- Lofarma

N
ISSN 2038-2553
Anno 32 - 2013 • Volume 31, n. 2
OTIZIARIO
ALLERGOLOGIC
Intelligenza artificiale e diagnostica
molecolare delle allergie
Il Toll-like
receptor 4
Il microarray
nella diagnosi
allergologica
La diagnostica
molecolare in rapporto
all’immunoterapia specifica
Premio Falagiani
Anno 32, 2013 - Volume 31, n. 2
direttore responsabile
Gianni Mistrello
redazione
Fabrizio Ottoboni
progetto grafico
Maura Fattorini
Stampato da:
Àncora Arti Grafiche
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amministrazione e pubblicità
Lofarma S.p.A.
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Registrazione Tribunale di Milano n. 306 dell’ 1.8.1980
Pubblicazione Quadrimestrale
Il Notiziario Allergologico è on-line su
www.lofarma.it
In copertina: Bufo bufo,
(Linneo, 1758)
Nella fotografia scattata pochi giorni fa
sull’Appennino parmense a 900 m d’altezza c’è
un Bufo bufo, il più grosso rospo europeo, lungo
anche 20 cm, ben adattato alla vita terrestre e
che si nutre di insetti, lumache, vermi etc. La
curiosità risiede nelle proprietà farmacologiche
del liquido che libera da due ghiandole sul collo:
15 molecole bioattive. Due in particolare sono
ben note, la bufotalina con azione simile alla
digitale, e la bufotenina, simile alla serotonina,
con proprietà allucinogene equiparabili all’LSD.
Questo spiega l’ampio uso dei rospi nelle
pozioni magiche di fattucchiere e maghi e nella
favola dei fratelli Grimm.
Fotografia di Daniela Ottoboni
sommario
Notiziario Allergologico, Anno 32 - 2013 - Volume 31, n. 2
editoriale
Il filo conduttore: William James
50
Fabrizio Ottoboni
aggiornamenti
Intelligenza artificiale e diagnostica molecolare delle allergie
51
Giovanni Melioli, Giovanni Passalacqua, Enrico Compalati, Giorgio Walter Canonica,
con la collaborazione di Clive Spenser, Giorgio Reggiardo, Nicola Baron, Eliana Rocco
Il microarray nella diagnosi allergologica
65
Riccardo Asero
La diagnostica molecolare in rapporto all’immunoterapia specifica
75
Giovanni Passalacqua
Il Toll-like receptor 4
81
Fabrizio Ottoboni
recensioni
Fabrizio Ottoboni
Unghie acriliche: un buon motivo per non mangiar molluschi
84
Rolland JM, Varese N, Zubrinich CM, O’Hehir RE.
I microRNA dalla mamma al figlio: una rivoluzione genetica
85
Kosaka N, Izumi H, Sekine K, Ochiya T.
SCIT e malattie autoimmuni: un falso problema
86
Linneberg A, Jacobsen RK, Jespersen L, Abildstrøm SZ.
Il segreto di Walt Disney
87
Ingram WM, Goodrich LM, Robey EA, and Eisen MB.
Th17 e sale da cucina, un problema sottovalutato
88
Kleinewietfeld M, Manzel A, Titze J, Kvakan H, Yosef N, Linker RA, Muller DN, Hafler DA.
Wu C, Yosef N, Thalhamer T, Zhu C, Xiao S, Kishi Y, Regev A, Kuchroo VK.
Leavy O.
E’ l’Api g5 responsabile della “mugwort-celery-fennel-syndrome”?
90
Borghesan F, Mistrello G, Amato S, Giuffrida MG, Villalta D, Asero R.
lofarma news
Gianni Mistrello
Premio Paolo Falagiani Correlazione tra la riduzione precoce
dell’IL-4 allergene-indotta e l’efficacia a lungo termine della terapia
iposensibilizzante con LAIS® per acari
92
Cristina Quecchia
calendario congressi
Ottobre 2013 - Marzo 2014
Redazione
96
editoriale
Il filo conduttore:
William James
Fabrizio Ottoboni
“L
a metafisica ha abitualmente condotto un tipo molto primitivo di ricerca. Voi sapete quanto gli uomini abbiano
sempre bramato il possesso delle arti magiche, e sapete anche quale parte hanno sempre avuto nella magia le parole. Se conosci il
suo nome o la formula incantatoria che lo
lega, puoi controllare uno spirito, un genio,
un ginn o qualsiasi altra potenza. Salomone
conosceva i nomi di tutti gli spiriti, e possedendo i loro nomi, li teneva soggiogati al
suo volere. Così l’universo è sempre apparso alle menti primitive come una specie di
enigma, la cui chiave deve essere vista nella
forma di qualche parola o nome illuminante o apportatore di potere. Quella parola nomina il principio dell’universo, e possederla è,
in qualche modo, possedere l’universo stesso. <Dio>, <Materia>, <
Ragione>, <Assoluto>, <Energia>, sono altrettanti nomi chiave. Chi
li possiede può sostare: è giunto alla fine della sua ricerca metafisica.
Ma chi segue il metodo pragmatico non può fermarsi a contemplare
una di tali parole e concludere la ricerca. Deve estrarne da ognuna di
esse il suo valore pratico in contanti (cash value) e metterlo all’opera
nel flusso della sua esperienza”.
Cosa c’entra William James (medico, filosofo, psicologo, 18421910) fautore dell’individualismo, del liberalismo, della fede nel
valore insostituibile dell’esperienza concreta con il Notiziario Allergologico n° 2 del 32° anno? Secondo il pragmatismo, le idee
e i concetti sono veri solo se consentono all’individuo di operare
sulla realtà.
La diagnostica molecolare è una tecnologia che rappresenta il presente ed il futuro in vari campi della medicina, noi abbiamo voluto
verificare la sua applicazione nel campo dell’allergologia. In questo
n° del Not Allergol ne descriviamo i principi e le ricadute pratiche
50
grazie a tre Autori di fama mondiale.
Cominciamo con Giovanni Melioli. Solo
lui poteva creare e spiegarci puntualmente
l’uso dei principi dell’intelligenza artificiale
per creare un software di interpretazione
dei risultati del microarray allergologico.
Un’impresa non facile ed in continua evoluzione. Leggete con attenzione l’articolo
più volte. La sorpresa finale è la (ris)scoperta della logica binaria che è alla base della
tecnologia attuale.
Nel secondo lavoro , Riccardo Asero spiega
accuratamente perché e come questa tecnologia serve all’allergologo nella fase diagnostica. Con molta onestà intellettuale insegna come usarlo e quali
sono i pro ed i contro. Rispondendo alla fine, a cosa serve
Infine Giovanni Passalacqua risponde da par suo alla domanda:
e adesso cosa ce ne facciamo di questi dati? Leggete l’articolo, ed
avrete le soluzioni che vi serviranno nella pratica clinica, spiegato
in modo semplice ed esaustivo come solo un grande esperto come
lui sa fare.
Il Not Allergol non finisce qui, e prosegue con la risposta all’intrigante quesito che vi ho posto nel n° precedente della rivista. Si, è
vero, tutte quelle patologie (e la loro soluzione) hanno all’origine
una di sregolata espressione di un recettore dell’immunità innata:
il Toll-like receptor 4. L’unico recettore dell’immunità innata con
due possibilità d’espressione sia pro che anti-infiammatorio. Un
fenomeno!
Le notizie aziendali, per finire, riguardano l’articolo di Cristina
Quecchia che ha vinto meritatamente il Premio Falagiani, istituito
nel 2011 per ricordare il suo grande contributo all’allergologia italiana e mondiale.
Buona lettura
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
aggiornamenti
Intelligenza artificiale
e diagnostica molecolare
delle allergie
Giovanni Melioli (1),
Giovanni Passalacqua (1),
Enrico Compalati (1),
e Giorgio Walter Canonica (1),
con la collaborazione di
Clive Spenser (2),
Giorgio Reggiardo (3),
Nicola Baron (4),
e Eliana Rocco (5)
Artificial intelligence and molecular diagnostics
in allergic diseases
1) Cattedra di Pneumologia e Allergologia,
Università di Genova, Genova, Italy;
2) Marketing Director, LPA Ltd, London (UK);
3) Unità di Biometria, Mediservice Srl, Genova, Italy;
4) Free Lancer in Informatics, La Spezia, Italy,
5) Dipartimento di Giurisprudenza,
Università di Genova, Genova, Italy.
Not Allergol 2013; vol. 31: n.2: 51-64.
introduzione
La disponibilitˆ di indagini molecolari
in allergologia ha modificato in maniera significativa l’approccio diagnostico (1) e, in alcuni casi terapeutico,
delle allergie (2). La diagnostica classica si basa su estratti “interi” di vari
allergeni (piante, animali cibi ecc.)
che contengono componenti proteiche
o glicoproteiche con differenti caratteristiche. Per esempio, un estratto di un
polline contiene una quota (in genere
variabile) di proteine “zavorra” (senza
attività allergenica), proteine specifiche (componenti genuini, altamente
rappresentativi di quell’allergene) e
componenti cross-reattivi, presenti in
altri allergeni spesso apparentemente
distanti. Attualmente, una tecnologia basata sui microarray consente di
identificare IgE specifiche per 112 differenti componenti allergenici, in parte
estrattivi e purificati, in parte ricombinanti, derivati da inalanti, cibi, imenotteri (3). L’analisi di tutti questi dati
è relativamente semplice nei pazienti
con un modesto numero di positività
(nei quali, peraltro è discutibile l’uso
di questo tipo di metodologia). Al contrario diventa complessa quando le positività sono numerose (4). Infatti, la
diagnostica molecolare, specialmente
se è utilizzata come diagnostica di
terzo livello, consente di identificare
con grande accuratezza allergeni genuini e cross-reattivi, definendo se il
paziente ha una co-sensibilizzazione
(quindi numerosi allergeni Ò genuiniÓ )
o una cross-sensibilizzazione (causata
da allergeni cross-reattivi), distinzione
spesso difficile utilizzando gli estratti
interi (5,6). Permette inoltre di identificare, all’interno di una famiglia di
componenti derivati dallo stesso allergene, se la sensibilizzazione è di-
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
riassunto
Parole chiave e sigle
• allergia • sensibilizzazione • allergene
• componente • sistema esperto SE
• intelligenza artificiale (AI)
• MDA • ISAC
La disponibilità di nuovi reagenti basati
su allergeni ricombinanti o altamente
purificati ha modificato l’approccio diagnostico delle malattie allergiche. In particolare, l’uso di microarray di allergeni
consente di analizzare il profilo IgE del
paziente allergico con grande accuratezza. E’ però evidente che l’interpretazione
dei rapporti tra 112 diversi componenti
(divisi in genuini e cross-reattivi, inalanti
ed alimentari, potenzialmente pericolosi o “innocui” ecc.) può risultare spesso
complessa. Per questo motivo è stato
sviluppato un Sistema Esperto, chiamato
51
aggiornamenti
riassunto
Allergenius®, che contiene le caratteristiche dei vari componenti e le regole che
governano le loro interazioni. Il report
di Allergenius® contiene una serie di informazioni generali, la descrizione delle
caratteristiche dei componenti positivi,
identifica le discrepanze tra dosaggio
delle IgE specifiche e risultati della diagnostica molecolare, segnala sensibilizzazioni potenzialmente pericolose e valuta la prevalenza di sensibilizzazione di
cross-reazione vs componenti genuini. In
questa fase di validazione finale del codice, Allergenius® è il sistema di supporto
più avanzato disponibile per la diagnostica molecolare dell’allergia.
fessionisti competenti della materia,
• sempre disponibile, pu˜ facilmente
essere aggiornato, non risente della
variabilità “individuale” e, a regime,
ha costi inferiori a quelli dell’esperto
umano. L’intelligenza artificiale si divide in due grandi settori:
a) i sistemi costruiti sulla base di regole conosciute da un esperto ed
b) i sistemi che auto-apprendono.
Il caso della diagnostica molecolare è
tipicamente il primo: infatti, ad oggi,
la base di conoscenze disponibili è ristretta ad un numero non illimitato di
allergologi. Per questi motivi, abbiamo iniziato, oltre 3 anni fa, la costruzione di un sistema esperto in grado
di aiutare l’allergologo nell’interpretazione degli ISAC. In questo articolo
descriviamo la struttura di un sistema
esperto, la sua costruzione, la sua validazione e l’applicazione di queste metodologie ad una problematica sicuramente complessa come quella della
Diagnostica Molecolare in Allergologia (MDA).
retta verso molecole “pericolose” e/o
molecole innocue. Infine, consente di
definire con grande accuratezza alcune sindromi rare, causate da cross-reattività inalanti/alimenti, che causano
sintomatologia spesso poco comprensibile (7). Il ruolo di un esperto, in
un sistema cos“ complesso, potrebbe essere determinante. Infatti, sono
avendo chiari i concetti sopra esposti,
• possibile sfruttare appieno le potenzialità di questa metodologia. Da moltissimi anni, le tecniche di intelligenza
artificiale hanno tentato di sostituire
l’uomo nei processi decisionali, specialmente quando i dati da analizzare
sono molto complessi o numerosi (810). I vantaggi erano apparsi subito
evidenti: un sistema esperto, costruito
sulla base di conoscenze consolidate
almeno in un ristretto numero di pro-
Malgrado qualche volta i computer
sembrano comportarsi da umani (specialmente nelle loro peggiori manifestazioni), chiaramente non sono in grado di pensare come gli umani. Quindi,
qualsiasi forma di ragionamento non
può che essere codificato “a monte”
con qualche istruzione. Il livello di
dettaglio di queste istruzioni definisce
anche la qualitˆ e la profonditˆ del ragionamento. In pratica, esistono due
52
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
l’intelligenza
artificiale
grandi universi dell’intelligenza artificiale (10): il primo è costituito dalla Ò computational intelligenceÓ ed •
costituito da sistemi che sono in grado
di imparare. In questo caso le strategie
possono essere differenti: da una parte
• possibile che il sistema registri quali
sono le decisioni che un esperto umano ha preso in presenza di determinate
condizioni, tenga un registro di queste
decisioni, le valuti statisticamente e
alla fine identifichi una regola da utilizzare. In questo caso possono essere
usati sistemi di reti neurali e algoritmi
di tipo evoluzionistico (con regole tra
Darwin e la genetica molecolare), ma
soprattutto vengono utilizzate strategie
di tipo Bayesiano, dove la valutazione
di quanto osservato viene modificata
aggiornandosi in base all’esperienza
accumulata. E’ abbastanza evidente
che queste tecniche di AI richiedono potenza di calcolo e, soprattutto,
esperti che verifichino, fino alla fine
della validazione, come il sistema elabora le informazioni. E’ chiaro che il
risultato ottenuto potrebbe essere anche molto diverso dall’atteso. Un approccio differente • quello dei sistemi
esperti (SE). Questi si basano su una
matrice di conoscenze, di regole e di
relazioni che consente di elaborare una
specifica situazione, anche complessa,
in maniera predefinita. In questo caso,
un risultato differente dall’atteso deve
essere sempre considerato sospetto:
non pu˜ , infatti, che essere determinato da un errore di valutazione originale
dell’esperto o da un errore nella programmazione (per esempio delle regole) del sistema decisionale. Come per
aggiornamenti
l’AI, anche i SE devono essere validati
con estrema attenzione, soprattutto
se trattano argomenti molto complessi, prima di essere rilasciati per l’uso
all’esterno al singolo.
teoria
dei sistemi esperti
Un SE è costituito da due differenti strutture. La prima, essenziale,
contiene le conoscenze di base del
problema e le informazioni specifiche della situazione in uso, le regole
(motore inferenziale) e un’interfaccia
con il mondo esterno. La seconda,
accessoria, prevede un modulo per
l’acquisizione delle informazioni e
un altro modulo per le spiegazioni
delle decisioni prese. Assieme, queste
due strutture operano sinergicamente
per mimare, nella maniera pi• corretta, il parere di un esperto. Infatti,
ci si aspetta che un SE agisca come
un esperto (umano) che pu˜ essere
consultato su un range di problemi
che ricadono all’interno della sua/suo
campo di conoscenza ed esperienza.
Tipicamente, un utilizzatore descrive i problemi che sta incontrando e
l’esperto offre informazioni, suggerimenti o raccomandazioni. Il dialogo
può essere condotto dall’esperto (che
pone le domande secondo una sua logica) o dall’utilizzatore che fornisce le
informazioni rilevanti (almeno a suo
parere) senza che l’esperto gli ponga specifiche domande. Per costruire
un SE, l’esperto definisce quindi una
serie di conoscenze di base ed una
serie di regole che governano i vari
summary
Key words and Acronyms
• Allergy • sensitization • Allergens • Component • Expert System
• Artificial Intelligence (AI) • MDA • ISAC
The availability of recombinant and highly purified allergen components has recently modified the diagnostics in allergic disease. In particular, microarrays of allergens allow an
accurate and extensive analysis of the IgE repertoire. At present, microarray technology has
been shown to be useful in poly-sensitized patients. However, the large number of components (112 in the present version), the presence of inhalants and food, of genuine and crossreacting components as well as the complex relationships between all these allergens make
the interpretation of these tests difficult in some cases. For this reason, an expert systems,
Allergenius®, based on the properties of allergens and the rules controlling their relations,
has been developed and is under clinical validation. Allergenius® produces a report that
describes the characteristics of the positive components, but also evaluates the discrepancies between sIgE and molecular diagnostics tests, identifies potentially hazardous sensitization and evaluates the impact of sensitization to genuine components vs cross reacting
components. In the present form, Allergenius® represents the most advanced interpretation
method for in vitro molecular allergy tests.
fatti (compresi nelle conoscenze di
base o acquisiti nel caso specifico da
analizzare). In altre parole, in allergologia, l’esperto dichiara che gli acari
(fatto) sono allergeni (fatto), inalanti
(fatto), perenni (fatto), che causano
una sintomatologia prevalente che va
dalla rinite all’asma (regola). Quindi
un paziente con un asma in ambienti
chiusi, tutto l’anno, con SPT positivi
per acari potrebbe essere considerato
(dall’esperto) come un paziente allergico (in quanto sintomatico) agli
acari. Il SE svolge un compito del
genere. Infatti, il corpo di conoscenze e di regole messo a disposizione
dall’esperto viene elaborato in termini informatici dell’ingegnere della
conoscenza, che deve preoccuparsi
del funzionamento del motore inferenziale (IE). Questo è il sistema “ragionante” dell’SE che, raccogliendo
le informazioni specifiche del paziente, le regole dell’esperto, produce
un’opinione. Il motore inferenziale
utilizza due tipi di ragionamento:
1. Forward Chaining • costituito
da regole che emettono un’opinione
in base ai dati di entrata. L’esempio
precedente era rappresentativo di una
metodologia di Forward Chaining.
In presenza di una sensibilizzazione
all’acaro, con asma, il sistema esperto potrebbe suggerire di verificarne la
mancanza di stagionalità.
2. Backward chaining • costituito
da regole che emettono un’opinione
sulla base del risultato osservato. Se,
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
53
aggiornamenti
nel precedente esempio, avessimo definito come il problema come paziente asmatico, perenne, un ES potrebbe
suggerire di verificare una sensibilizzazione all’acaro.
applicazione dei sistemi
esperti in medicina
L’uso dei sistemi esperti in medicina è stato sicuramente ipotizzato in
passato, ma le ricadute scientifiche e
pratiche sono state piuttosto modeste.
