vengono
considerati rigidi e complementari come forma al loro
ligando.
Nell’ipotesi dell’adattamento indotto (sequenziale), più
sofisticata, si postula invece che un’interazione flessibile
tra substrato e enzima induca una modificazione
conformazionale dell ’ enzima stesso (trasmessa
attraverso l’interfaccia tra le subunità) che porta ad un
aumento graduale
della
affinità
dell’enzima
per il
substrato.
Un ottimo esempio di regolazione allosterica dell’attività
enzimatica è dato dall’enzima aspartato transcarbamilasi
(ATCasi). Esso catalizza la prima tappa della biosintesi
delle pirimidine ed è un enzima che presenta una
inibizione a feedback negativo.
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Questo enzima possiede
un legame omotropico di
tipo cooperativo positivo
per entrambi i suoi
substrati (aspartato e
carbamil fosfato). Inoltre,
l ’ ATCasi viene inibita
eterotropicamente dalla
citidina trifosfato (CTP),
u n n u c l e o t i d e
pirimidinico, mentre viene
attivata eterotropicamente
dall’ATP.
A
B
C
D
E
F
CTP
K
L
M
ATP
OO
L’ATCasi di E.coli ha una
composizione in subunità di tipo
C6R6 dove C ed R sono
rispettivamente le subunità
catalitiche e regolatrici.
Le subunità catalitiche sono
organizzate in due trimeri (C3) e
dissociate mantengono l’attività
ma presentano curve di
saturazione da substrato
iperboliche non cooperative.
Pertanto, solo nell’enzima in
forma nativa si manifesta l’attività
allosterica e le subunità
regolatrici modulano l’attività
delle subunità catalitiche.
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come predetto
dalla teoria
dell’allosterism
o, l ’ attivatore
AT P s i l e g a
preferenzialmen
te alla ATCasi
attiva (stato R
ad alta affinità
per il substrato),
m e n t r e
l ’ inibitore CTP
si lega alla
forma inattiva
dell’enzima
(stato T o a
bassa affinità
per il substrato.
Utilizzando l’analogo bisubstrato (PALA) non reattivo
c h e s i l e g a s a l d a m e n t e a l l ’ AT C a s i n e l l a
conformazione R, ma non a quella T, è stato possibile
studiare la struttura ai raggi X della proteina nei due
stati e conoscere le differenze conformazionali
responsabili della modulazione allosterica.
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Sito
catalitico
Sito regolatore
ATCasi: conformazione T
ATCasi: conformazione R
TUTTE LE VIE METABOLICHE SONO SOGGETTE A
COMPLESSI CONTROLLI A FEEDBACK DOVE NELLA
QUASI TOTALITA’ DEI CASI VENGONO ADOPERATI
ENZIMI ALLOSTERICI MULTIPLI
Gli organismi viventi sono in grado, tramite gli
enzimi allosterici, di regolare il METABOLISMO
in modo fine e diversificato.
Tuttavia questo tipo di regolazione NON
BASTA per tutte le esigenze
dell’organismo
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Come in una fabbrica che chiude
un settore il cui prodotto finale
in quel momento non è
commerciabile, per riaprirlo in
un secondo momento
commercialmente più
conveniente, così esistono
alcune vie metaboliche (settori)
del metabolismo (fabbrica) che devono essere chiuse o
aperte in momenti opportuni.
QUALI SONO QUESTE VIE?
QUANDO DEVONO ESSERE
APERTE O ESSERE
CHIUSE?
COME VENGONO APERTE
O CHIUSE?
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VIE METABOLICHE CHE DEVONO ESSERE
O
COMPLETAMENTE APERTE
O
COMPLETAMENTE CHIUSE
enzimi che sono completamente attivi o inattivi fino a che
non vengono trasformati da una modificazione covalente
LAli rende
REVERSIBILITA’
E’ oDETERMINATA
che
capaci di funzionare
smettere di funzionare
DA REAZIONI INVERSE
MODIFICAZIONE
COVALENTE
REVERSIBILE
MODIFICAZIONE
COVALENTE
IRREVERSIBILE
La regolazione da legame covalente è dovuta ad enzimi che
catalizzano la formazione o la rotture di legami covalenti.