(11-15). E’ difficile capire le ragioni
di questa scarsa popolaritˆ della diagnosi medica supportata dal computer.
Infatti, molti dosaggi di farmaci (per
esempio anticoagulanti) sono stabiliti
dal computer attraverso algoritmi largamente diffusi ed è esperienza quotidiana utilizzare il web per trovare aiuto nella pratica medica. Sicuramente,
il medico Ò classicoÓ potrebbe temere
di essere sostituito da sistemi informativi, almeno in fase di diagnosi o
di impostazione della terapia medica.
Resta comunque il fatto che la medicina, in particolare la patologia clinica,
sta andando verso metodologie altamente automatizzate, in grado di produrre grandissime quantitˆ di risultati.
Si pensi per esempio alle tecniche di
La struttura dei frames
Tabella 1
frame inalanti
frame animali
frame insetti
frame acari
frame dermatofagoidi
frame derpt
instance Der p 1
instance Der p 2
instance Der p 10
frame derfa
instance Der f 1
instance Der f 2
NB: In questo esempio, sono riportati i componenti dei Dermatofagoidi.
La struttura si ripete per tutti gli altri componenti presenti in ISAC
54
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
biologia molecolare moderne (il cosiddetto Next Generation Sequencing
Ð NGS) o alla proteomica, che producono terabites di dati. In questi casi,
un supporto informatico (basato su
AI o su tecniche di data-mining) che
almeno scremi l’enorme quantità di
informazioni, non può essere escluso
Ò a prioriÓ .
le indagini diagnostiche
basate sull’allergologia
molecolare
Esistono situazioni, nella pratica allergologica, che richiedono un approfondimento. Per esempio, il paziente
poli-sensibilizzato, con sintomatologia da inalanti e da alimenti, deve essere studiato con grande accuratezza,
soprattutto nell’ottica di programmare una immunoterapia sottocutanea
(SIT) o sublinguale (SLIT). Nei casi
pi• semplici (quelli che in passato sarebbero stati identificati come monosensibilizzati, in quanto la positività
era per una sola famiglia di allergeni,
quali acari, graminacee, ecc.), una diagnostica molecolare • necessaria per
verificare se la sensibilizzazione è diretta verso componenti genuini (per il
Phleum perenne, Phl p1 e Phl p 5) o
verso componenti cross-reattivi (Phl p
7, una polcalcina o Phl P 12, una profilina). Nel primo caso, difficilmente
potranno essere presenti positività
verso altri allergeni che contengono
omologhi di Phl p 7 o Phl p 12. Nel
secondo, utilizzando SPT o sIgE, il
numero di allergeni positivi (dovuto
a cross reazione) potrà essere ben su-
aggiornamenti
periore. È però evidente che, nell’impostazione di una immunoterapia
specifica, l’aggiunta di allergeni che
contengono solo la quota cross-reattiva, comporterebbe solo la diluizione
degli allergeni Ò genuiniÓ . Anche se il
dato deve essere ulteriormente confermato, si stanno raccogliendo evidenze
del fatto che una IT verso allergeni
“genuini” è più efficace, in genere di
una IT verso allergeni cross reattivi.
E’ stato anche suggerito che un “eccesso” di reattività verso componenti
cross-reattivi comporta, nel caso di IT,
un vantaggio terapeutico inferiore alle
aspettative (16). Quando il numero
di componenti molecolari da analizzare è elevato (per esempio, oltre 10
differenti test), la convenienza economica dei test Ò single-plexedÓ • bassa,
mentre risulta più vantaggioso l’uso di
test Ò multiplexedÓ basati su matrici di
componenti allergenici. Il test ImmunoCAP ISAC (Thermo Fisher Immunodiagnostics), disponibile commercialmente da alcuni anni, si basa su
112 differenti componenti. Il profilo
IgE del paziente viene quindi analizzato contro un gran numero di possibili agenti sensibilizzanti. Naturalmente,
nel caso del Phleum p., basta ricordare
due componenti genuini e due crossreattivi per avere un quadro chiaro
della situazione. Ma quando la stessa
situazione si replica per alcune decine di volte, è chiaro che la memoria,
potrebbe non essere sufficiente. Inoltre, esistono famiglie di componenti
cross-reattiviti (quali, per esempio, le
profiline, la PR-10, le Lipid Transfer
Proteins, le sieroalbumine, le tropo-
Tabella 2
Esempi di regole e relazioni
1) Warning rules
• if ltp`s somma >=30 and language is ‘english’ then write( ‘Sensitization to ns LTP,
potentially associated to Oral Allergic Syndrome (OAS), systemic reactions, shock,
anaphylaxis. ‘ ) and nl .
• if albumina2S`s somma >=30 and language is ‘english’ then write
( ‘Sensitization to 2S albumin, potentially associated to Oral Allergic Syndrome (OAS),
systemic reactions, shock, anaphylaxis. ‘ ) and nl .
• if globulina11S`s somma >=30 and language is ‘english’ then write
( ‘Sensitization to 11S globulin, potentially associated to Oral Allergic Syndrome (OAS),
systemic reactions, shock, anaphylaxis. ‘ ) and nl .
• if globulina7S`s somma >=30 and language is ‘english’ then write
( ‘Sensitization to 7S globulin, potentially associated to Oral Allergic Syndrome (OAS),
systemic reactions, shock, anaphylaxis. ‘ ) and nl .
• if [ ltp`s somma <30 and albumina2S`s somma <30 and globulina11S`s somma
<30 and globulina7S`s somma <30 ] then write( ‘No warnings for this sample. ‘).
2) Artemisia rules
• if a1 is ‘art_v1’ and art_v1`s number >= 30 and art_v1`s number < 30
and language is ‘english’then write( ‘ Primary sensitization to Artemisia
with respiratory symptoms ‘ ) .
• if a1 is ‘art_v1’ and art_v1`s number >= 30 and art_v1`s number >= 30
and language is ‘english’then write( ‘ Non only respiratory symptoms
but also Oral Allergic Syndrome (OAS), eczema, urticaria also with food contaminated
by artemisia pollen. ‘ )
3) Consistency rules
• if tf1 is ‘der_p1’ and idp`s isu_rast >0 and der_p1`s number > 30 then write
( ‘ - This result is compatible with the results of specific IgE testing for D1 (rr1) ‘) .
• if tf1 is ‘der_p1’ and idp`s isu_rast >0 and der_p1`s number < 30 then write
( ‘ - Attention, there is a discrepancy between this result and specific IgE testing
for D1 (rr2) ‘) .
• if tf1 is ‘der_p1’ and idp`s isu_rast =0 and der_p1`s number > 30 then write
( ‘ - Attention, there is a discrepancy between this result and specific IgE testing
for D1 (rr3) ‘) .
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
55
aggiornamenti
miosine ecc.) che sono distribuite in
maniera diffusa tra differenti sorgenti
allergeniche. Infine, molti componenti cross-reattivi documentabili con
ISAC, sono presenti anche in allergeni
e/o componenti non presenti nella routine clinica. Tutte queste considerazioni giustificano l’uso di un sistema di
supporto alla diagnosi basato sull’AI.
i data base
“allergologici”
Lo sviluppo della diagnostica molecolare in allergologia • stato molto rapido ed ha consentito di identificare numerosissimi componenti allergenici.
Pertanto, negli ultimi anni sono state
pubblicate numerose rassegne bibliografiche riguardanti le caratteristiche
dei differenti componenti allergenici. Tra queste ricordiamo Sastre (1),
Egger (17) e Rossi (18). Sono inoltre
disponibili numerosi database che
contengono quantitˆ enormi di informazioni sugli allergeni. Tra questi:
1. Allergome (www.allergome.org)
liberamente consultabile, che contiene
informazioni tassonomiche e biologiche sulle molecule allergeniche conosciute che possono provocare malattie
allergiche (19).
2. Allergen Online (www.allergenonline.com), database di allergeni e
sequenze utilizzato principalmente per
l’identificazione di proteine
3. IUIS Allergen Nomenclature
Home Page (www.allergen.org). E’ il
sito ufficiale per la classificazione e
nomenclatura sistematica degli allergeni, approvato dalla World Health
56
Organization and International Union
of Immunological Societies (WHO/
IUIS) Allergen Nomenclature Subcommittee (20).
4. The Allergen Database (allergen.
csl.gov.uk) liberamente consultabile,
per la ricerca ed il confronto di allergeni ed epitopi.
5. AllFam (www.meduniwien.ac.at/
allergens/allfam) database dedicato
alla classificazione dei component allergeninici in specifiche famiglie (21).
6. Swiss Uniprot for allergens
(www.uniprot.org/docs/allergen.txt),
la bibbia della proteomica applicata
agli allergeni.
il sistema x-pert
per l’analisi dei risultati
di immuno cap isac
Per supportare il microarray di allergeni, nella versione con 112 componenti,
ThermoFisher ha sviluppato un modello di referto Ò commentatoÓ particolarmente efficace. A monte dello sviluppo del software di analisi, Thermo
Fisher ha analizzato con grandissimo
dettaglio le proprietˆ diagnostiche dei
reagenti utilizzati. Essenzialmente tale
sistema suddivide, in base alla letteratura nota, componenti genuini e cross
reattivi, inalanti ed alimentari. Da più
parti si sostiene che ISAC è un test di
terzo livello, particolarmente efficace
nei pazienti polisensibilizzati (4), da
interpretare utilizzando criteri di diagnostica classica (SPT e sIgE – quindi
primo e secondo livello), ma anche
criteri clinici, almeno per modificare
la diagnosi di sensibilizzazione in dia-
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
gnosi di allergia verso quel componente. Nel caso di X-pert, chiaramente, gli
unici commenti possibili sono relativi
ai risultati del test ISAC. Per questo
motivo, il report contiene l’elenco
(strutturato) di tutti i componenti positivi, con la descrizione del significato
biologico, il ruolo nella cross-reattività, e la potenziale pericolosità, sulla
base della letteratura disponibile. Questo tipo di approccio • estremamente
efficace per l’utilizzatore esperto (che
verifica, nel report se viene riportata
qualche caratteristica particolare) ma
è meno utile all’utilizzatore standard.
Infatti, nella sua struttura attuale, Xpert appare come un report esaustivo
che potrebbe non lasciare completamente intendere quanto il risultato di
ISAC deve essere integrato da altre
informazioni per avere un reale valore
nella pratica allergologica.
sviluppo
di allergenius®
Per sviluppare Allergenius¨ , abbiamo
tenuto in considerazione tutta l’attività di ricerca che il nostro gruppo ha
svolto in questi anni. Come anticipato, siamo profondamente convinti che
ISAC possa aggiungere valori reali
alla diagnostica di laboratorio (4, 6).
Ma deve essere utilizzato nell’ambito di protocolli definiti che prevedano una anamnesi allergologica, una
serie di indagini di base, tra cui SPT
ed alcuni test di secondo livello (per
esempio sIgE). Solo nei casi nei quali
i risultati ottenuti non possano essere
descrittivi del quadro clinico osser-
aggiornamenti
CCD, LTP, Parvalbumine, PR-10,
profiline, taumatine, tropomiosine,
Seroalbumine, prolammine, viciline,
pectato-liasi, cupine, 2S albumine, 11
S globuline, 7 S globuline, Cisteinaproteasi, NPC2, Caseine, transferrine,
Lisozima, Glucanasi, Oleosine, inibitori dell’alfa amilasi.
1.4. Le sindromi pi• note da crossreagenti
(es.
Alternaria-spinach,
Birch-apple,
Celery-mugwort-spice,
Cypress-peach, Goosefoot- fruit association, Goosefoot - melon, Latex-fruits,
Mite-Shrimp,
Mugwort-chamomile,
Mugwort-Mustard, Mugwort-Peach,
Pellitory-pistachio,
Plantain-melon,
Ragweed-melon-banana, Russian thistle-saffron, Wheat-Dependent Exercise-Induced Anaphylaxis)
2. Scelta di Flex, un language di
Win-Prolog. Flex è un software potente e versatile progettato per aiuta-
re lo sviluppo e la fornitura di Sistemi Esperti. Flex è implementato in
Prolog, un linguaggio ad alto livello
basato su regole. Flex si avvale di un
metodologia che utilizza uno stile di
lingua naturale per definire la conoscenza utilizzando un “Knowledge
Specification Language” (KSL). In
questo modo, un programma in Flex
sembra molto pi• simile a una serie
di frasi in Inglese che un linguaggio
di programmazione. Flex è in grado
di organizzare i dati all’interno di gerarchie, eventualmente correlate tra di
loro. In questo modo, quando un frame
ne contiene altri, i “figli” mantengono
le proprietˆ dei Ò genitoriÓ a meno che
non vengano specificamente modificati. I files scritti in Flex vengono tradotti in Prolog in fase di compilazione.
Prolog • un linguaggio per la costruzione di sistemi esperti particolarmen-
Pagina iniziale sito web
vato, possono essere utilizzati test di
terzo livello come gli allergeni ricombinanti e l’ISAC. Alternativamente, il
professionista può decidere se utilizzare il terzo livello come supporto a un
programma di immunoterapia (SIT o
SLIT), specialmente nel paziente polisensibilizzato, dove questo approccio
si è dimostrato altamente redditizio (2,
6). Per sviluppare Allergenius¨ • stato
necessario acquisire una serie di informazioni e di tecnologie che vengono
descritte sommariamente nei punti
successivi.
1. Costruzione della base di conoscenze per MDA. La base di conoscenze per il SE è stata costituita da una
serie di informazioni raccolte in questi
anni e basate prevalentemente su:
1.1. Elenco dei 112 componenti presenti in ISAC. Di ognuno, sono state
raccolte l’origine allergenica, la Famiglia, la Sub Famiglia, l’origine (naturale o ricombinante), il tipo (inalante/
cibo ecc.), la biochimica, la reattività
(genuina/cross reattiva), la suscettibilitˆ (acido, peptidasi, temperatura) e la
struttura primaria della proteina.
1.2. Elenco degli allergeni a cui appartengono i 112 componenti. Di questi sono stati raccolti la Classificazione
biologica (Domain, Kingdom, subKindom, Phylum, Class, Sub-Class,
Order, family, Sub-Family, Tribe,
Sub-Tribe, Genus, Species and subspecies) e Classificazione allergologica (Groupment, Contact, Specie, English name, Italian Name, other Italian
Name, allergen characteristics)
1.3. Raggruppamenti di allergeni (famiglie): Calcium Binding proteins,
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
57
aggiornamenti
te orientato alla gestione di parametri
logici piuttosto che numerici. Per questo motivo, è particolarmente indicato
per la costruzione di sistemi di supporto alla diagnosi medica.
3. La struttura gerarchica di Flex.
I frames sono il cuore dove le conoscenze sono immagazzinate. Nello specifico caso, i frames sono stati
costruiti sulla base delle conoscenze
sopra descritte. I frames utilizzati
sono elencati nella tabella 1. Per ogni
componente, sono descritte le seguenti
caratteristiche: class (es. inhal, food),
display (es. Act d 1), origin (allergene) and nature (genuino, cross-reattivo) al_fam (es. LTP, profiline ecc.)
and chimica (es. cistina_proteasi),
it_nameA (es. acaro), eng_nameA
(es. mite), comment (qualsiasi osservazione rilevante, per esempio dalla
letteratura, in Italiano ed in Inglese),
perc_pos (percentuale di posistivi in
una popolazione non selezionata, indica la frequenza di sensibilizzazione),
max (indica il massimo score osservato, in genere basso per alimenti ed alto
per inalanti), median (score mediano),
nov75 (97,5° percentile) heat , ph e
pept (suscettibilità fisico-chimica).
Tutte le altre (vedi paragrafo 7a e 7b),
sono contenute in allegati raggiungibili mediante link (ipertesto), come descritto sotto.
3.1. Le regole e le relazioni. Costituiscono la seconda parte della base di
conoscenza di cui è dotato il SE. Esistono moltissime regole in un SE, nella
versione attuale le regole implementate sono 711. Vanno da come deve essere identificata una famiglia di allergeni
a quali sono i rapporti tra differenti
allergeni. Per esempio, in presenza di
uno score molto elevato per Par j 2
(una LPS molto poco omologa ad altre
LPS), l’interpretazione della positività
(molto bassa) degli score di altre LTP
(per esempio, Art v 3, Cor a 8 o Ara h9)
deve essere molto attenta a causa di
possibili cross-reazioni. Un’altra regola associa la positività (isolata) di Jug
r 2 con la positività a CCD (Mux f 3) e
Phl p 4 (22), tutti componenti con abbondanti componenti glicidiche crossreattive. Ancora, una positività a Lep
d 2 associata ad una positività a Der
p2 o Der f 2, specialmente se lo score
di questi ultimi è molto elevato potrebbe non essere considerata genuina ma
piuttosto secondaria ad una cross reattività basata sull’elevata omologia tra i
componenti. Un’altra serie di regole (in
questo momento in sperimentazione)
verifica se il risultato analitico è correlato con la clinica. Un’asma perenne
si associa sicuramente alla positività
di componenti molecolari dell’Acaro,
mentre non sembra specificamente
correlata ad una sensibilizzazione ad
un componente dell’uovo, nel paziente adulto. E’ chiaro che molte regole
fanno parte del patrimonio colturale
dell’allergologo, altre possono essere
ricavata da pubblicazioni o altri eventi
scientifici, alcune sono comunicazioni
personali e, infine altre sono semplici
pareri di esperti. Come per la Evidence
Based Medicine, anche per i SE esiste un gradiente di rilevanza. Il parere
dell’esperto, ultimo livello di questa
scala, è stato utilizzato comunque dal
momento che, a giudizio degli Autori,
58
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
un parere • sempre qualcosa di pi• di
niente.
4. Le informazioni per Allergenius¨
(input). Come anticipato, i SE sono
costituiti da una base di conoscenze
e da una serie di regole che consentono l’analisi delle conoscenze alla
luce della specifica situazione oggetto
dell’analisi. Di conseguenza, alla base
di dati ed alle regole, per ogni differente elaborazione, bisogna aggiungere le informazioni relative allo specifico paziente. Queste sono:
4.1. i dati anagrafici, che consentono
di identificare l’età - alla luce della
marcia allergica ed allergenica (5, 22)
- ed il genere (essenziale nei report in
lingua italiana dove l’editing per il maschile ed il femminile sono differenti).
4.2. I risultati di test di primo (SPT) e
secondo livello (IgE totali e IgE specifiche), essenziali per interpretare i
risultati della diagnostica molecolare. Per entrambi viene considerato un
pannello standard per tutti i pazienti,
contenente: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Gatto, Cane, Cynodon dactylon,
Phleum pratense, Betula verrucosa,
Olea europoea, Cupressus arizonica,
Artemisia vulgaris, Ambrosia alba,
Parietaria judaica, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Hevea
brasilensis, Latte, Uovo.
4.3. Informazioni cliniche: Asma,
Rinite, Congiuntivite, Orticaria, Sintomatologia Gastroenterica, Cefalea,
Sindrome Orale Allergica, Anafilassi,
Angioedema, Shock.
4.4. I risultati dei 112 componenti di
ImmunoCAP ISAC.
aggiornamenti
4.5. Nella versione attuale di Allergenius¨ , tutti gli input sono forniti
come file .txt sequenziali e vengono
posizionati in quattro strutture diverse, riconosciute dal ES come NOME_
RAST, NOME_ANA, NOME_ISAC
e NOME_CLIN
5. Come funziona Allergenius¨ .
5.1. Allergenius¨ contiene, nel suo
interno, la base di conoscenza, logicamente separata dal corpo delle regole
e delle relazioni. In questo modo, è
possibile modificare un fatto o una
regola senza che debba essere modificata la struttura del codice. Per ogni
analisi, “cattura” tutte le informazioni
relative al paziente dai file di .txt di
input. Una serie di routine consentono
di effettuare tutti i calcoli degli score
rilevanti per l’analisi. Per esempio, calcola lo score di ogni raggruppamento
(Alberi), di ogni allergene (Olea), di
tutti gli alimenti, di tutte le LTP ecc.
Successivamente, grazie ad una struttura basata su due loop (il primo per
analizzare i componenti in quanto tali,
il secondo per analizzare le famiglie
cross-reattive), calcola non solo tutti
i rapporti tra i differenti componenti,
ma inserisce tutte le informazioni aggiuntive rilevanti per ogni componente
positivo. Tutte le informazioni (si tratta
di migliaia di risultati) sono identificate in maniera vettoriale, utilizzando le
variabili consentite dal software. Flex
consente infatti di denominare le variabili in maniera molto diretta (per
esempio, Derp1’s score, Acari’s sum,
LTP’s max, PR-10’s median). In questo
modo, la parte di codice relativo alla
scrittura del report • molto semplice.
Percentuali
di componenti negativi e sIgE positivi
Tabella 3
Componente
% negative
score
Dermatophagoides pteronyssinus
Dermatophagoides farinae
Gatto
Cane
Cynodon dactylon
Phleum pratense
Betula verrucosa
Olea europoea
Cupressus arizonica
Artemisia vulgaris
Ambrosia alba
Parietaria judaica
Alternaria alternata
Aspergillus fumigatus
Lattice
16.9
12.7
6.5
26
8.2
3.0
9.4
21.3
8.4
23.8
37.2
19.6
2.7
6.4
9.9
2.4
1.6
0,5
1.5
1.2
0.4
2.6
1.9
0.9
2.2
3.4
2.5
1.9
2.6
1.9
6. Il report di Allergenius¨ (output). Il report di Allergenius¨ pu˜
essere sia in Italiano che in Inglese.
Possono essere anche definiti i livelli di
complessitˆ del report stesso (base, intermedio, professionale, avanzato), in
base alla quantità di informazioni che
possono essere inserite nel report stesso. Alcuni esempi di report sono visibili nel sito www.allergenius.it. In breve,
questi sono i paragrafi del report:
6.1. Dopo una intestazione con i dati
dell’ente, vengono riportate le informazioni anagrafiche del paziente e
la data di esecuzione del test. Viene
immediatamente inserita la frase “Informazione importante: le indagini di
laboratorio indicano solo la presenza
di una sensibilizzazione verso uno
specifico componente. La diagnosi di
allergia viene posta in presenza di una
sensibilizzazione e di segni o sintomi
clinici adeguatiÓ .
6.2. La situazione generale del paziente viene commentata identificando se esiste una sensibilizzazione per
i componenti allergenici presenti in
ISAC. In particolare, se il paziente è
sensibilizzato a inalanti, cibi, componenti pan-allergenici, componenti genuini, componenti cross-reattivi. Viene
anche descritta la frequenza di questo
tipo di sensibilizzazione in una popolazione si allergici non selezionati.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
59
aggiornamenti
Analisi delle discrepanze tra ISAC e dosaggio delle IgE specifiche
Tabella 4
Allergene
Totali
sIgE-ISAC-
sIgE+ ISAC-
sIgE+ ISAC+
sIgE+ ISAC-X+
Score Mediano
Componenti
considerati
Ambrosia
100%
48%
19%
2%
30%
0,8
PR, PR-10,CBP
Artemisia
100
52%
9%
18%
21%
0,7
PR, PR-10,CBP
Parietaria
100
31%
6
43
19
0,82
PR, PR-10,CBP, LTP
Betulla
100
42
9
36
12
0,81
PR, PR-10,CBP
Gatto
100
53
1
37
8
0,47
TR, AC, SA
Cane
100
54
10
8
27
1,22
TR, AC, SA
Lattice
100
72
5
3
20
0,65
PR, PR-10, CBP
CAP-ISAC-: pazienti negativi sia a sIgE che ISAC;
CAP+ ISAC-: pazienti positivi per sIgE che negativi con ISAC;
CAP+ ISAC+: pazienti positivi sia a sIgE che ISAC;
CAP+ ISAC- X+: pazienti positivi con sIgE, negativi per ISAC
ma positivi per componenti correlati cross-reattivi.
Score Mediano: score sIgE nei pazienti ISAC negativi.
Componenti considerati:
PR=
profilina,
CBP= Calcium Binding Protein,
PR-10= Bet v 1 omologhi,
LTP= Lipid Trasnfer Proteins,
6.3. Vengono successivamente riportati alcuni risultati statistici generali:
6.3.1. Somma degli score di tutti i
componenti (e percentuale del totale).
6.3.2. Somma degli score dei componenti genuini (e percentuale del totale).
6.3.3. Somma degli score dei componenti cross reattivi (e percentuale del
totale).
6.3.4. Somma degli score dei panallergeni (e percentuale del totale).
6.4. Rapporto fenotipico (rappor-
to tra score dei componenti genuini
e cross-reattivi). Questo rapporto viene commentato alla luce dei risultati
di alcune recenti pubblicazioni che
associano la frequenza di sensibilizzazione a componenti cross-reattivi con
risultati terapeutici modesti in pazienti
trattati con ITS (5, 16).
6.5. Analisi delle componenti da allergeni inalanti (acari ed altri parassiti, animali, alberi, graminacee, erbe,
miceti).
6.6. Analisi delle componenti da allergeni alimentari (latte, uovo, ara-
60
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
TR= tropomiosina,
AC= acari,
SA= Sieroalbumina.
chide, noce, nocciola, noce, kiwi, pesca, mela, grano, grano saraceno, soia,
anacardio, sedano, gambero, anisakis,
merluzzo)
6.7. Analisi delle componenti da allergeni da contatto (Latex)
6.8. Analisi delle componenti da allergeni di imenotteri. In tutti questi
casi, vengono mostrate solo le componenti “positive”
6.9. Analisi delle componenti crossreattive ( PR-10, LTP, sero-albumina,
polcalcina, lipocalina, parvalbumina,
profilina, tropomiosina, CCD, taumati-
aggiornamenti
ne, pectato-liasi, albumina 2S, globulina 11S, globulina 7S, cisteina-proteasi,
NPC2)
6.10. Ò Post Molecular AnamnesisÓ.
Sulla base dell’elenco delle sindromi
e delle associazioni legate a specifici
componenti (vedi 1.4), Allergenius¨
identifica, sulla base del profilo IgE
del pazienti, quali quadri clinici potrebbero essere coinvolti. Con questi
suggerimenti, il medico potrebbe porre domande più specifiche al paziente,
se non lo ha giˆ fatto nel corso della
prima visita.
6.11. Suggerimenti
terapeutici.
Questa • una sessione sperimentale
del report e basa le conclusioni sulla
frequenza di sensibilizzazione a componenti genuine e cross-reattivi, in
base a quanto descritto (5, 16, 23).
6.12. Discrepanze tra dosaggio delle IgE specifiche e risultati di ISAC.
Questo capitolo identifica se una positività osservata mediante SPT o sIgE
ha un corrispondente in allergologia
molecolare. Chiaramente, la frequenza di positività osservate utilizzando
allergeni estrattivi è sempre superiore
a quella che si osserva con i componenti molecolari. In genere, però, a
componenti “negative” si associano
anche score molto bassi di sIgE. Un
esempio di questi score • presentato
nella tabella 3.
6.13. Analisi delle discrepanze. Le
discrepanze descritte al punto precedente vengono anche analizzate alla
luce della presenza/assenza di reattività verso componenti cross-reagenti
(tabella 4). Per esempio, un dosaggio
delle sIgE per Ambrosia a. pu˜ essere
positivo mentre le IgE anti Amb a 1
sono negative. Questo può succedere
con una frequenza piuttosto elevata
(da 37 a 49% dei casi in varie statistiche). Peraltro, il paziente potrebbe
essere sensibilizzato verso altri componenti cross reattivi dell’Ambrosia.
Alcuni di questi componenti (per
esempio, profiline, CBP ecc.) sono valutati da ISAC. Anche se non sempre
una positività a un componente crossreattivo rappresenta una positività
verso tutta la famiglia degli allergeni
(CO Add V), è però chiaro che, almeno in fase di analisi del dato, queste
positività possono essere considerate.
Sempre nel caso dell’Ambrosia, utilizzando dati dai nostri data base, la
positività per CAP e Amb a 1 (in una
popolazione italiana) era bassa: circa
2% dei soggetti analizzati aveva una
reale sensibilizzazione verso l’Ambrosia. Al contrario, 19% erano positivi al CAP ma negativi a Amb a 1,
mentre 30% dei soggetti CAP positivi,
Amb a 1 negativi era anche positivo
per almeno un componente cross reattivo (PR-10, Profiline e Polcalcine).
Una situazione simmetrica può essere
osservata nel caso di sensiblizzazione
alla betulla: infatti solo il 6% di tutti i pazienti studiati era CAP positivo
e Bet v 1 negativo; il 19% era CAP
positivo, Bet v 1 negativo ma componenti cross-reattivi positivo, mentre il
43% era CAP positivo e Bet v 1 positivo. Tutte queste combinazioni devono
essere considerate in maniera adeguata per interpretare in modo corretto i
risultati di un microarray di allergeni.
7.
I link. Il report prodotto da
Allergenius¨ è costituito da un file
di testo che viene successivamente
elaborato con una macro in Visual
Basic, dopo essere stato acquisito da
MS-Word. La macro associa tutte le
definizioni rilevanti con specifici indirizzi web che contengono informazioni aggiuntive che, inserite nel testo del
report, potrebbero renderlo troppo pesante. Per esempio, alla parola GATTO viene associato l’indirizzo www.
allergenius.it/doc/gatto.pdf. In questo
link sono presentati le classificazioni
linneane dell’allergene, la fotografia,
i componenti presenti in ISAC ecc.
In questo modo, l’utente esperto può
facilmente “saltare” l’informazione
(che verosimilmente conosce benissimo) mentre l’utente meno esperto può
trovare informazioni e spiegazioni che
altrimenti dovrebbe cercare in altre
sedi.
8.
I risultati Ò semiquantitativi
(++++)Ó . E’ esperienza comune che
lo score per inalanti ha una variabilità tra 0 e 100 ISU, mentre quello per
alcuni altri componenti (per esempio,
alimentari) varia tra 0 e 10 ISU. Per
questo motivo, anche se non esiste ancora una soglia definita per identificare classi di rischio o classi di gravità
della patologia, i valori “semiquantitativi” sono stati calcolati in maniera
proporzionale al 97.5% percentile di
tutti i risultati ottenuti fino a questo
momento. In questo modo, anche un
ISU basso in termini assoluti, viene
evidenziato come significativamente
alto rispetto agli tutti gli altri valori
ottenuti per quello specifico componente.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
61
aggiornamenti
Anche gli argomenti contro l’utilizzazione dei SE in diagnostica allergologica sono numerosi. Il primo,
puramente ideologico, prevede che il
medico sappia tutto e, per questo motivo, non abbia bisogno di aiuto. Anzi,
un computer che supporta la diagnosi
viene visto come un rischio reale per
l’indipendenza della scienza medica e
per la reputazione del clinico stesso. E’
evidente che queste osservazioni possono essere oggetto di dibattiti infiniti
e, verosimilmente, senza che le parti
opposte trovino un punto di contatto.
Come ricercatori nel campo della Allergologia Molecolare, al contrario,
vediamo una serie di argomenti che,
a nostro parere, devono essere tenuti
in grande considerazione utilizzando
tecnologie basate sulla IA. La prima
difficoltà è “numerica” ImmunoCAP
ISAC è costituito da 112 differenti
componenti, variamente in relazione
tra di loro e le possibili combinazioni
sono praticamente infinite. Si possono ridurre considerando che esistono
altre regole (per esempio, la frequenza di certi “fenotipi”, le differenze
geografiche ecc.) che condizionano
il risultato. Ma anche in questo caso
il numero possibile di combinazioni
è estremamente elevato. Un SE, per
essere utile, dovrebbe contemplare il
maggior numero di situazioni possibili. Chiaramente, non è possibile produrre, utilizzando regole e relazioni,
un SE che copra tutte le possibilità.
Non avremmo il tempo per analizzare e validare tutte le combinazioni
probabili, anche se fossero molti ordini di grandezza meno numerose di
quelle possibili. Un SE, costruito in
questa maniera, produce sempre risultati Ò attesiÓ , in quanto basati su
regole fisse o su “pesi” che possono
influenzare il risultato ma certamente non stravolgerlo. Certamente, per
avere una risposta in tutte le possibili
62
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
argomenti a favore
dell’utilizzazione dell’ai
per l’interpretazione
dei risultati
di immunocap isac
E’ chiaro che un SE è in grado di operare sempre, non ha passioni o simpatie, non sciopera e non si ammala,
annulla le differenze di interpretazione
tra differenti professionisti, costa molto meno di esperti Ò umaniÓ e produce un report scritto che, al termine di
una fase di validazione estremamente
accurata, può avere un ruolo significativo nei processi decisionali dell’allergologo. A questo si aggiunga che
l’allergologia molecolare è una scienza recente, l’evoluzione della ricerca
in questo settore • molto rapida e, per
questo motivo, l’aggiornamento capillare del medico potrebbe essere per
alcuni versi difficoltoso. Tutti questi
argomenti potrebbero spingere all’utilizzazione di tecniche di AI in moltissimi ambiti della medicina diagnostica
e della terapia.
argomenti contro
l’utilizzazione dell’ai
per l’interpretazione
dei risultati di i mmuno
cap isac
combinazioni, sarebbe necessario un
sistema auto-apprendente che, con il
tempo, si costruisse le regole da solo.
Esistono però seri problemi, almeno
in questo momento: intanto, dovrebbe essere Ò istruitoÓ e, per fare questo,
sarebbe necessario che un gran numero di esperti, con pareri largamente
concordanti e livello di conoscenze
omogeneo, commentassero il report
di Allergenius¨ , segnalando errori ed
omissioni. Secondo, regole fuori dal
controllo dell’ingegnere della conoscenza potrebbero generare risultati
corretti (in termini matematici) ma
del tutto fuorvianti in termini medici.
Queste due situazioni ci fanno propendere per l’uso di un SE con regole fisse, che vengono modificate con l’evoluzione delle conoscenze nel settore e
dell’esperienza dei revisori. Allergenius¨ è stato sviluppato di medici per
essere utilizzato da medici. Per questo motivo è estremamente rispettoso
dell’autonomia del professionista. Chi
non lo vuole utilizzare, semplicemente non legge il report. Chi sa tutto,
semplicemente non utilizza i link verso tabelle o altro tipo di spiegazioni.
Chi si considera un esperto, utilizza
la versione “avanzata”, che contiene
un gran numero di informazioni che
potrebbero fuorviare un professionista in formazione. Chi (erroneamente,
prima di ISAC) non ha fatto SPT e
sIgE non potrà confrontare i risultati
ottenuti da queste tecniche di primo
e secondo livello con i risultati (per
molti versi differenti) ottenuti dal terzo livello, perdendo numerosi valori
aggiunti.
aggiornamenti
conclusioni
In questa fase, Allergenius¨ non • ancora disponibile al di fuori di pochi laboratori di ricerca. Peraltro, alcuni esempi
di report di Allergenius¨ sono facilmente reperibili sul sito www.allergenius.it.
Chi avrà la pazienza di studiare il report
classico di ISAC, il report di X-pert,
la breve descrizione del caso clinico, i
risultati dei test di primo e/o secondo
livello, potrà verificare se il livello di
dettaglio e l’accuratezza del report di
Allergenius¨ • adeguata alla complessitˆ del problema e se, come tali, rispondente alle aspettative. Allergenius¨ ,
come ogni SE, è una creatura vivente
che si modifica in continuazione, con
l’aggiunta di nuove regole e di nuove
opzioni. Siamo convinti che potrà avere
un ruolo sia come supporto alla diagnosi dell’allergologo. Ma confidiamo anche che, almeno in un prossimo futuro,
possa essere utile anche come supporto
per un programma terapeutico efficace.
Sicuramente, in questa fase, è probabilmente un ottimo sistema per la formazione dei giovani colleghi che pensano
di costruire il loro futuro allergologico
basandosi sulle molecole.
Rossi RE, Vacca A, Canonica GW and the Italian
ISAC Study Group- The additional values of microarray allergen assay in the management of
polysensitized patients with respiratory allergy.
Allergy. 2013;68(8):1029-1033.
7. Melioli G, Canonica GW- Molecular allergy diagnosis: we need to become more
knowledgeable. Ann Allergy Asthma Immunol.
2012;108(6):387.
8. Castelfranchi-Stock- Macchine come noi.
Laterza, 2003.
9. Hopgood AA- The state of artificial intelligence. Advances in computers, M. Zelkowitz
Ed., Elsevier, 2005.
10. Hopgood AA- Intelligent Systems for Engineers and Scientists, Second Edition, CRC press,
2001.
11. Spackman KA, Connelly DP- Knowledgebased systems in laboratory medicine and pathology. A review and survey of the field. Arch
Pathol Lab Med. 1987;111(2):116-129.
12. Houwen B- The use of inference strategies
in the differential diagnosis of microcytic anemia. Blood Cells. 1989;15(3):509-527.
13. Ivandic M, Ogurol Y, Hofmann W, Guder
WG- From a urinalysis strategy to an evaluated
urine protein expert system. Methods Inf Med.
2000;39(1):93-98.
14. Nguyen AN, Milam JD, Johnson KA, Banez
EI- A java-based application for differential
diagnosis of hematopoietic neoplasms using
immunophenotyping by flow cytometry. Comput Biol Med. 2000;30(4):225-235.
15. Ritchie RF- A knowledge-based system to
aid with the clinical interpretation of complex serum protein data. Clin Chem Lab Med.
2001;39(11):1045-1053.
16. Schmid-Grendlmeier P- Recombinant Allergens Routine diagnostics or still only science. Der Hautarzt 2010;61(11):946-953.
17. Egger M, Mutschlechner S, Wopfner N,
Gadermaier G, Briza P, Ferreira F- Pollen-food
syndromes associated with weed pollinosis: an
update from the molecular point of view. Allergy. 2006;61(4):461-476. Review.
18. Rossi R, Monasterolo G, Rossi L- Attività
biologiche, immunologiche e cliniche degli allergeni alimentari. Ligand Assay 2012;17:72-97.
19. Mari A, Rasi C, Palazzo P, Scala E- Allergen databases: current status and perspectives.
Curr Allergy Asthma Rep 2009;9:376-383.