In alcune circostanze la variazione covalente può essere
considerata come un INTERRUTTORE MOLECOLARE che
può aprire o chiudere un’attività enzimatica e quindi, in
alcuni casi, una via metabolica.
La fosforilazione è un esempio molto comune di
modificazione covalente, altri esempi molto importanti
sono la rottura di un legame peptidico e la formazione
di un ponte disolfuro.
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L’attività di molti canali di membrana, enzimi e altre
proteine bersaglio è regolata mediante fosforilazione.
I diretti responsabili delle fosforilazioni sono enzimi detti
proteina chinasi. Ognuno di questi enzimi catalizza il
trasferimento PROTEINA
di un gruppo CHINASI
fosforico dall’ATP a un
gruppo ossidrilico di una catena laterale di serina, di una
treonina o di una tirosina di una proteina bersaglio
(substrato della chinasi).
Il distacco idrolitico del gruppo fosforico dalla proteina
fosforilata viene catalizzato da un enzima noto con il
nome di proteina fosfatasi. Una proteina bersaglio
(substrato) può essere ripetutamente fosforilata e
defosforilata.
PROTEINA FOSFATASI
Le chinasi e le
fosfatasi sono
catalizzatori
altamente
selettivi: la
fosforilazione di
catene laterali di
AA diverse,
all’interno della
stessa proteina
bersaglio,
avviene ad
opera di chinasi
differenti.
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La forma attivata
della glicogeno
fosforilasi, nella
glicogenolisi, opera la
rimozione dei residui
di glucosio dai
depositi di glicogeno,
scindendo e
fosforilando il residuo
all’estremità non
riducente delle catene
di glicogeno. Il
glucosio-1-fosfato
che si libera diventa
disponibile come
fonte di energia per le
cellule.
Nel muscolo scheletrico la glicogeno fosforilasi è un
dimero contenente due catene polipeptidiche identiche di
97,4 Kdalton. Esiste in due forme : una fosforilasi a ,
fosforilata sulla serina 14, attiva e una fosforilasi b, non
fosforilata e meno attiva. L ’ attivazione mediante
fosforilazione è catalizzata da una fosforilasi b chinasi,
che trasferisce il gruppo fosforico dall’ATP ai due residui
di serina . La disattivazione è provocata da una specifica
fosforilasi sfosfatasi
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Due forme di glicogeno fosforilasi
FOSFORILASI b CHINASI
ADP
fosforilasi a
dimero attivo
ATP
fosforilasi b
dimero inattivo
Aggiunge un fosfato alla
serina 14 della fosforilasi b
FOSFATASI
Catalizza la rimozione del fosfato
IDROLISI
La conversione della glicogeno fosforilasi dalla forma
inattiva (b) a quella attiva (a) è in realtà l’ultimo evento
di una serie di reazioni che hanno inizio quando la
superficie della cellula viene raggiunta da uno specifico
ormone, l’ADRENALINA.
In una sequenza di reazioni note come regolazione a
cascata, il segnale dato da una singola molecola
ormonale che prende contatto con la superficie
cellulare viene AMPLIFICATO per trasformare molte
molecole di fosforilasi b in fosforilasi a.