20. Chapman MD, Pomés A, Breiteneder H,
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
63
Bibliografia
1. Sastre J- Molecular diagnosis in allergy.
Clin Exp Allergy 2010;40(10):1442-1460.
2. Sastre J, Landivar ME, Ruiz-García M,
Andregnette-Rosigno MV, Mahillo I- How molecular diagnosis can change allergen-specific
immunotherapy prescription in a complex pollen area. Allergy. 2012;67(5):709-711.
3. Melioli G, Bonifazi F, Bonini S, Maggi E,
Mussap M, Passalacqua G, Rossi ER, Vacca A,
Canonica GW; Italian Board for ISAC- The ImmunoCAP ISAC molecular allergology approach in adult multi-sensitized Italian patients
with respiratory symptoms. Clin Biochem.
2011;44(12):1005-1011.
4. Melioli G, Compalati E, Bonini S, Canonica
GW- The added value of allergen microarray
technique to the management of poly-sensitized allergic patients. Curr Opin Allergy Clin
Immunol. 2012;12(4):434-439.
5. Melioli G, Passalacqua GB, Canonica GW,
Baena-Cagnani CE, Matricardi P- Componentresolved diagnosis in pediatric allergic rhinoconjunctivitis and asthma. Curr Opin Allergy
Clin Immunol. 2013;13(4):446-451.
6. Passalacqua GB, Melioli G, Bonifazi F, Bonini S, Maggi E, Senna GE, Triggiani M, Nettis E,
aggiornamenti
Bibliografia
Ferreira F- Nomenclature and structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol
2007;19:414-420.
21. Radauer C, Bublin M, Wagner S, Mari A,
Breiteneder H- Allergens are distributed into
few protein families and possess a restricted
number of biochemical functions. J Allergy
Clin Immunol 2008;121:847-852.
22. Villalta D, Conte M, Asero R, Da Re M,
Stella S, Martelli P- Isolated IgE reactivity to
native walnut vicilin-like protein (nJug r 2)
on ISAC™ microarray is due to cross-reactive
carbohydrate epitopes. Clin Chem Lab Med.
2013;26:1-5.
23. Melioli G, Marcomini L, Agazzi A, Bazurro
G, Tosca M, Rossi GA, Minale P, Rossi R, Reggiardo G, Canonica GW, Passalacqua G- The IgE
repertoire in children and adolescents resolved
at component level: a cross-sectional study.
Pediatr Allergy Immunol. 2012;23(5):433-440.
24. Douladiris N, Savvatianos S, Roumpedaki
I, Skevaki C, Mitsias D, Papadopoulos NG- A
molecular diagnostic algorithm to guide pollen immunotherapy in southern europe: towards component-resolved management of
allergic diseases. Int Arch Allergy Immunol.
2013;162(2):163-172.
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64
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
aggiornamenti
Il microarray
nella diagnosi
allergologica
Riccardo Asero
Ambulatorio di Allergologia
Clinica San Carlo, Paderno Dugnano (MI)
Diagnosis of allergic diseases by ISAC microarray.
Not Allergol 2013; vol. 31: n.2: 65-74.
introduzione
Per oltre un secolo la diagnosi di allergia si è fondata sull’impiego di estratti
allergenici per i test in vivo e in vitro.
Tali estratti hanno conosciuto un progressivo e costante miglioramento nel
tempo in termini di purificazione, sensibilità e standardizzazione, al punto
che si può certamente affermare che la
maggior parte degli estratti allergenici attuali contengono la maggior parte
delle proteine allergeniche, per lo meno
per quanto riguarda gli allergeni respiratori. Al giorno d’oggi, un test cutaneo
positivo o negativo in vitro o in vivo con
un estratto di una fonte allergenica respiratoria presenta una sensibilità e un
valore predittivo che sono frequentemente vicini al 100%. Nel campo delle
allergie alimentari la situazione è meno
brillante a causa della estrema labilità di
alcuni allergeni e del fatto che alcune
proteine allergeniche sono presenti in
quantità assai limitata nelle rispettive
fonti allergeniche con il rischio di essere
presenti in concentrazione insufficiente
nell’estratto diagnostico finale. Nono-
stante i suddetti innegabili meriti gli
estratti allergenici si portano appresso
un difetto ineliminabile: si tratta di miscele di proteine allergenicamente rilevanti e non e, ancora più importante,
ogni estratto contiene, nella maggior
parte dei casi, più di una proteina allergenica. Di conseguenza, gli estratti possono presentare una certa qual variabilità relativamente alla concentrazione
delle singole proteine allergeniche da
un lotto all’altro, e soprattutto un test
positivo in vivo o in vitro ottenuto utilizzando un estratto allergenico non ci
dice quali proteine presenti nella fonte allergenica siano responsabili della
sensibilizzazione. Questo è certamente
un problema se si considera che alcuni
allergeni sono presenti in forma omologa in numerose fonti allergeniche
riassunto
Parole chiave e sigle
• Allergeni • Cross-reattività • IgE
specifiche • Microarray • Diagnostica allergologica
Uno dei maggiori problemi legati all’impiego di estratti allergenici per la diagnosi in-vivo e invitro è legato alla presenza di reattività crociate tra molecole allergeniche filogeneticamente
conservate.
Tali cross-reattività si possono verificare tra pollini della stessa famiglia botanica e di famiglie
botaniche distinte, tra pollini e alimenti di origine vegetale, tra inalanti perenni (micofiti, acari,
epiteli), tra inalanti perenni e alimenti, e tra alimenti apparentemente non correlati tra loro. I
progressi compiuti dalla biologia molecolare hanno portato all’identificazione, sequenziamento, e sintesi in-vitro di un numero crescente di proteine allergeniche.
Attualmente l’ISAC microarray, un test immunoenzimatico basato su una moderna tecnologia
microchip, consente la determinazione in contemporanea di IgE specifiche per 112 allergeni. Il
presente articolo ha lo scopo di fornire alcune indicazioni per il corretto impiego e l’interpretazione dei risultati di tale nuovo strumento diagnostico
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
65
aggiornamenti
summary
Key words and Acronyms
• Allergens • Cross-reactivity • Specific IgE • Microarray • Allergy diagnosis
One of the major problems associated with the use of whole allergen extracts for in-vivo and
in-vitro diagnosis of allergic diseases is the high frequency of cross-reactions between allergens that are phylogenetically conserved.
Such cross-reactions may occur between pollens belonging to the same botanic family as well
as to distinct families, between pollen and plant-derived foods, between perennial airborne
allergens (molds, mites, dander), between perennial airborne allergens and foods, and between
unrelated foods. The recent advances in molecular biology have led to identify, sequence, and
synthesize an increasing number of allergen proteins.
One hundred and twelve of these are present on the current version of ISAC microarray, an
immune-enzymatic tests for specific IgE detection based on a modern microchip technology.
This review article aims to provide some suggestions for a rationale use of this instrument and
for the interpretation of its results.
distinte e sono quindi ampiamente
cross-reagenti. La reattività crociata
immunologica si associa alla presenza
di proteine filogeneticamente conservate, largamente diffuse nell’ambiente,
che presentano epitopi omologhi. Ovviamente, se il paziente è sensibilizzato
ad una singola fonte allergenica o ad un
numero limitato di fonti allergeniche i
suddetti difetti della diagnosi fondata
su estratti passano in secondo piano e
non influenzano le decisioni cliniche in
termini di precisione diagnostica e di
conseguente prescrizione di immunoterapia specifica. Per contro, se il paziente
è sensibilizzato a numerose fonti allergeniche, ad esempio, più di 4 pollini
distinti (1) la faccenda si complica non
poco, particolarmente alla luce del fatto
che i calendari pollinici di diverse fonti
allergeniche sono frequentemente sovrapponibili. E’ possibile affermare che
il maggior problema dell’allergologo
che si trova di fronte un paziente polisensibilizzato sia rappresentato dalla
possibilità di un co-riconoscimento di
allergeni cross-reagenti presenti in fonti
allergeniche distinte, e che il suo compito sia quello di identificare gli allergeni sensibilizzanti primari.
66
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
inalanti stagionali
Tra gli allergeni inalanti stagionali (Figura 1) i fenomeni di cross-reattività sono
piuttosto complessi, e si verificano a diversi livelli:
a) proteine presenti nell’ambito di singole specie polliniche.
b) proteine omologhe presenti in specie
polliniche distinte
c) i cosiddetti pan allergeni
Cross-reattività tra proteine
presenti nell’ambito di singole
specie polliniche
Queste reattività crociate semplificano
moltissimo il compito dell’allergologo
permettendo di avere a disposizione dei
marcatori di sensibilizzazione primaria ad una data famiglia pollinica. Ad
esempio, il polline di Phleum pratense
contiene tutte gli allergeni rilevanti delle centinaia di specie di graminacee, e
il polline di Artemisia vulgaris può essere utilizzato come rappresentante delle
circa 13.000 specie di piante appartenenti alla famiglia delle (Compositae)
(2). Analogamente, il polline di betulla
funge da rappresentante dei pollini della famiglia dei Fagales (tra cui troviamo
betulla, nocciolo, ontano, faggio, quercia, e carpino), il polline di Cupressus
arizonica rappresenta tutte le Cupressaceae (Cupressus spp, oltre a Cryptomeria
japonica e Thuja spp) e il polline di ulivo
rappresenta tutte le Oleaceae (comprendenti anche frassino e ligustro), e così
via.
Esistono alcune eccezioni a questa regola. Ad esempio, artemisia e ambrosia
fanno parte della famiglia delle Compositae ma presentano allergeni maggiori
distinti, ragione per cui devono essere
testate entrambe in sede diagnostica.
Analogamente, il gruppo Ambrosia
comprende specie diverse (A. artemisiifolia, A. trifida, A. maritima) ma gli
allergeni maggiori non sono completamente cross-reagenti (3), motivo per
cui il polline da utilizzare in ambito diagnostico deve essere quello della pianta
effettivamente presente sul territorio in
una determinata area geografica.
aggiornamenti
Cross-reattività tra proteine
omologhe presenti in specie
polliniche distinte
Relativamente alle possibili reattività
crociate tra specie botaniche diverse,
l’esempio meglio conosciuto è quello
della cross-reattività tra allergene maggiore del polline di betulla (Bet v 1, una
“pathogenesis-related protein” del gruppo
10) e proteine omologhe presenti in
un gran numero di alimenti di origine
vegetale, una revisione di questo argomento si può trovare in (4), ma ci sono
reattività crociate anche in altri casi. Ad
esempio, chi pratica l’allergologia clinica sa bene che nel 30% dei pazienti
sensibili al polline di graminacee i test
cutanei con il polline di olivo risultano
positivi anche in aree dove il polline di
ulivo è assente; in effetti è stata osservata reattività crociata tra gli allergeni del
gruppi 11 del polline delle graminacee e
l’allergene maggiore del polline di olivo
(5). Analogamente, i pazienti allergici
al polline di graminacee reagiscono frequentemente nei confronti del polline di
Plantago lanceolata, mentre la sensibilizzazione a quest’ultima in assenza di reattività a graminacee è eccezionale; questo
fenomeno è stato attribuito a reattività
crociata tra proteine allergeniche delle
due specie (6). La storia dell’identificazione della reattività crociata tra polline
di ambrosia e artemisia è più complessa.
Entrambe queste piante appartengono
alla famiglia botanica delle Compositae
con allergeni maggiori distinti, ma già
15 anni fa venne identificata la presenza
di allergeni cross-reagenti diversi dai pan
allergeni (7), e abbastanza recentemente
è stato osservato un certo grado di re-
Aeroallergeni stagionali
Figura 1
Allergen
Component
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
Protein
Group
nCyn d 1
Bermuda grass
Cynodon dactylon
Grass group 1
rPhl p 1
Timothy grass
Phleum pratense
Grass group 1
rPhl p 2
“
“
Grass group 2
nPhl p 4
“
“
rPhl p 5
“
“
rPhl p 6
“
“
rPhl p 7
“
“
Grass group 5
Polcalcin
rPhl p 11
“
“
rPhl p 12
“
“
Profilin
rAln g 1
Alder
Alnus glutinosa
PR-10 protein
rBet v 1
Birch
Betula verrucosa
PR-10 protein
rBet v 2
“
“
Profilin
rBet v 4
“
“
Polcalcin
rCor a 1.0101
Hazel pollen
Corylus avellana
PR-10 protein
nCry j 1
Japanese cedar
Cryptomeria japonica
nCup a 1
Cypress
Cupressus arizonica
nOle e 1
Olive
Olea europaea
nOle e 7
“
“
rOle e 9
“
“
rPla a 1
Plane tree
Platanus acerifolia
nPla a 2
“
“
rPla a 3
“
“
nAmb a 1
Ragweed
Ambrosia artemisiifolia
nArt v 1
Mugwort
Artemisia vulgaris
nArt v 3
“
“
rChe a 1
Goosefoot
Chenopodium album
rMer a 1
Annual mercury
Mercurialis annua
Profilin
rPar j 2
Wall pellitory
Parietaria judaica
Lipid transfer protein (nsLTP)
rPla l 1
Plantain (English) Plantago lanceolata
nSal k 1
Saltwort
Lipid transfer protein (nsLTP)
Lipid transfer protein (nsLTP)
Lipid transfer protein (nsLTP)
Salsola kali
Attuale pannello ISAC, 2013
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
67
aggiornamenti
Inalanti perenni
Figura 2
68
Allergen
Component
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
rAlt a 1
Alternaria
Alternaria alternata
Protein
Group
rAlt a 6
“
“
rAsp f 1
Aspergillus
Aspergillus fumigatus
Enolase
rAsp f 3
“
“
rAsp f 6
“
“
rCla h 8
Cladosporium
Cladosporium herbarum
rBlo t 5
House dust mite
Blomia tropicalis
nDer f 1
“
Dermatophagoides farinae
rDer f 2
“
“
nDer p 1
“
Dermatophagoides
pteronyssinus
rDer p 2
“
“
rDer p 10
“
“
rLep d 2
Storage mite
Lepidoglyphus destructor
rBla g 1
Cockroach
Blattella germanica
rBla g 2
“
“
rBla g 5
“
“
nBla g 7
rCan f 1
rCan f 2
nCan f 3
rCan f 5
rEqu c 1
nEqu c 3
rFel d 1
nFel d 2 Cat
rFel d 4 Cat
“
Dog
“
“
“
Horse
“
Cat
“
“
“
Canis familiaris
“
“
“
Equus caballus
“
Felis domesticus
“
“
Tropomyosin
Lipocalin
Lipocalin
Serum albumin
Arginine esterase
Lipocalin
Serum albumin
Uteroglobin
Serum albumin
Lipocalin
nMus m 1
Mouse
Mus musculus
Lipocalin
Mn superoxide
dismutase
Tropomyosin
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
attività crociata tra allergeni maggiori e
minori di entrambi i pollini. Amb a 6 e
Art v 3 sono omologhe (8), come pure
Amb a 4 e Art v 1 (9), e Amb a 1 e Art
v 6 (10).
E’ interessante notare come il co-riconoscimento Amb a 6/Art v 3 appaia
unidirezionale, dal momento che si
osserva solamente nei soggetti sensibilizzati primariamente ad ambrosia ma
non in quelli primariamente sensibili
ad artemisia (8). Relativamente al coriconoscimento Amb a 1/Art v 6, questo
sembra essere bidirezionale e rappresenta probabilmente la principale causa del
co-riconoscimento tra ambrosia e artemisa, perlomeno in Italia settentrionale
(Citterio S, et al. In preparazione).
Cross-reattività tra panallergeni
a) Polcalcine
Le polcalcine sono proteine leganti il
calcio presenti virtualmente in tutte le
specie polliniche. I pazienti sensibilizzati
a polcalcine reagiscono invariabilmente
in vivo e in vitro con tutte le specie polliniche. La polcalcina del Phleum pratense
Phl p 7 sembra quella maggiormente
cross-reattiva dell’intero gruppo (11). Le
due polcalcine attualmente disponibili a
scopo diagnostico in vitro (Phl p 7 e Bet
v 4, la polcalcina del polline di betulla)
rappresentano degli eccellenti marcatori
di sensibilizzazione a questo gruppo di
proteine nei soggetti che presentano polisensibilizzazione a pollini (12).
b) Profiline
Le profiline sopo proteine strutturali
presenti nel citoscheletro di tutte le specie vegetali, compresi pollini e alimenti
vegetali. La loro elevata omologia fa sì
aggiornamenti
che il paziente sensibilizzato risulti positivo nei confronti della maggior parte degli estratti pollinici (13,14) con la
possibile eccezione di parietaria e cipresso che sembrano presentare un minore
grado di omologia (15,16). Attualmente
sono disponibili in commercio quattro
profiline per la diagnostica in-vitro di allergia mediante ISAC microarray: Phl p
12 (la profilina del Phleum), Bet v 2 (da
betulla), Mer a 1 (da Mercurialis annua),
e Hev b 8 (dal latice di gomma naturale, Hevea brasiliensis). Le prime due sono
disponibili per la diagnosi in vitro singleplex mediante ImmunoCAP. E’ inoltre
in commercio un estratto di polline di
palma da dattero arricchito in profilina
(50 µg/ml di proteina) per uso in vivo
che ha dato eccellenti risultati in termini
di sensibilità e specificità (16).
reattività crociate
nell’ambito
degli inalanti perenni
Micofiti
Nei micofiti sono state identificate almeno 2 proteine allergeniche cross-reagenti: enolasi e manganese superossido
dismutasi. L’enzima glicolitico enolasi è
presente in molti miceti e presenta notevole cross-reattività tra Cladosporium
herbarum, Alternaria spp, Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Penicillum
citrinum, Fusarium solani e Rhodotorula
mucillaginosa (17). La manganese superossido dismutasi è stata identificata
quale allergene maggiore nell’Aspergillus
fumigatus è sembra potere cross-reagire
con enzimi omologhi presenti in diversi
procarioti ed eucarioti tra cui Saccha-
Allergeni di imenotteri, latice, Anisakis
Figura 3
Allergen
Component
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
Protein
Group
rApi m 1
Honey bee venom
Apis mellifera
Phospholipase A2
nApi m 4
“
“
Melittin
rPol d 5
Paper wasp venom
Polistes dominulus
Venom, Antigen 5
rVes v 5
Common wasp
venom
Vespula vulgaris
Venom, Antigen 5
rAni s 1
Anisakis
Anisakis simplex
rAni s 3
“
“
rHev b 1
Latex
Hevea brasiliensis
rHev b 3
“
“
rHev b 5
“
“
rHev b 6.01
“
“
rHev b 8
“
“
nMUXF3
Sugar epitope from
bromelain
Tropomyosin
Profilin
CCD-marker
romyces cerevisiae, latice di gomma naturale e persino l’uomo (4). Ovviamente i
pazienti allergici ai micofiti sensibilizzati
all’enolasi risulteranno positivi in vivo e
in vitro con tutti i micofiti che si testano
di routine.
Fortunatamente, anche nel caso dei
micofiti disponiamo di marcatori di
sensibilizzazione genuine come Alt a 1
per l’Alternaria, Asp f 1 per l’Aspergillus, e Cla h 8 per il Cladosporium che
ci permetteranno di porre una diagnosi
corretta e di prescrivere il trattamento
immunoterapico giusto per quel determinato paziente. Disponiamo anche di
un marker di sensibilizzazione all’enola-
si, Alt a 6 di Alternaria, che ci consentirà
di dare una spiegazione alla polisensibilizzazione del paziente (Figura 2).
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
69
Acari
Gli acari contengono diversi allergeni
cross-reagenti. Gli allergeni del gruppo
1, le cistein-proteasi Der p 1 e Der f 1
elicitano la sintesi di IgE sia specie specifiche che cross-reattive (con esclusione dell’allergene maggiore della Blomia
tropicalis, Blo t 1), mentre gli allergeni
del gruppo 2 Der p 2 e Der f 2 cross-reagiscono con l’allergene di gruppo dell’
Euroglyphus maynei. La tropomiosina
degli acari (Der p 10 e Der f 10) è un
aggiornamenti
Allergeni alimentari di origine animale
Figura 4
Allergen
Component
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
Protein
Group
nGal d 1
Egg white
Gallus domesticus
Ovomucoid
nGal d 2
“
“
Ovalbumin
nGal d 3
“
“
Conalbumin/
nGal d 5
Egg yolk/chicken
“
Livetin/Serum
nBos d 4
Cow’s milk
Bos domesticus
Alpha-lactalbumin
nBos d 5
Cow’s milk
“
Beta-lactoglobulin
nBos d 6
Cow’s milk and meat “
Ovotransferrin
meat
albumin
Serum albumin
nBos d 8
Cow’s milk
“
Casein
nBos d
Cow’s milk
“
Transferrin
Cod
Gadus callarias
Parvalbumin
lactoferrin
rGad c 1
nPen m 1
Shrimp
Penaeus monodon
Tropomyosin
nPen m 2
“
“
Arginine kinase
nPen m 4
“
“
Sarcoplasmic
Ca-binding protein
panallergene degli invertebrati altamente conservato dal punto di vista filogenetico che cross-reagisce tra crostacei,
molluschi, cefalopodi, vermi (es. Anisakis), e insetti (es. scarafaggio) (Figura 2).
Animali
Le albumine sieriche dei mammiferi
(Fel d 2 per il gatto, Can f 3 per il cane,
Equ c 3 per il cavallo, ma anche di bovini, suini, e roditori) sono largamente
cross-reagenti (18-20), tanto è vero che
pazienti sensibilizzati a questi allergeni
possono risultare positivi in-vivo e in-
70
vitro ad un certo numero di mammiferi
(21).
Anche le lipocaline, allergeni cutanei,
salivari e urinari, presenti nei mammiferi, nonostante un livello di omologia di
sequenza ridotto, possono talora crossreagire (22) (Figura 2).
cross-reattività
tra alimenti
Le reattività crociate interessano ovviamente anche gli allergeni alimentari. Per
quanto riguarda gli alimenti di origine
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
vegetale, studi in silico e in vitro hanno
dimostrato che a fronte di un numero
enorme di potenziali allergeni la sensibilizzazione avviene nei confronti di
un numero assai limitato di famiglie
allergeniche nell’ambito delle quali si
verificano i fenomeni di reattività crociata (23-26). Negli alimenti di origine
vegetale vi sono fondamentalmente 3
allergeni altamente cross-reagenti; profiline (29-32), PR-10 (pathogenesis-related
proteins group 10, omologhe all’allergene maggiore del polline della betulla,
Bet v 1) (28, 29, 30), e LTP (lipid transfer proteins, PR-14) (31). La maggior
parte delle reattività crociate che si verificano nell’ambito delle altre famiglie
sono abbastanza incostanti e da valutarsi
di volta in volta. Da segnalare le reazioni
crociate tra allergeni del latice di gomma naturale e alimenti vegetali.
Relativamente agli alimenti di origine
animale, le principali reattività crociate
si verificano tipicamente tra pesci vertebrati, per co-riconoscimento dell’allergene maggiore parvalbumina (Gal d
1 nel caso del merluzzo), tra molluschi,
cefalopodi e crostacei per sensibilizzazione alla citata tropo miosina, tra uova
di specie diverse di uccelli e latte bovino
e caprino (Figura 4, 5).
l’isac
(immuno solid phase
allergen chip)
microarray
L’ultima versione di questo strumento
diagnostico della Thermo-Fisher/Phadia, basato su una moderna tecnologia
microchip e rappresentato da una piat-
aggiornamenti
taforma immunoenzimatica miniaturizzata che consente la determinazione
in contemporanea di IgE specifiche per
multiple proteine allergeniche ricombinanti (per la gran parte) e naturali
prevede 112 allergeni. E’ verosimile che
con il tempo si assista ad ulteriori aggiornamenti e modifiche fondati sulle
più recenti scoperte in campo allergoimmunologico. Gli allergeni attualmente disponibili nel test diagnostico,
unitamente alla fonte allergenica da cui
derivano e al significato biologico sono
illustrati nelle figure 1-5.
come si usa
correttamente
il microarray
Tenuto conto dei costi non indifferenti di una singola determinazione ISAC,
che a seconda delle situazioni territoriali
possono gravare sulle tasche del paziente
o sulle finanze regionali, la prescrizione
di un test simile deve fare seguito ad un
procedimento diagnostico estremamente ordinato. Sarebbe uno spreco intollerabile richiedere un’analisi del genere
in un soggetto che alle indagini in-vivo
di routine risulti monosensibilizzato
ad una singola fonte allergenica, anche
quando tale fonte allergenica comprende numerosi allergeni (come nel caso
delle graminacee), in quanto la “taylored immunotherapy” non esiste ancora
(e probabilmente non esisterà mai dati
i costi di registrazione dei singoli allergeni per uso terapeutico) e l’immunoterapia viene effettuata attraverso estratti
in cui (si spera) sono rappresentati tutti
gli allergeni. In un soggetto atopico la
Allergeni alimentari di origine vegetale
Figura 5
Allergen
Component
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
Protein
Group
rAna o 2
Cashew nut Anacardium
occidentale
rBer e 1
Brazil nut
rCor a 1.0401
Hazelnut
Corylus avellana
PR-10 protein
rCor a 8
“
“
Lipid transfer protein (nsLTP)
nCor a 9
“
“
Storage protein,
11S globulin
nJug r 1
Walnut
Juglans regia
Storage protein,
2S albumin
nJug r 2
Walnut
Juglans regia
Storage protein,
7S globulin
nJug r 3
Walnut
Juglans regia
Lipid transfer protein (nsLTP)
nSes i 1
Sesame seed Sesamum indicum
Storage protein, 2S albumin
rAra h 1
Peanut
Arachis hypogaea
Storage protein ,7S globulin
Storage protein,
11S globulin
Bertholletia
excelsa
Storage protein,
2S albumin
rAra h 2
“
“
Storage protein, Conglutin
rAra h 3
“
“
Storage protein, 11S globulin
nAra h 6
“
“
Storage protein, Conglutin
rAra h 8
“
“
PR-10 protein
rAra h 9
“
“
Lipid transfer protein (nsLTP)
rGly m 4
Soybean
Glycine max
PR-10 protein
nGly m 5
“
“
Storage protein,
Beta-conglycinin
nGly m 6
“
“
Storage protein, Glycinin
nFag e 2
Buckwheat
Fagopyrum
esculentum
Storage protein, 2S albumin
rTri a 14
Wheat
Triticum aestivum
Lipid transfer protein (nsLTP)
rTri a 19.0101
“
“
Omega-5 gliadin
nTri a aA_TI
“
“
La figura prosegue a pag. 72
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
71
aggiornamenti
Figura 5
Allergen
Component
Allergeni alimentari di origine vegetale
Allergen
Source
Common
Name Latin
Name
Protein
Group
nAct d 1
Kiwi
Actinidia deliciosa
nAct d 2
“
“
nAct d 5
“
“
rAct d 8
“
“
PR-10 protein
Thaumatine-like protein
rApi g 1
Celery
Apium graveolens
PR-10 protein
rMal d 1
Apple
Malus domestica
PR-10 protein
rPru p 1
Peach
Prunus persica
PR-10 protein
rPru p 3
“
“
Lipid transfer protein (nsLTP)
determinazione delle IgE specifiche nei
confronti di un numero così imponente
di molecole allergeniche può dare luogo
ad una messe di risultati positivi di difficile interpretazione e spesso di dubbia
rilevanza clinica. E’ essenziale pertanto
interpretare i risultati partendo dalla
valutazione clinica del paziente, ovvero
sapendo che cosa cercare.
Nel paziente polisensibilizzato ai pollini
le prime due cose da fare sono:
a) Identificare i sensibilizzanti primari. Ovvero, rispondere alla domanda:
“nei confronti di quali fonti allergiche
è realmente sensibilizzato il paziente?”
A tale scopo si valuterà se il siero del
paziente reagisce nei confronti dei cosiddetti “markers di sensibilizzazione
primaria a pollini”: Phl p 1 e Phl p 5
per le graminacee, Art v 1 e Amb 1, rispettivamente per artemisia e ambrosia,
Par j 2 per la parietaria, Bet v 1 per le
Betulaceae, Cup a 1 per il cipresso, Ole
e 1 per l’olivo, Sal k 1 per la Salsola kali,
Pla a 1 per il platano.
b) Verificare se vi sia sensibilizzazione
nei confronti dei panallergeni pollinici
(polcalcina e profilina).
c) Verificare se vi sia sensibilizzazione
crociata ad allergeni alimentari.
d) Verificare l’eventuale sensibilizzazione primaria ad allergeni alimentari e le
possibili reattività crociate tra proteine
della medesima famiglia presenti in alimenti distinti.
72
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
problemi e carenze
del microarray
Nonostante il numero delle molecole allergeniche sia gradualmente aumentato
rispetto alle prime versioni dell’ISAC,
la lista degli allergeni disponibili è
tutt’altro che completa. Questo vale in
particolare per gli alimenti alimentari
di origine vegetale nei quali emergono in continuazione nuove proteine in
grado di determinare sensibilizzazione
di soggetti geneticamente predisposti,
ma anche nel caso di allergeni alimentari di origine animale come i crostacei
(32). Questo significa che non è (e verosimilmente non sarà mai) possibile
fare a meno dei vecchi e cari test cutanei
con alimenti freschi (ed eventualmente
anche dei test di provocazione orale in
aperto o in cieco), unica indagine in grado di mettere in paziente in contatto con
tutte (o quasi) le proteine allergeniche.
L’ISAC immunoassay presenta tuttora
dei problemi di sensibilità intrinseci alla
sua natura di microchip basato sull’impiego di minime quantità di allergene.
Non sono rari casi di falsa negatività. In
tal senso, l’analisi singleplex (ImmunoCAP) offre una sensibilità decisamente
migliore (ovviamente purché sia disponibile l’allergene in questione).
Infine non si tratta di un esame quantitativo, contrariamente all’ImmunoCAP, per cui non è in grado di fornire
indicazioni affidabili relativamente al
follow-up delle allergie alimentare tipiche dei bambini
conclusioni
L’ISAC microarray non è un esame di
routine e non può essere prescritto dal
medico di base o da specialisti privi delle
competenze necessarie per interpretarlo;
il suo impiego è da riservarsi all’allergologo. Nel campo delle allergie respiratorie il test è da riservarsi a pazienti
particolarmente complessi a causa delle
polisensibilizzazioni in cui si cerchino indicazioni relative alla prescrizione
dell’immunoterapia specifica più corretta. Nel campo dell’allergia alimentare, la
aggiornamenti
maggiore utilità dello strumento risiede
nell’identificazione della proteina allergenica alla quale il paziente è sensibilizzato; alla luce delle caratteristiche chimico-fisiche di tale allergene sarà possibile
valutare il grado di rischio associato con
l’ingestione dell’alimento contenente la
proteina allergenica rilevante. L’impiego
corretto dell’ISAC microarray richiede
una buona conoscenza delle molecole
allergeniche e del loro significato clinico, oltre che una certa confidenza con
i fenomeni di reattività crociata; tali capacità richiedono un costante aggiornamento dello specialista.
Clin Immunol 1998;101:196-206.
8. Gadermaier G, Wopfner N, Wallner M, et al.Array-based profiling of ragweed and mugwort
pollen allergens. Allergy 2008;63:1543-1559.
9. Léonard R, Wopfner N, Pabst M, et al.- A
new allergen from ragweed (Ambrosia artemisiifolia) with homology to Art v 1 from mugwort. J
Biol Chem 2010;285(35):27192-200.
10. Jahn-Schmid B, Hauser M, Wopfner N, et
al.- Humoral and cellular cross-reactivity between Amb a 1, the major ragweed pollen allergen,
and its mugwort homolog Art v 6. J Immunol
2012;188:1559-1567.
11. Tinghino R, Twardosz A, Barletta B, et al.Molecular, structural, and immunologic relationships between different families of recombinant calcium-binding pollen allergens. J Allergy
Clin Immunol 2002;109:314-320.
12. Wopfner N, Dissertori O, Ferreira F, et al.Calcium-binding proteins and their role in allergic diseases. Allergy Clin N Am 2007;27:29-44.
13. Valenta R, Duchene M, Ebner C et al.- Profilins constitute a novel family of functional plant
pan-allergens. J Exp Med 1992;175:377–385.
14. Van Ree R, Voitenko V, van Leeuwen WA, et
al.- Profilin is a cross-reacting allergen in pollen
and vegetable food. Int Arch Allergy Immunol
1992;98:97–104.
15. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D, et al.- Parietaria profilin shows only little cross-reactivity
with birch and grass profilins. Int Arch Allergy
Immunol 2004;133:121–124.
16. Asero R, Monsalve R, Barber D- Profilin
sensitization detected in the office by skin prick
test: a study of prevalence and clinical relevance
of profilin as a plant food allergen. Clin Exp Allergy 2008;38:1033-1037.
17. Simon-Nobbe B, Probst G, Kajava AV, et
al.- IgE binding epitopes of enolases, a class of
highly conserved fungal allergens. J Allergy Clin
Immunol 2000;106:887-895.
18. Hilger C, Kohnen M, Grigioni F, et al.- Allergic cross-reactions between cat and pig serum
albumin. Study at the protein and DNA levels.
Allergy 1997;52:179-187.
19. Cabanas R, Lopez-Serrano MC, Carreira J,
et al.- Importance of albumin in cross-reactivity
among cat, dog, and horse allergens. J Investig
Allergol Clin Immunol 2000;10:71-77.
20. Goubran Botros H, Gregoire C, Rabillon J, et
al.- Cross-antigenicity of horse serum albumin
with dog and cat albumins: study of three short
peptides with significant inhibitory activity towards human IgE and IgG antibodies. Immunology 1996; 88: 340-347.
21. Liccardi G, Dente B, Restani P, et al.- Respiratory allergy induced by exclusive poly-sensitization to serum albumins of furry animals. Eur
Ann Allergy Clin Immunol 2010;42:127-130.
22. Saarelainen S, Rytkonen-Nissinen N, Rou-
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
73
Bibliografia
1. Asero R, Jimeno L, Barber D- Preliminary
results of a skin prick test–based study of the
prevalence and clinical impact of hypersensitivity to pollen panallergens (polcalcin and profilin).
J Investig Allergol Clin Immunol 2010;20:35-38.
2. Hernández C, Martín-Esteban M, Fiandor A,
et al.- Analysis of cross-reactivity between sunflower pollen and other pollens of the Compositae family. J Allergy Clin Immunol 1993;92:660667.
3. Asero R, Weber B, Mistrello G, et al.- Giant
ragweed specific immunotherapy is not effective in a proportion of patients sensitized to short
ragweed: analysis of the allergenic differences
between short and giant ragweed. J Allergy Clin
Immunol 2005;116:1036-1041.
4. Ferreira F, Hawranek T, Gruber P, et al.- Allergic cross-reactivity: from gene to the clinic.
Allergy 2004;59:243-267.
5. Van Ree R, Hoffman DR, van Dijk W, et
al.- Lol p XI, a new major grass pollen allergen,
is a member of a family of soybean trypsin inhibitor-related proteins. J Allergy Clin Immunol
1995;95:970-978.
6. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D, et al.Detection of allergens in plantain (Plantago lanceolata) pollen. Allergy 2000;55:1059-1062.
7. Hirschwehr R, Heppner C, Spitzauer S, et
al.- Identification of common allergenic structures in mugwort and ragweed pollen. J Allergy
aggiornamenti
Bibliografia
vinen J, et al.- Animal-derived lipocalin allergens
exhibit immunoglobulin E cross-reactivity. Clin
Exp Allergy 2008;38: 374-381.
23. Breiteneder H, Ebner C- Molecular and biochemical classification of plant-derived food allergens. J Allergy Clin Immunol 2000;106: 27–36.
24. Hoffmann-Sommergruber K- Plant allergens and pathogenesis-related proteins. Int
Arch Allergy Immunol 2000;122:155–166.
25. Breiteneder H, Radauer C- A classification
of plant food allergens. J Allergy Clin Immunol
2004;113:821–830.
26. Jenkins JA, Griffiths-Jones S, Shewry PR,
et al.- Structural relatedness of plant food al-
lergens with specific reference to cross-reactive
allergens: an in silico analysis. J Allergy Clin Immunol 2005;115:163-170
27. Valenta R, Duchene M, Ebner C, et al.- Profilins constitute a novel family of functional
plant pan-allergens. J Exp Med 1992;175:377385.
28. Ebner C, Hirschwehr R, Bauer L, et al.- Identification of allergens in fruits and vegetables:
IgE cross-reactivities with the important birch
pollen allergens Bet v 1 and Bet v 2 (birch profilin). J Allergy Clin Immunol 1995;95:962-969.
29. Bjorksten F, Halmepuro L, Hannuksela MExtraction and properties of apple allergens.
N
TRAILER
OTIZIARIO
ALLERGOLOGIC
La storia della rapamicina,
la molecola che potrebbe
allungare la durata
della nostra vita
e contrastare l’invecchiamento.
Nel prossimo numero
del Not Allergol.
74
Allergy 1980;35:671-677.
30. Rudeschko O, Fahlbusch B, Henzgen M, et
al.- Investigation of the stability of apple allergen extracts. Allergy 1995;50:575-579.
31. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D, et al.Lipid transfer protein: a pan-allergen in plantderived foods that is highly resistant to pepsin digestion. Int Arch Allergy Immunol 2000;
122:20-32.
32. Asero R, Mistrello G, Amato S, et al.- Shrimp
allergy in Italian adults: a multi center study
showing a high prevalence of sensitivity to novel
high molecular weight allergens. Int Arch Allergy
Immunol 2012;157: 3-10.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
aggiornamenti
La diagnostica
molecolare in rapporto
all’immunoterapia
specifica
Giovanni Passalacqua
Clinica di Malattie
dell’apparato Respiratorio
e Allergologia,
Università di Genova
Component resolved diagnosis:
implications for specific immunotherapy
Not Allergol 2013; vol. 31: n.2: 75-80.
aspetti generali
L’immunoterapia
allergene-specifica
(SIT), come ben noto, presuppone la
somministrazione di dosi progressivamente crescenti di allergene (estratto
allergenico) fino ad un dosaggio (massimo tollerato o di mantenimento),
che viene poi somministrato per 3-5
anni (1). Questo per quanto riguarda la modalità standard di somministrazione, ossia quella sottocutanea
(SCIT). L’immunoterapia sublinguale
(SLIT), ha rappresentato un importante avanzamento nel campo della
SIT, in particolare: miglior profilo di
sicurezza; autogestione a domicilio e
possibilità di evitare la fase di graduale
incremento del dosaggio (2). Comunque sia somministrata, la SIT induce
profondi cambiamenti immunologici,
nella risposta del Sistema Immunitario all’allergene (3). Tali cambiamenti
sono persistenti nel tempo e rendono
ragione degli effetti “addizionali”,come
la lunga durata dell’effetto clinico e la
prevenzione dello sviluppo di asma nel
paziente rinitico (4).