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La combinazione ormonerecettore attiva
l’adenilato ciclasi
ATTIVATORE ALLOSTERICO DELLE
PROTEINE CHINASI c-AMP DIPENDENTI
Serie di
attivazioni
covalenti
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B
A
D
C
E
F
Nei sistemi biologici molti
trasmettitori di segnali
chimici che agiscono tra
organi e tessuti diversi,
come le molecole di
ORMONI,sono presenti in
CONCENTRAZIONI MOLTO
BASSE, ciò nonostante
possiedono un’elevata
attività biologica
sull’ORGANISMO
BERSAGLIO
AMPLIFICAZIONE
Poiché tutti i passaggi sono catalizzati da ENZIMI e il
PRODOTTO di ogni passaggio è il CATALIZZATORE della
reazione successiva, ognuno di essi provoca un AUMENTO
del RAPPORTO PRODOTTO/CATALIZZATORE
Nel muscolo 10-10moli/gr
molecole di adrenalina
2x10-6 molecole di glucosio
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SISTEMA COSTITUITO DA UN ENZIMA CHE,
AGENDO SU UN SECONDO ENZIMA, NE
DETERMINA UNA MODIFICAZIONE COVALENTE
PAURA RABBIA
ADRENALINA
DEMOLIZIONE
GLICOGENO
GLUCOSIO
ATP
MUSCOLO IN FUNZIONE
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La regolazione della glicogeno fosforilasi non avviene
solo mediante fosforilazione, ma tale enzima viene anche
modulato allostericamente.
Questo enzima è infatti potenzialmente attivo anche
quando si trova nella forma b, forma che è fortemente
inibita da glucosio e ATP e attivata da AMP.
Se a una cellula che già possiede sufficienti riserve di
glucosio arriva un segnale (ormonale) che attiva il sistema
delle fosforilasi, l’enzima viene attivato finché quelle
riserve non siano esaurite. Anche, alti livelli di AMP ,
intracellulare, significano per la cellula una bassa carica
energetica e quindi necessità di mobilitare riserve di
energia.
Quindi, a bassi livelli di glucosio e ATP la fosforilasi b inizia
la demolizione del glicogeno anche in assenza di uno
stimolo ormonale necessario a convertirla nella forma a.
A basse concentrazioni di glucosio e ATP la glicogeno
fosforilasi b può iniziare la demolizione del GLICOGENO
anche in assenza di uno STIMOLO ORMONALE (adrenalina
o glucagone) necessario a convertirla nella FORMA a
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L’enzima chiave coinvolto nella costruzione del glicogeno,
la glicogeno sintasi, trasferisce un’unità attivata di glucosio
alla volta a una catena di glicogeno in fase di crescita.
Esso può esistere negli stati fosforilato e defosforilato. La
forma fosforilata della sintasi è inattiva in vivo, mentre la
forma defosforilata è in grado di esprimere il suo potere
catalitico.
GLICOGENO SINTASI
Per la glicogeno fosforilasi è vero invece il contrario: la
forma fosforilata della proteina è quella più attiva. Per i due
enzimi, il rapporto tra forme attive e forme inattive dipende
sostanzialmente dalla concentrazione di proteina chinasi e
proteina fosfatasi attive.
GLICOGENO FOSFORILASI
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Molti enzimi acquistano la loro piena capacità catalitica
quando assumono la loro struttura tridimensionale
caratteristica. Altri enzimi vengono sintetizzati come
precursori e successivamente attivati mediante rottura di
uno o più legami peptidici specifici.
Vi sono molti esempi di attivazione per proteolisi specifica
nei sistemi biologici:
Gli enzimi digestivi
Sono tutte sintetizzate nel
pancreas e vengono poi secrete
attraverso il dotto pancreatico nel
tratto duodenale dell’intestino
tenue. Per non danneggiare il
tessuto pancreatico, vengono
prodotte sottoforma di molecole
di dimensioni lievemente
maggiori (zimogeni: tripsinogeno,
chimotripsinogeno, proelastasi,
ecc.)
che devono essere
proteolizzate specificamente
nell’intestino per produrre gli
enzimi attivi.
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Le proteasi scindono
il legame peptidico
STIMOLO ORMONALE
generato dall’arrivo del contenuto gastrico
ZIMOGENI proteine di
dimensioni lievemente maggiori
CATALITTICAMENTE INATTIVE
dotto pancreatico
Sintesi PROTEASI
nel PANCREAS
Attivazione per
proteolisi
TRATTO DUODENALE
INTESTINO TENUE
Poiché l ’ attivazione della tripsina può essere
autocatalitica, il pancreas si protegge dalla digestione
anche mediante la sintesi di un forte inibitore
competitivo: l’inibitore pancreatico secretorio della
tripsina.