Il paradigma tuttora in vigore è che la
SIT eserciti la sua azione (riduzione dei
sintomi e del consumo di farmaci, azione preventiva) in maniera strettamente
allergene-specifica. Ossia, che la sua
azione immunomodulante si svolga per
il solo (o pochi) allergene responsabile
dei sintomi clinici (rinocongiuntivite
e/o asma). Il sostanziale aumento dei
pazienti “polisensibili”, evidenziati con
la diagnostica standard, rende talvolta
difficile l’individuazione dell’allergene
realmente responsabile dei sintomi e per
cui sarebbe indicata la vaccinazione con
ITS. La diagnostica molecolare (indiriassunto
Parole chiave e sigle
• diagnostica
• skin
molecolare • ITS-immunoterapia allergene-specifica • polisensibile
prick test • diagnosi
Le IgE responsabili dell’allergia sono specifiche non per una generica sorgente allergenica,
ma per singole proteine (componenti) in essa contenute. Le IgE verso alcune di tali proteine
sono espressione di sensibilizzazione genuina, mentre altre (dirette verso proteine conservate
in specie diverse) sono espressione di cross-reattività. L’immunoterapia è per definizione un
trattamento “specifico” per l’allergene sensibilizzante e quindi una corretta diagnosi eziologica
è alla base del suo successo. Nel paziente risultato polisensibile ai test diagnostici standard,
e nel quale la valutazione clinica non sia di aiuto, la diagnostica molecolare consente di discriminare le vere sensibilizzazioni dalle positività causate dalle cross-reattività. Il problema
del polisensibile si estende all’utilizzo delle miscele di allergeni, all’efficacia clinica dell’ITS nel
polisensibilizzato, ed al possibile impiego di una terapia desensibilizzante personalizzata in
base al profilo IgE.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
75
aggiornamenti
summary
Key words and Acronyms
• molecular allergy • component-resolved diagnosis • allergen specific immunotherapy
• polysensitized • skin prick test • diagnosis
Specific IgE, which are responsible for allergic symptoms, are directed towards the epitopes
of single proteins (allergenic components) contained in the allergenic source. Some of the
components are proper of a given allergenic source (genuine sensitization), others are shared
by different species (cross-reacting allergens and pan-allergens). Allergen immunotherapy
is, by definition, specific for the immune response to an allergen, thus a detailed aetiological
diagnosis is mandatory for a successful treatment. In a fraction of polysensitized patients, in
whom the standard diagnostics and the clinical history are of no help, molecular diagnosis can
help to discriminate between genuine sensitizers and cross-reactions, making the prescription
of immunotherapy more accurate. The aspect of molecule-based diagnosis implies also other
clinical problems, such as the efficacy of immunotherapy in polysensitized patients, the use
of allergen mixtures and the theoretical possibility of a “tailored immunotherapy”, which are
matter of the current research.
viduazione delle IgE specifiche contro
singole componenti allergeniche), ci
consente ora di individuare quali positività ai test standard indichino una sensibilizzazione “genuina” e quali siano
l’espressione di risposta (cross-reattività) a pan-allergeni presenti largamente
conservati in diverse specie animali/
vegetali ed IgE-reattivi. L’individuazione della reale sensibilizzazione rimane il target di fondo della diagnostica
molecolare, al fine di prescrivere la più
adeguata SIT. Tuttavia questo solleva
comunque anche i problemi dell’efficacia dell’ITS nei polisensibili, l’uso di
estratti allergenici miscelati (contenenti
più allergeni), e la possibilità di preparare per ogni paziente una ITS costituita dai soli allergeni per i quali il paziente presenta IgE specifiche (tailored
immunotherapy). Per tutti questi motivi
la diagnostica molecolare, specialmente
nel suo aspetto multiplex (microarray)
ha assunto un ruolo clinico sempre più
preponderante in relazione all’ITS.
76
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
la diagnostica
molecolare
Nel linguaggio corrente utilizziamo
l’espressione di allergia ad una determinata sorgente allergenica (es. acari, graminacee, latte), tuttavia, la risposta IgE
non è diretta a tutta la sorgente allergenica, ma solo a determinate proteine
in essa contenute (componenti allergeniche). Pertanto, nel caso dell’allergia
ad acari della polvere, le IgE specifiche
saranno dirette contro le proteine Der
p 1-2 e Der f 1-2, mentre nel caso di
allergia alla betulla le IgE saranno dirette contro Bet v 1. Alcune di queste
proteine (la cui nomenclatura standard
utilizza le prime tre lettere del genere, la prima lettera della specie ed un
numero progressivo) sono specifiche
della sorgente allergenica e la presenza di IgE dirette contro di esse indica
sensibilizzazione genuina. Altre proteine sono invece presenti, in forma praticamente immutata, in specie diverse
(allergeni cross-reattivi e panallergeni)
e talvolta anche in organismi filogeneticamente distanti (5). Ad esempio, la
tropomiosina è un componente allergenico dell’acaro della polvere (Der p
10), ma anche del gamberetto (Pen a
1), mentre la PR-10 della betulla (Bet
v 1) è presente anche nella mela (Mal d
1). Altri panallergeni sono le profilline,
le polcalcine e le lipid transfer proteins
(Tabella 1).
I test diagnostici standard (skin test e
CAP-RAST) utilizzano come substrato estratti “interi” della sorgente allergenica che quindi contengono tutte le
componenti (genuine e cross reattive).
Pertanto tali test non consentono di
discriminare la presenza di IgE verso
ciascuna delle componenti. La diagnostica molecolare utilizza invece come
substrato le singole componenti allergeniche (ricombinanti o altamente
purificate) e consente quindi di rivelare
la presenza di IgE dirette verso ciascuna proteina allergenica. La diagnostica
molecolare può essere singleplex (un
test per ogni molecola) o multiplex (un
test per numerose molecole assieme). In
quest’ultimo caso la tecnica corrente è
quella del microarray (ISAC, THER-
aggiornamenti
MOFISHER)(6), che su un singolo microchip consente di testare (con meno
di 1 ml di sangue) la presenza di IgE
specifiche verso 112 diverse componenti appartenenti a numerose sorgenti allergeniche sia inalatorie che alimentari.
prescrizione dell’its
nel polisensibile
e ruolo
della diagnostica
molecolare
Nella pratica clinica corrente, la maggioranza dei pazienti risulta polisensibilizzata (7) e si pone quindi il problema di identificare quale o quali
allergeni siano i principali responsabili
della sintomatologia e quindi per quali
prescrivere l’ITS. Questo è particolarmente vero nell’ambito europeo dove,
a differenza degli Stati Uniti, si tende
a prescrivere ITS solo per 1-3 allergeni
(8). Infatti, negli Stati Uniti si preparano miscele estemporanee di tutti gli
allergeni (fino a 8-10) per il quale un
paziente risulta positivo, che vengono
poi somministrate in un’unica o due
iniezioni.
Nella maggioranza dei casi, i risultati
dei test standard (skin test e CAP), insieme alla distribuzione temporale dei
sintomi ed alla conoscenza del calendario pollinico, consentono di individuare con buona sicurezza quali siano
le sorgenti allergeniche maggiormente
responsabili dei sintomi. In Italia ciò è
facilitato dal fatto che le specie polliniche sono relativamente poche ed hanno
stagioni di pollinazione generalmente
poco sovrapposte (Figura 1). Tuttavia,
a causa delle variazioni climatiche, della zona geografica e della compresenza
di sensibilizzazione ad allergeni quasi
Esempi di sensibilizzanti “genuini”
e cross-reattivi delle maggiori sorgenti allergeniche
Tabella 1
Sorgente
allergenica
Sensibilizzanti
genuini
Sensibilizzanti
Cross-reattivi
Natura dei
cross-reattivi
Acari
Der p 1, Der p 2
Der f 1, Der f2
Der p10
tropomiosina
Graminacee
Phl p 5, Phl p 6,
Phl p 1
Phl p 7, Phl
p12
CBP, profillina
Betulla
Bet v 1, Bet v 6
Bet v 2, Bet v 4
Profillina, CBP
Olivo
Ole e 1
Ole e 2
Profillina
Paritaria
Par j 1
Par j 2
LPT
Gatto
Fel d 1
Fel d 2, Fel d 4
Albumina, lipocalina
Artemisia
Art v 1
Art v 3
LPT
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
perenni, talvolta risulta difficile effettuare una diagnosi eziologica accurata, specialmente se le positività ai test
cutanei sono molteplici. In questi casi
selezionati, la diagnostica molecolare
rappresenta un valido aiuto, in quanto consente di discriminare la presenza
di IgE verso sensibilizzanti genuini da
quelle verso pan allergeni.
Infatti, può accadere che la positività di
alcuni test non sia dovuta a reale sensibilizzazione, ma alla presenza di IgE che
cross-reagiscono con molecole presenti
contemporaneamente in estratti di
specie diverse (9, 10). Ad esempio, un
paziente sensibilizzato alle graminacee
potrà risultare positivo anche all’estratto di betulla, perché le sue IgE contro
Phl p 7 reagiranno anche con il Bet v
2. Tali molecole sono infatti profilline
e pertanto contenute in forma quasi
invariata sia nell’estratto di graminacee
che in quello di betulla. In un simile
caso, si potrà discriminare la vera sensibilizzazione ricercando le IgE contro
Phl p 1 e Phl p 5 (sensibilizzanti genuini delle graminacee) e le IgE contro
Bet v 1 (sensibilizzante genuino della
betulla). L’assenza di IgE contro Bet v
1, farà escludere la sensibilizzazione a
betulla e indicherà che il test alla betulla positivo è dovuto a cross-reazione.
Un altro esempio è quello di uno skin
test positivo per acari: se sono presenti
le IgE specifiche verso Der p 1 o Der p
2 (Der f 1 o Der f 2) allora il paziente
è realmente sensibilizzato, mentre se le
IgE sono verso Der p 10 (tropomiosina,
panallergene), allora si tratta di cross reazione e l’ITS per acari non dovrebbe
quindi essere prescritta (Tabella 2).
77
aggiornamenti
Der p 1
-
implicazioni
della diagnostica
molecolare
applicata all’its
Possibili profili di sensibilizzazione
ad acari e indicazione all’ITS
Tabella 2
Der f 1
Der p 2
Der f 2
Der p 10
ITS?
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SI
-
+
-
+
-
SI
-
-
-
+
NO
La sperimentazione clinica ha dimostrato che la diagnostica molecolare
nella prescrizione di ITS in polisensibili
rivela una discrepanza (o inaccuratezza)
SI
SI
prescrittiva rispetto allo skin test che
può raggiungere il 30% dei pazienti in
cui è stata utilizzata solo la diagnostica
standard (11).
L’avvento della diagnostica molecolare
ha portato l’attenzione su alcuni problemi, peraltro già noti da tempo. Un
problema è quello dell’efficacia delle
miscele di allergeni, così come utilizzate di routine negli Stati Uniti. Ad oggi
in realtà i dati sperimentali a supporto
delle miscele di allergeni sono piuttosto
scarse e si fondano su pochissimi lavori
(12), pertanto il problema rimane sostanzialmente aperto (8).
Più dati sono oggi disponibili sull’efficacia dell’ITS con un solo allergene
nei pazienti polisensibili. La letteratura
Esempio di allergeni pollinici con stagione di pollinazione ben identificabile
Figura 1
300
270
cipresso
240
conta pollinica
210
180
betulla
150
120
90
graminacee
60
30
gen
78
feb
mar
apr
mag
giu
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
lug
olivo
aggiornamenti
sull’argomento concorda sul fatto che
l’ITS (se prescritta per l’allergene realmente responsabile dei sintomi) ha la
stessa efficacia nel monosensibile e nel
polisensibile (13-15). Pertanto, è in parte da sfatare l’affermazione contenuta in
alcune linee guida che l’ITS abbia il suo
massimo di efficacia nel paziente monosensibile (1).
Un’ultima importante implicazione della
diagnostica molecolare è la possibilità teorica di creare una immunoterapia “tailored”, ossia personalizzata per ciascun
singolo paziente. In tal caso, una volta
individuate le componenti allergeniche
alle quali il soggetto è sensibilizzato, si
potrebbe creare una ITS contenente
soltanto quelle specifiche proteine, da
utilizzare per la desensibilizzazione. A
questo proposito è però da notare che,
nonostante l’ITS con singole proteine
abbia dato discreti risultati nei trials clinici condotti utilizzando Bet v 1 o una
miscela di 5 componenti delle graminacee (16, 17), un recente studio comparativo ha mostrato che l’ITS con Bet
v 1 ricombinante non è più efficace di
quella con l’estratto tradizionale (18).
Ciò solleva anche il problema dei costi.
In aggiunta, l’EMA (European Medical
Agency) richiede che per ogni singola
molecola ricombinante venga effettuato
uno studio registrativo, e questo risulta
poco fattibile in pratica, considerando i
costi e la numerosità delle molecole da testare (19). A parte i problemi registrativi,
si deve anche considerare che i profili di
sensibilizzazione (ossia le IgE specifiche
per ciascuna proteina allergenica), comprendono una enorme varietà di combinazioni. Tripodi (20) et al, prendendo in
esame i profili di sensibilizzazione a graminacee nei bambini, hanno mostrato
che occorrono almeno 30 combinazioni
di singole molecole per coprire l’80%
dei pazienti. In questo caso parzialmente
teorico, si evidenziano gli eventuali problemi connessi ad una ITS orientata in
base alla diagnostica molecolare.
considerazioni
conclusive
La diagnostica molecolare, specialmente nella sua forma di microarray (21)
ha sicuramente rappresentato un miglioramento della tecnologia diagnostica in allergologia. Tale avanzamento
appare di particolare rilievo nel caso
dei pazienti che risultino polisensibili
ai test diagnostici standard (skin prick
test e CAP assay), per i quali l’anamnesi non è dirimente ai fini della prescrizione di ITS, che in Europa non
viene fatta con miscele di allergeni, ma
solo con pochi estratti per paziente. La
diagnostica molecolare dovrebbe essere
richiesta solo in casi particolarmente
complicati, o quando si sovrappongono sintomi respiratori ed alimentari
difficili da interpretare.
La diagnostica molecolare, sia singleplex che multiplex (ISAC), rimane un
test di terzo livello, da utilizzare solo in
quella percentuale di pazienti in cui la
diagnostica standard non fornisce riposte adeguate. Al momento la tecnologia
ISAC (multiplex) rimane avvantaggiata
anche economicamente solo se le singole molecole da testare separatamente
superano il numero di 10-12 (22).
Bibliografia
1. Bousquet J, Lockey R, Malling HJ, AlvarezCuesta E, Canonica GW et al.- Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic
diseases. World Health Organization. American
academy of Allergy, Asthma and Immunology.
Ann Allergy Asthma Immunol 1998;81:401-405.
2. Canonica GW, Bousquet J, Casale T, Lockey
RF, Baena-Cagnani CE, Pawankar R, Potter PC
et al.- Sub-lingual immunotherapy: World Allergy Organization Position Paper 2009. Allergy
2009;64:1-59.
3. Jutel M, Akdis CA- Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy.
Allergy 2011;66(6):725-732.
4. Passalacqua G, Canonica GW- Specific
immunotherapy: beyond clinical scores. Ann Allergy Asthma Immunol 2011;107(5):401-406.
5. Sastre J- Molecular diagnosis in allergy.
Clin Exp Allergy 2010;40:1442-1460.
6. Melioli G, Bonifazi F, Bonini S, Maggi
E, Mussap M, Passalacqua G et al.- The ImmunoCAP ISAC molecular allergology approach in adult multi-sensitized Italian patients
with respiratory symptoms. Clin Biochem.
2011;44(12):1005-1011.
7. Marogna M, Massolo A, Berra D, Zanon P, Chiodini E, Canonica GW, Passalacqua
G- The type of sensitizing allergen can affect
the evolution of respiratory allergy. Allergy
2006;61(10):1209-1215.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
79
aggiornamenti
Bibliografia
8. Cox , Jacobsen L- Comparison of allergen
immunotherapy practice patterns in the United
States and Europe. Ann Allergy Asthma Immunol
2009;103(6):451-459.
9. Weber RW- Cross-reactivity of pollen allergens: impact on allergen immunotherapy.
Ann Allergy Asthma Immunol 2007;99(3):203211.
10. Santos A, Van Ree R- Profilins: mimickers
of allergy or relevant allergens? Int Arch Allergy
Immunol 2011;155(3):191-204.
11. Sastre J, Landivar ME, Ruiz-García M,
Andregnette-Rosigno MV, Mahillo I- How molecular diagnosis can change allergen-specific
immunotherapy prescription in a complex pollen
area. Allergy 2012;67(5):709-711.
12. Nelson HS- Specific immunotherapy with
allergen mixes: what is the evidence? Curr Opin
Allergy Clin Immunol 2009;9(6):549-453.
13. Calderon M, Cox L, Casale TB, Moingeon P,
Demoly P- Multipleallergen and single allergen
immunotherapy. Strategies in polysensitized
patients. J Allergy Clin Immunol 2012;129:929934.
14. Ciprandi G, Cadario G, Valle G, RidoloE,
Verini M, Di Gioacchino M et al.- Sublingual immunotherapy in patients poly-sensitized: effects
on quality of life. J Invest Allergol Clin Immunol
2010;20: 24-39.
15. Lee JE, Choi GS, Kim MS, Doo Hee K, Rhee
CS et al.- Efficacy of SLIT with house dust mite
extract in poly-allergen sensitized patients with
allergic rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol
2012;13:15-18.
16. Jutel M, Jaeger L, Suck R, Meyer H, Fiebig H,
Cromwell O- Allergen-specific immunotherapy
with recombinant grass pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 2005;116(3):608-613.
17. Niederberger V, Horak F, Vrtala S, Spitzauer S, Krauth F et al.- Vaccination with genetically engineered allergens. PNAS 004;101 (supp
2):14677-14682.
18. Pauli G, Larsen TH, Rak S, Horak F, Pastorello E, Valenta R et al.- Efficacy of recombinant
birch pollen vaccine for the treatment of birchallergic rhinoconjunctivitis. J Allergy Clin Immunol 2008;122(5):951-960.
19. Cromwell O, Häfner D, Nandy A- Recombinant allergens for specific immunotherapy. J
Allergy Clin Immunol 2011;127(4):865-872.
20. Tripodi S, Frediani T, Lucarelli S, Macrì F,
Pingitore G, Di Rienzo Businco A et al.- Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for
specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol
2012;129:834-839.
21. Ferrer M, Sanz ML, Sastre J, Bartra J, del
Cuvillo A, Montoro J et al.- Molecular diagnosis in allergology: application of the microarray technique. J Investig Allergol Clin Immunol
2009;19 Suppl 1:19-24.
22. Melioli G, Compalati E, Bonini S, Canonica GW- The added value of allergen microarray
technique to the management of poly-sensitized allergic patients. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2012;12(4):434-439.
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Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
v.le Cassala 40, 20143 Milano
aggiornamenti
Il Toll-like receptor 4
N
OTIZIARIO
ALLERGOLOGIC
TRAILER
Esiste
un meccanismo
d'azione comune
tra alcol, oppio,
acaro e batterio?
N
el Trailer del numero scorso
del Notiziario Allergologico
ho voluto provocare la curiosità dei Lettori. Quale meccanismo
immunitario è coinvolto nell’allergia al
Dermatophagoides, nella dipendenza da
oppio e da alcol, nella depressione, nella
sepsi e in molte altre patologie? La risposta sta nell’attivazione del complesso
Toll-like receptor 4, specifico per il lipopolisaccaride (LPS) dei batteri gram
negativi ed altri ligandi.
L’immunità innata attraverso vari recettori di membrana ( Toll-like, NOD-like, RIG-I-like, C-type Lectin) riconosce
i profili molecolari caratteristici di batteri, virus e funghi, i famosi Pathogenassociated molecular patterns (PAMPs)
ed anche i segnali di pericolo causati da
cellule danneggiate o morte, i Damage
associated molecular pattern molecules
(DAMPs).
Il TLR4 è un recettore trans-membrana cellulare con un dominio citoplasmatico simile al recettore per IL-1, e
un grande dominio extracellulare con
leucine-rich repeat sequences (Fig.1).
Per funzionare correttamente il TLR4
Fabrizio Ottoboni
Nel prossimo numero
del Not Allergol
La spiegazione
del comune meccanismo
d'azione.
Figura 1
Struttura del TLR4
Leucine
rich repeats
(LRR)
Cell membrane
Transmembrane
domain
Toll/IL-1R (TIR) motif
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
ha bisogno di una molecola accessoria,
MD2, e di un co-recettore CD 14. Vediamo come avviene il contatto con il
LPS, come esempio classico, e come si
scatena la cascata di eventi intracellulare
che porta alla risposta proinfiammatoria
necessaria per combattere l’infezione.
Il CD-14 ha la funzione di legare e trasportare sul TLR4 il lipopolisaccaride
dei batteri già “catturato” da una LPSbinding protein. Il ligando viene successivamente sistemato nella tasca idrofobica della proteina accessoria MD-2. A
questo punto c’è un riarrangiamento dei
lipidi sulla membrana cellulare e avvie-
81
Legenda
aggiornamenti
TLR4
MD-2
CD14
TIR
TRIF
TRAM
MyD88
Irf3
NF-kB
Toll-like receptor 4
Myeloid differentiation factor
Cluster of differentiation 14
Toll/IL-1R domain
Toll-IL-1 receptor domain-containing adaptor
inducing interferon-β
TRIF-related adaptor molecules
Myeloid differentiation primary-response protein 88
interferon regulatory factor 3
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer
of activated B cells
ne la omodimerizzazione del TLR4 e la
sua completa attivazione (Fig. 2).
Il TLR4 è l’unico recettore tipo Toll che
ha due vie di segnalazione conosciute
come 1) via dipendente da MyD88 e 2)
via indipendente da MyD88 (o dipendente da TRIF). Ognuna delle due vie
coinvolge proprie proteine adattatrici,
e propri fattori di trascrizione, rispettivamente NF-kB e IRF3, che migrano
nel nucleo e permettono la trascrizione
dei geni pro-infiammatori (Fig. 3). Non
sono ancora noti i criteri di scelta di una
via o dell’altra via da parte del TLR4.
L’attivazione del recettore si conclude
con la produzione di sostanze pro-infiammatorie come i ROS ( NO, H2O2,
superossidi), citochine (TNF-α) ed interleuchine (IL-6, IL-12, IL-1, IL-1β)
che coordinano un’adeguata difesa immunitaria contro i batteri in questo caso
o la riparazione e la rimozione dei detriti
delle cellule danneggiate o morte. Dopo
aver svolto il suo compito il complesso
TLR4/LPS viene riciclato mediante un
processo di endocitosi, ubiquitilazione e
finalmente degradazione lisosomiale.
L’eccesso di infiammazione che sarebbe pericolosa viene evitata dallo stesso
TLR4, mediante la via dipendente da
TRIF che induce la sintesi di IFN-β che
è contemporaneamente anti-infiammatoria e anti-apoptotica. L’escrezione di
IFN-β coordina la produzione di addizionali interferoni di tipo 1 che ulteriormente sopprime l’immunorisposta. In
pratica c’è un meccanismo endogeno di
82
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
controllo dell’immunità innata per evitare l’eccessiva infiammazione.
Oltre al LPS i ligandi esogeni sono molteplici, come pure i ligandi endogeni
quali i segnali di pericolo delle cellule
necrotiche, le heat-shock protein 60, 70
e 90 etc. (Tab. 1).
L’attivazione del TLR4 generalmente
è utile ma in caso di attivazione non
controllata può essere pericolosa. Molti
lavori hanno mostrato il coinvolgimento di questo recettore nello shock setticemico che può essere contrastato con
antagonisti.
Un esempio classico di azione duplice
è invece sul sistema nervoso dove può
avere effetti negativi, neurodegenerazione dovuta a necrosi ed apoptosi dei neuroni, oppure effetti neuroprotettivi ad
es. nell’ictus e nell’Alzheimer dove contribuisce a ridurre le placche amiloidi.
Una scoperta eccitante è stata fatta da
poco tempo: l’inibizione del TLR4 porta all’allungamento della vita in drosofila, topi, alla stessa maniera della restrizione calorica. Io ci spero.
Attivazione del TLR4 da parte del LPS
Figura 2
Gram
LPS
LBP
CD 14
MD-2
MD-2
CD 14
CD 14
TIR
MD-2
TIR/TIR
aggiornamenti
Figura 3
Le due cascate di trasduzione del TLR4
MD-2
Figura 4
Azione dell’alcol sul sistema nervoso
Brain inflammatory
damage
MD-2
CD 14
ETHANOL
TIR/TIR
MyD88 dependent
TRIF dependent
My88
NF-kappaB
NF-kB
IFR3
IkappaB
MAPKs
AP-1
IL-Ibeta, iNOS, COX-2
IL-10, TNFalpha
DNA
Geni pro-infiammatori
Geni anti-infiammatori
Tabella 1
Esempi di
attivatori ed inibitori del TLR4
Agonisti
Antagonisti
LPS e derivati
Resveratrolo
HSP 60,70,90
Curcumina
Proteine
Eritoran (E5564)
della matrice
(analogo
extracellulare (ECM) del lipide A)
Etanolo
Taxolo
Der p 2
Naltrexone
Morfina
Naloxone
Metadone
TAK-242
Neural
and astrocytic death
Il resveratrolo attiva la via dipendente
da TRIF, cioè la produzione di IFN-β,
e tiene sotto controllo l’infiammazione.
Nell’alcolismo e nell’abuso di droghe
(oppio, morfina) l’inibizione del TLR4
con naltrexone o naloxone sembra curare efficacemente la dipendenza (Fig.4).
L’espressione e l’attività di TLR4 e anche TLR2 è incrementata nei monociti
dei pazienti con sindrome metabolica e
contribuisce al rischio di diabete di tipo
2 e di malattie cardiovascolari.
L’allergene Der p 2 si lega su MD-2,
come la curcumina, per scatenare la cascata infiammatoria del TLR4 nelle vie
aeree degli asmatici ma non nei rinitici.
L’attivazione incontrollata del TLR4 nel
sistema nervoso è stata verificata anche
nella depressione.
Infine è dimostrato il coinvolgimento
di alcuni microRNA nella regolazione
della cascata attivata da TLR4: miR126, miR-145, miR-155, miR-146a,
lethal 7a ed i let-7b, e, g, i. I microRNA
nell’allergia verranno trattati in un prossimo n° del Notiziario Allergologico.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
83
chiosa finale
Le nuove strade diagnostiche e terapeutiche aperte dai premi Nobel per la
Medicina del 1985 e 2011 sono studiate
dalle più grandi aziende farmaceutiche
del mondo. Nei prossimi due o tre anni
vedremo i risultati delle promettenti
sperimentazioni cliniche in corso.
recensioni
Unghie acriliche: un buon motivo
per non mangiar molluschi
Intractable shellfish anaphylaxis:
sensitization by cross-reactive substance
in a complementary "immune stimulant" and acrilic nails.
Rolland JM, Varese N, Zubrinich CM, O'Hehir RE
Ann Allergy Asthma Immunol 2013;110:211-212.
N
egli ultimi anni, parallelamente alla diffusione su internet
di documenti non sempre attendibili sulle proprietà salutistiche di una moltitudine di prodotti, si va sempre più affermando a livello globale un trend basato su una “regia” che punta
a promuovere l’uso di terapie complementari (integratori, immunostimolanti...) acquistabili nei cosiddetti “health food shops”
o più facilmente on- line. Ovviamente non viene tenuto mai in
considerazione dai promotori di tali prodotti ovvero dai consumatori la possibilità che questi esprimano un potenziale allergenico o possano cross-reagire con altre sostanze (per es. alimenti).
In questo lavoro gli autori descrivono un singolare caso di
anafilassi da “shellfish” osservata inizialmente in una paziente di 46 anni in seguito ad ingestione di scampi. Malgrado
l’eliminazione dei crostacei dalla dieta la paziente presentava
ricorrenti episodi di raucedine, difficoltà di respiro, orticaria
generalizzata intercalati a 20 episodi di anafilassi in un arco
di 30 mesi e che hanno richiesto numerosi ricoveri al pronto soccorso. Molti di questi episodi sembravano manifestarsi
senza una apparente causa specifica e comunque non legata
alla esposizione della paziente ai crostacei. La paziente mostrava dei livelli di triptasi nel siero non associati ai suddetti episodi, con prick positivo al gambero e IgE specifiche negative
per latex, frumento e omega 5 gliadin, escludendo quindi la
possibilità che essi fossero causati da “food-dependent exercise”.
Ad un ulteriore ricovero fu notato che la paziente aveva le
unghie dipinte con smalto acrilico e ad una indagine più approfondita si scoprì che la stessa assumeva quotidianamente
un prodotto immunostimolante. Si mise poi in luce che la
paziente aveva iniziato a smaltarsi le unghie nel 2000 prima di
interrompere questa abitudine per 8 anni e riprendere giusto
84
5 giorni prima del primo episodio di anafilassi manifestatosi
subito dopo aver assunto una “shrimp salad”. Sebbene non sia
stato possibile per gli autori capire la causa (lo smalto, il prodotto immunostimolante, o l’assunzione di “shellfish”) della
sensibilizzazione iniziale, essi sono stati in grado di evidenziare una associazione tra l’applicazione dello smalto per unghie
e il manifestarsi degli episodi di anafilassi.
Inoltre gli autori evidenziarono che il prodotto immunostimolante assunto quotidianamente dalla paziente conteneva
tra l’altro della glucosamina (da “shrimp”). Nell’intento di
individuare possibili allergeni comuni essi notarono che la
chitina, la componente che fornisce la rigidità strutturale del
carapace dei crostacei, è un biopolimero della glucosamina e
viene usata nella preparazione di numerosi prodotti, tra cui la
lacca per lo smalto delle unghie.
Per definire più precisamente la sostanza causa della sensibilizzazione allergica della paziente, sono stati preparati tre estratti, uno partendo dal gambero, l’altro dalla polvere di chitina e
il terzo dalla polvere di immunostimolante. Una serie di analisi (di cui però gli autori non mostrano i risultati) hanno dimostrato la presenza nel siero della paziente di IgE specifiche
verso tutti e tre gli estratti. Inoltre l’estratto di gambero era in
grado di inibire il binding IgE-mediato sia verso la chitina che
verso il prodotto immunostimolante; a sua volta l’immunostimolante inibiva l’IgE-binding sia verso la chitina che verso
Dead Souls - Nine Inch Nails (Joy Division) – 4:54
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
recensioni
l’estratto di gambero, confermando l’esistenza di un allergene
comune. Un siero di un paziente IgE-positivo per il gambero
ma non esposto allo smalto delle unghie o solito assumere
terapie complementari, risultava negativo nei confronti della
chitina e del prodotto immunostimolante.
In questo modo gli autori sostengono di aver dimostrato l’esistenza di una cross-reattività a sostanze “chitin-associated” a
cui il paziente in studio era clinicamente reattivo. Che la chitina potesse essere la causa del fenomeno di cross-reattività
riscontrata nella paziente è stata definitamente confermata
trattando i tre estratti con chitinasi che induce la digestione
enzimatica della chitina. Questo trattamento riduceva significativamente la IgE- reactivity del siero.
Sulla base dei risultati gli autori hanno suggerito alla paziente di evitare sia l’applicazione dello smalto sulle unghie che
l’assunzione di terapie complementari con evidente beneficio
visto che da 20 mesi la paziente non ha più avuto manifestazioni anafilattiche.
Gli autori concludono che la moda di assumere di propria
iniziativa terapie complementari facilmente reperibili on-line
potrà in futuro aumentare il rischio di allergia a sostanze ivi
presenti come effetto di un fenomeno di cross-reattività e
invitano quindi la classe medica e la comunità in generale a
vigilare sull’assunzione di queste terapie, in particolare quelle
basate sull’impiego di chitin-associated products.
GM
agenti terapeutici. Dei miR coinvolti nelle manifestazioni
allergiche spero di poterne parlare diffusamente in uno dei
prossimi numeri del Not Allergol.
In questo lavoro di straordinaria importanza gli Autori hanno
voluto verificare se i miR del latte materno potevano influenzare la maturazione del sistema immune del neonato. Allo
scopo sono stati analizzati i miR del latte materno nei primi 6
mesi di allattamento, scoprendo che tali molecole sono stabili
anche nello stomaco, in condizioni acide, del neonato e aiutano la maturazione del suo sistema immunitario.
Le conclusioni sono clamorose:
• il latte materno modula sembra ombra di dubbio lo sviluppo
del sistema immune del neonato;
I microRNA dalla mamma al figlio:
una rivoluzione genetica
MicroRNA as a new immune-regulatory
agent in breast milk
Kosaka N, Izumi H, Sekine K, Ochiya T.
Silence 2010;1:7
I
microRNA sono straordinarie micromolecole che hanno
rivoluzionato le teorie genetiche tradizionali imponendosi
come veri master della regolazione genica e dell’espressione
proteica. Sono studiati come biomarkers e soprattutto come
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
’ndove stanno i miR che mi servono?
85
recensioni
• c’è il trasferimento di materiale genetico, microRNA, tra
madre e figlio/a, rivoluzionando le teorie attuali.
Il lavoro è molto importante perché rivela per la prima volta
che il materiale genetico può essere trasmesso negli umani in
modo diverso dalla sola riproduzione sessuale.
FO
SCIT e malattie autoimmuni:
un falso problema
Association of subcutaneous allergen-specific
immunotherapy with incidence of autoimmune disease,
ischemic heart disease, and mortality.
Linneberg A, Jacobsen RK, Jespersen L, Abildstrøm SZ.
J Allergy Clin Immunol 2012;129:413-9.
L'
immunoterapia specifica con allergeni è spesso denominata ‘vaccino antiallergico’ per le note proprietà di
interagire con il sistema immunitario al fine di indurre uno
stato di tolleranza nei confronti degli allergeni responsabili
di sintomi. Nonostante l’ampio utilizzo di tale strumento terapeutico, tuttavia risulta ancora aperta la questione se esso
possa agire da trigger, o da fattore di rischio, per patologie
autoimmuni. Nell’ambito del paradigma Th1-Th2 alcune
malattie autoimmuni presentano una risposta immunitaria
prevalentemente di tipo Th1, pertanto ci si aspetterebbe che
siano meno frequenti nei soggetti allergici e vice versa. Tale
aspettativa è tradita dalle attuali evidenze disponibili che sottolineano quanto il suddetto paradigma si riduca ad essere un
punto di vista eccessivamente semplicistico dei meccanismi
immunologici e patologici coinvolti. Poiché l’immunoterapia
tende a sopprimere la risposta Th2 verso gli allergeni sarebbe
ipotizzabile un maggior rischio di malattie autoimmuni e nel
corso degli anni sono stati riportati casi di sclerosi multipla,
sclerodermia, sindrome di Sjogren, pericardite ricorrente e vasculite in corso di immunoterapia. Conseguentemente alcune
linee guida internazioni sull’immunoterapia a titolo cautelativo considerano le malattie autoimmuni come una controindicazione relativa (1).
86
Recentemente una revisione della letteratura ha evidenziato
che l’idea di fattore scatenante dell’immunoterapia è sostenuta principalmente da case reports in cui non è possibile
stabilire quanto la loro occorrenza non sia imputabile al caso
(2). La condizione più frequente riscontrata e plausibilmente
ricollegabile sembra essere la vasculite. Nell’ambito degli studi clinici randomizzati sull’immunoterapia non sono riportati casi di insorgenza di malattie autoimmuni. Uno studio
danese di farmaco-epidemiologia su registri nazionali durato
dal 1997-2006 non ha identificato un rischio maggiore (HR,
0.86; 95% CI, 0.74-0.99) rispetto al trattamento antiallergico convenzionale. Questo stesso studio ha inoltre evidenziato
che nei 18.841 soggetti tratti con immunoterapia iniettiva è
più basso il rischio di mortalità (HR, 0.71; 95% CI, 0.620.81), infarto miocardico (HR, 0.70; 95% CI, 0.52-0.93)
e cardiopatia ischemica (HR, 0.88; 95% CI, 0.73-1.05). E’
noto infatti che i meccanismi infiammatori giochino un ruolo
importante nella genesi dell’aterosclerosi e che l’attivazione
delle mast cells a livello dello placche contribuisca allo spasmo
coronarico (si rammenti la sindrome di Kounis, caratterizzata
da angina instabile o infarto miocardico a seguito di una reazione da ipersensibilità, allergica o anafilattica).
Si può concludere che il rischio di sviluppare malattie autoimmuni in corso o a seguito di immunoterapia appare molto
basso e che non esistono evidenze sostanziali di pericolosità.
E’ comunque ragionevole la raccomandazione di interrompere il trattamento desensibilizzante in caso di comparsa di
sintomi o segni suggestivi. L’ indicazione ad intraprendere la
cura nei soggetti con malattia autoimmune conclamata o forte anamnesi familiare occorre sia valutata attentamente caso
per caso, in termini di rapporto rischi e benefici.
EC
Bibliografia
1. Bousquet J, Khaltaev N, Cruz AA, et al.- Allergic rhinitis and its impact
on asthma (ARIA) 2008 update (in collaboration with the World Health
Organization, GA(2)LEN and AllerGen). Allergy 2008; 63 (Suppl 86):8–160.
2. Linneberg A, Madsenb F, Skaabya T- Allergen-specific immunotherapy and risk of autoimmune disease. Curr Opin Allergy Clin Immunol
2012;12:635–639.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
recensioni
Il segreto di
Walt Disney
Mice Infected with Low-Virulence Strains
of Toxoplasma gondii Lose Their Innate
Aversion to Cat Urine, Even after Extensive
Parasite Clearance.