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Gli ZIMOGENI inattivi possono
essere una potenziale fonte di
pericolo per il PANCREAS
GRANULI
DI
ZIMOGENO
vescicole
intracellulari le cui pareti sono
probabilmente resistenti alla
degradazione proteolitica
INIBITORE
PANCREATICO
INIBITORIO DELLA
TRIPSINA
Efficiente a
concentrazioni
molto basse
Due tagli proteolitici in
sequenza dividono la proteina
in tre peptidi che rimangono
uniti da ponti disolfuro
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Enzimi proteolitici che hanno in comune una serina
nel SITO ATTIVO
Proteasi della coagulazione
TRIPSINA
CHIMOTRIPSINA
ELASTASI (pancreatica)
ENTEROCHINASI
Altre classi di proteasi
PROTEASI CISTEINICHE
PROTEASI AD ACIDO ASPARTICO
METALLO-PROTEASI
ENDOPEPTIDASI
Idrolisi dei legami peptidici
all’interno della catena
peptidica
CALLICREINA PLASMATICA
FATTOTRE XIIa
FATTOTRE XIa
FATTOTRE IXa
FATTOTRE XII
FATTOTRE VIIa
FATTOTRE Xa
FATTOTRE IIa (trombina)
PROTEINA C ATTIVATA
ESOPEPTIDASI
Idrolisi dei legami peptidici
all’esterno della catena
peptidica
Test di diagnosi per stabilire la presenza di
SERINA NEL SITO ATTIVO
DIISOPROPILFOSFOFLUORURO
Reagisce soltanto con
la serina di un sito
attivo
POTENTE INIBITORE
IRREVERSIBILE
Reagisce soltanto con
la serina 195 della
chimotripsina
dimostrando che
questo residuo si trova
nel sito attivo
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=
DIPF composto
VELENI NERVINI
organofosforico potente
H 2O
veleno nervino per la sua
O
capacità di inattivare
(CH3)3N-CH2-CH2-O-C-CH3 + H2O
l’ACETILCOLINAESTRASI,
Acetilcolinaesterasi
enzima che catalizza l’idrolisi
dell’ACETILCOLINA:
O=
(CH3)3N-CH2-CH2-OH +
C-CH3
NEUROTRASMETTITORE
HO
trasmette gli impulsi nervosi
Il DIPF è talmente tossico
attraverso certi tipi di SINAPSI
per l’uomo (la morte
COMPOSTI CORRELATI
sopravviene per incapacità
respiratoria) per essere
usato per scopi bellici come
GAS NERVINO
Malathion
La chimotripsina tripsina ed elastasi sono molto simili
Strutture primarie identiche per il 40%
Due domini contenenti estese regioni a struttura β
antiparallela
In tutte, oltre alla SERINA 195 esistono
altri due residui catalittcamente importanti:
ISTIDINA 57 e l’ASPARAGINA 102 ( sepolta
in una tasca vicina) che formano una costellazione
stabilizzata da legami ad idrogeno chiamata
triade catalitica
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Ciascuna serina-proteasi mostra una preferenza per l’idrolisi di
legami peptidici adiacenti a particolari tipi di a.a.
TRIPSINA
idrolizza legami peptidici che seguono a.a. basici
LISINA, ARGININA
CHIMOTRIPSINA
idrolizza legami peptidici che seguono a.a. con
catena laterale ingombrante idrofoba
TRIPTOFANO, FENILALANINA, TIROSINA, LEUCINA
Tipo
tripsina
Tipo
chimotripsin
a
ELASTASI
idrolizza legami peptidici che seguono a.a.con
catena laterale piccola e idrofoba
ALANINA, GLICINA, VALINA
Tipo
elastina
SELETTIVITA’
PREFERENZA
La tripsina può idrolizzare legami peptidici che
seguono residui aminoacidici idrofobici
TUTTAVIA
Velocità inferiore
L’insieme delle proteasi pancreatiche e intestinali
sono in grado di digerire quasi completamente la
maggior parte delle proteine che saranno assorbite
come aa. liberi dall’epitelio intestinale
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