Ingram WM, Goodrich LM,
Robey EA, and Eisen MB.
PlosOne 8, e75246 (2013).
P
artiamo dalla ricerca del gruppo di Ingram per raccontare una storia curiosa d’interazione positiva tra parassita e
ospite.
La Toxoplasmosi è una zoonosi a diffusione cosmopolita causata dal protozoo parassita del genere Toxoplasma. Questo genere comprende una sola specie: Toxoplasma gondii, con tre
tipi 1,2,3 a differente virulenza.
I ricercatori dell'Università di Berkeley hanno scoperto che i
topi infettati con un ceppo a bassa virulenza del Toxoplasma
gondii, un protozoo conosciuto come coccidio intestinale dei
felini, perdono la loro innata paura dei gatti, anche mesi dopo
la risoluzione dell'infezione. Grande notizia sui quotidiani di
tutto il mondo. Cominciamo col definire chi è il T. gondii?
Un protozoo parassita neurotropo che infetta mammiferi ed
uccelli in tutto il mondo e il cui ospite primario è il gatto
nel cui intestino si riproduce sessualmente, mentre gli ospiti
intermedi, dove non si riproduce, sono principalmente topi,
uccelli, maiali, bovini ed anche l’uomo (Fig. 1).
Vediamo l’interazione con un topolino. Al fine di completare
il ciclo di vita del parassita , un ospite secondario infetto deve
essere mangiato da un gatto ed il topo è perfetto. Walt Disney aveva capito questa interazione ed ha fatto la sua fortuna,
come Hanna & Barbera e molti altri.
I topi hanno un’innata paura di essere mangiati dal gatto, però
quando ospitano le cisti di alcuni ceppi, non eccessivamente
virulenti del T. gondii stranamente la perdono, come dimostrato nel lavoro di cui stiamo parlando e si fanno mangiare
facilmente. I risultati, ineccepibili scientificamente, suggeriscono che l'infezione provochi cambiamenti permanenti nel
cervello, una specie di “formattazione”. Perché?
Mettiamoci nei panni del protozoo. Non è facile ma provia-
1.
2.
1. Tratta da http://it.wikipedia.org/wiki/File:Toxoplasmosis_life_cycle_it.svg
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
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recensioni
moci. Cosa pensa? Devo sopravvivere, riprodurmi, salvare la
specie, ogni “trucco” mi è consentito per salvare il gatto che
mi permette di riprodurmi sessualmente. Cosa fare? Aiutiamo
il gatto!
La prima mossa è infettiamo il topo ma senza esagerare, e
“formattiamolo” così non riconosce più l’urina del suo nemico e diventa una facile preda e io, T. gondii, posso “tornare a
casa”. Geniale? No, naturale!
In Natura normalmente le femmine evitano i maschi infestati
con parassiti perchè non mostrano i tipici tratti fenotipici e
dimostrano così di avere meno testosterone. Questo permette
selettivamente alle femmine di evitare di esporsi ai parassiti.
Il T. gondii invece manipola la selezione sessuale del topo a
proprio vantaggio.
La seconda mossa del T. gondii è geniale: i maschi infettati
esasperano il fenotipo mascolino producono più testosterone,
e si accoppiano più facilmente… di conseguenza più progenie… più cibo per gatti… più riproduzione sessuale per T.
gondii …
Cosa dire in più? Il T. gondii è un grande parassita e nel suo
interesse tutela il gatto, suo ospite primario, a differenza di
altri parassiti che conosciamo tutti e che uccidono l’ospite per
eccessiva virulenza …
FO
Per saperne di più
1. Urquhart GM, Armour J, Duncan Jl, Dunn AM, Jennings FW- Parassitologia veterinaria. Ed. italiana a cura di Claudio Genchi. UTET
2. Dass SA, Vasudevan A, Dutta D, Soh LJ, Sapolsky RM, Vyas A- Protozoan
parasite Toxoplasma gondii manipulates mate choice in rats by enhancing
attractiveness of males. PLoS One. 2011;6(11):e27229.
3. Soh LJ, Vasudevan A, Vyas A- Infection with Toxoplasma gondii does
not elicit predator aversion in male mice nor increase their attractiveness
in terms of mate choice. Parasitol Res. 2013;112(9):3373-8.
4. Vyas A- Parasite-augmented mate choice and reduction in innate fear
in rats infected by Toxoplasma gondii. J Exp Biol. 2013;216(Pt 1):120-6.
88
Th17 e sale da cucina,
un problema sottovalutato?
Sodium chloride drives autoimmune disease
by the induction of pathogenic TH17 cells.
Kleinewietfeld M, Manzel A, Titze J, Kvakan H, Yosef N,
Linker RA, Muller DN, Hafler DA.
Nature. 2013 Mar 6. doi: 10.1038/nature11868. [Epub ahead of print]
Induction of pathogenic TH17 cells by inducible
salt-sensing kinase SGK1
Wu C, Yosef N, Thalhamer T, Zhu C, Xiao S,
Kishi Y, Regev A, Kuchroo VK
Nature 2013;496:513-517.
T cells: Salt promotes pathogenic TH17 cells
Olive Leavy
Nature Reviews Immunology, doi:10.1038/nri3432
I
n questa recensione partiamo dal commento per arrivare
ai due lavori sperimentali: il sale da cucina influenza veramente i linfociti Th17?
La differenziazione e lo sviluppo di queste cellule dipende
dall’ambiente citochinico in cui avviene e questo influenza
i fattori espressi e la risposta associata. E’ accertato che tali
cellule sono associate a diversi ruoli utili, difesa contro le infezioni, ma anche a diverse patologie nell’uomo quali malattie
infiammatorie croniche, autoimmunità (es. sclerosi multipla)
ed allergiche.
Veniamo agli esperimenti dal gruppo di Kleinewietfeld. I linfociti che producono IL17 e che si sviluppano in presenza di
IL-23 sono critici per lo sviluppo dell’encefalite sperimentale
autoimmune (EAE) dei topi, un classico modello animale
della sclerosi multipla umana in cui la IL-23-TH17 pathway
è considerata uno dei fattori di rischio genetico.
Gli Autori hanno valutato uno dei fattori che possono influenzare le cellule Th17: il comune sale da cucina NaCl.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
recensioni
Figura 1
IL-23 signalling
IL-23 IL-23
LOW SALT DIET
HIGH SALT DIET
IL-23
IL-23 R
Th 17
SGH1 expression
Th17 cell differentiation
= IL-23 Receptor
Tissue inflammation
Development of autoimmunity
S GK 1= serum glucocorticoid kinase 1
Gli esperimenti condotti in vitro con cellule di topo ed umane hanno mostrato dapprima che alte concentrazioni locali
di NaCl, pur in condizioni fisiologiche influenzano le cellule
Th17. In queste condizioni l’elevata concentrazione salina attiva la p38/MAPK pathway nelle cellule e induce la polarizzazione dei linfocito verso il fenotipo Th17.
Per verificare questa ipotesi hanno usato sia il silenziamento
genetico che l’inibizione chimica della via p38/MAPK in condizioni ipersaline.
Il risultato è stato chiaro: le Th17 generate in ambiente ipersalino e con IL-23 sono patogene, hanno un fenotipo estremamente stabile ed anche una sovrapproduzione di citochine
pro-infiammatorie GM-CSF, TNF-α e IL-2.
A questo punto mancava la prova in vivo, perciò hanno alimentato due gruppi di topi con una dieta normale ed una
ipersodica e verificato i vari sintomi dell’EAE.
Il gruppo con dieta ipersodica mostrava una patologia più
grave con infiltrazione di Th17 nel sistema nervoso e negli
organo periferici.
Questa è la prima dimostrazione in vitro ed in vivo che un
eccesso di un fattore ambientale, in questo caso il comune
NaCl, potrebbe contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni inducendo lo sviluppo di Th17 patogene.
Nel secondo articolo anch’esso pubblicato su Nature, il gruppo di Wu ha indagato il meccanismo molecolare mediante
il quale IL-23 e l’eccesso di sale sostiene la risposta Th17 ed
induce funzioni effettrici negative per l’organismo.
I linfociti Th17 vengono attivati in presenza di IL-23 che si
lega al recettore di membrana IL-23R. Il sale cosa fa? Stimola
l’iperproduzione di IL-23R e quindi la risposta a IL-23. Il
ruolo fondamentale di SGK1 (serum glucocorticoid kinase
1, una chinasi a serina/treonina) una molecola fondamentale per l'espressione della IL-23R pathway e quindi della stabilizzazione del fenotipo Th17 è stato dimostrato. L’SGK1
agisce quindi mediante inibizione del Foxo1, un repressore
dell’espressione di IL-23R. La figura illustra le due situazioni. Un nuovo target terapeutico? Forse qualche brevetto è già
stato depositato…
In attesa di una smentita che “that changes in environmental
factors (such as diet, i.e.salt) have a role in these diseases.”come
dice Olive Leavy, una vera esperta del campo, io credo sempre che l’ipotesi igienica non è l’unica spiegazione dei “mali
del mondo”, anzi, che è servita a coprire e svalutare migliaia
di studi sulle vere cause. Non bisogna dimenticare le 100.000
sostanze chimiche nuove per il sistema immunitario dell’uomo, i nuovi metodi chimici nell’agricoltura ed allevamento e
soprattutto la chimica nella preparazione dei cibi, come dimostrato da questi studi e dalla “soda caustica alimentare”
in un pane tipico tedesco nella migliore panetteria milanese.
Parleremo presto degli interferenti endocrini, di agricoltura
bio etc..
FO
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
89
recensioni
E' l'Api g5 responsabile della
“mugwort-celery-fennel-syndrome”?
Mugwort-fennel-allergy syndrome associated
with sensitization to an allergen
homologous to Api g5.
Borghesan F, Mistrello G, Amato S, Giuffrida MG,
Villalta D, Asero R.
Eur Ann Allergy Clin Immunol 2013;45:130-137.
N
umerose evidenze dimostrano che una certa percentuale
di soggetti sensibilizzati al polline di Artemisia vulgaris
possono manifestare sintomi allergici in seguito all’ingestione
di plant-derived food. This cross-reactivity sembra avere una
frequenza particolarmente significativa in Svizzera, suggerendo che un allergene minore del polline di Artemisia e alcuni
alimenti caratteristici della dieta siano coinvolti. Tra i possibili
offending food sono stati segnalati il sedano rapa, il finocchio e diverse spezie quali coriandolo, cumino, aneto, pepe e
paprika (da qui il termine “mugwort-celery-spice syndrome”).
La componente responsabile di questa sindrome non è ancora stata identificata con esattezza. Con il presente lavoro,
partendo dallo studio di alcuni casi di allergia al finocchio
in soggetti sensibili al polline di Artemisia, gli autori si sono
proposti di portare evidenze atte a individuare la possibile
componente cross-reattiva.
In particolare l’attenzione si è concentrata su un paziente (un
ragazzo di 20 anni) che ha manifestato una reazione anafilattica pochi minuti dopo aver ingerito un po’ di finocchio crudo.
Una approfondita analisi allergologica ha consentito di dimostrare una significativa reazione cutanea (mean wheal diameter
20mm) al finocchio crudo e una decisamente più moderata al
finocchio cotto. Una serie di skin prick test del commercio ha
messo una evidenza una positività verso il polline di Graminaceee e di Artemisia mentre l’indagine sierologica si è confermata positiva per Art v3 e rPru p3, ma negativa per Art v1.
Successive indagini di laboratorio con il siero del paziente
hanno dimostrato, mediante ELISA diretto, una IgE-reactivity anche verso la bromelaina (un marker di reattività verso i
90
Api g5 (una glicoproteina del sedano di 58kDa)-like la possibile causa.
Tratta da http://caliban.mpiz-koeln.mpg.de
cross-reactive carbohydrate determinants, CCD) e l’esistenza,
mediante esperimenti di ELISA-inibition , di una cross-reattività tra estratti di polline di Artemisia e finocchio. Esperimenti di immunoblotting verso l’estratto di Artemisia hanno poi
mostrato un profilo di IgE-reactivity piuttosto complesso,
con riconoscimento di diverse bande a circa 20, 30, 43, 60 e
94 kDa mentre nei confronti dell’estratto di finocchio si sono
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
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evidenziate solo due bande a circa 43 e 60kDa. Nell’intento di chiarire l’importanza della IgE-reactivity verso i CCD,
l’estratto di Artemisia è stato sottoposto ad un trattamento
con periodato prima di essere rianalizzato all’immunoblotting. Tale trattamento ha determinato la scomparsa di tutte le bande ad eccezione di quella a circa 60 kDa. Ulteriori
esperimenti di immunoblotting-inhibition usando l’estratto
di finocchio come inibitore, hanno determinato la completa
scomparsa della suddetta banda, suggerendo che tale componente può essere quella responsabile della cross-reattività tra
polline di Artemisia e finocchio.
Per un approfondimento ulteriore gli autori hanno sottoposto
le bande a circa 60 kDa di Artemisia e finocchio a sequenza aminoacidica dell’N-terminale, una volta escise dal gel. In
base poi ad un confronto con un opportuno database si è messa in evidenza, nel caso del finocchio, una elevata omologia
con l’allergene Api g5 (fosfogliceromutasi di Apium graveolens). Questo risultato è stato confermato mediante analisi
alla spettrometria di massa, digerendo con tripsina il gel contenente la banda a circa 60 kDa.
Gli autori hanno quindi concluso che la componente a circa 60 kDa, diversa dal noto allergene Art v1 dell’Artemisia,
può essere la componente cross-reattiva responsabile della
“mugwort-celery-fennel-syndrome” Il fatto che un allergene
minore del polline di Artemisia sia coinvolto in tale fenomeno
spiega la relativa incidenza nella popolazione di questa particolare pollen-food syndrome.
GM
Errata Corrige
Nell'articolo Il latte di asina
nell'allergia alle proteine
dei latte vaccino
della D.ssa Giovanna Monti
pubblicato sul Not Allergol
precedente a pagina 7,
una voce bibliografica
è stata mal interpretata.
La frase «Nel 2009 è stato
pubblicato uno studio condotto
in doppio cieco crossover sull'utilizzo del LCav in 23 bambini... »
va intesa come 23 adulti.
La redazione si scusa con l'Autrice e i Lettori per l'errore.
Lais
Lofarma
SLIT con Allergoide
Ampia biodisponibilità
in tutta sicurezza
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
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lofarma news
Premio Paolo Falagiani
Alla Dottoressa Cristina Quecchia il Premio Falagiani
Nell’ambito del congresso tenutosi a Milano nel giugno scorso e che ha
visto la partecipazione sia dell’Accademia Europea di Allergia e Immunologia Clinica (EAACI) che dell’Organizzazione Mondiale di Allergia (WAO),
il Presidente della Società Italiana di Allergologia ed Immunologia Clinica,
Prof. Luigi Fontana, ha annunciato, nel corso della cerimonia inaugurale, il
vincitore del “Premio Falagiani”.
Il suddetto premio, istituito dalla Lofarma per onorare il ricordo e l’impegno del Dott. Paolo Falagiani, (Direttore Scientifico della Lofarma prematuramente scomparso due anni fa), che ha dedicato la sua vita professionale
all’Allergologia, contribuendo in maniera significativa allo sviluppo del
vaccino anti-allergico, noto come LAIS. Tale vaccino, oggetto di un brevetto internazionale, è stato il primo vaccino formulato in compresse da
somministrare per via sublinguale ed è il risultato di una specifica procedura di modifica chimica (carbamilazione) in grado di conferire allo stesso
(allergoide) una serie di peculiarità che ancora oggi, a distanza di 20 anni,
lo rendono unico per innovazione, efficacia e sicurezza di impiego. Non
esistono altri allergoidi che possono essere somministrati per via sublinguale. L’intento di questa iniziativa, rivolto in particolare ai giovani allergologi, era dunque quello di premiare il lavoro più originale avente come
il LAIS come tema, e contribuire così ad una sua ulteriore valorizzazione.
Numerosi contributi sono stati inviati e la scelta del vincitore ha richiesto
una approfondita valutazione da parte della Commissione Giudicante di
cui facevano parte esperti riconosciuti del mondo allergologico. Alla fine
di una intensa e partecipata discussione, la Commissione ha deciso di
conferire il “premio Falagiani” al lavoro dal titolo “Correlazione tra la riduzione precoce dell’IL-4 allergene-indotta e l’efficacia a lungo termine della
terapia iposensibilizzante con LAIS per acari”. Autrice del lavoro la Dottoressa Cristina Quecchia, della Scuola di Specializzazione in Allergologia ed
Immunologia Clinica dell’Università di Brescia.
L’obiettivo dello studio era quello di identificare eventuali marcatori che
potessero considerarsi predittivi della efficacia della SLIT, in particolare del
LAIS ACARI. Lo studio, effettuato su 22 pazienti allergici agli acari, ha evidenziato, dopo sei mesi di trattamento, una riduzione della produzione di
IL-4 allergene-indotta da parte dei linfociti da sangue periferico correlata,
in modo statisticamente significativo, con il beneficio clinico valutato con
la VAS dopo 18 mesi di terapia.
Sebbene lo studio sia stato effettuato su una casistica limitata di pazienti i
quali hanno mostrato una certa variabilità individuale di risposta, e quindi
sia necessario confermare i risultati con la realizzazione di studi più ampi
e controllati, è indubbio che esso abbia apportato nuove conoscenze sulle
potenzialità del LAIS sia dal punto di vista clinico e immunologico.
Il premio è stato consegnato in occasione di una serata speciale organizzata da Lofarma, che ha visto la partecipazione di numerosi amici del
Dottor Falagiani sia italiani che provenienti da varie parti del mondo (Germania, Portogallo, Grecia, Albania, Ungheria, Messico, Corea del Sud, Federazione Russa e Argentina). Nel corso della serata gli ospiti presenti hanno
potuto ascoltare dal vivo una sintesi dei risultati dello studio da parte della
Dottoressa Quecchia.
Il premio, consistente in un assegno di 3000 euro, è stato consegnato alla
vincitrice da un ospite di eccezione, Pietro Falagiani, commosso ed orgoglioso del ricordo che il padre Paolo ha lasciato nell’ambito del mondo
allergologico.
Correlazione tra la riduzione precoce
dell’IL-4 allergene-indotta e l’efficacia
a lungo termine della terapia
iposensibilizzante con LAIS® per acari
Cristina Quecchia
Specializzazione di Allergologia ed Immunologia Clinica,
Università di Brescia
92
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
razionale
L’efficacia del trattamento iposensibilizzante specifico (ITS) viene valutata
esclusivamente con parametri clinici,
rilevabili nel medio e lungo termine;
sarebbe invece auspicabile avere un parametro più precoce, per proseguire il
trattamento solo nei pazienti responder.
lofarma news
Attualmente non sono stati individuati marker specifici predittivi di efficacia
dell’immunoterapia, tranne che per il
veleno di imenotteri, in cui sembra che
vi sia una correlazione con il dosaggio
delle IgG4; non sono state dimostrate
evidenze simili per l’immunoterapia con
gli inalanti.
Molti studi hanno dimostrato come la
risposta immunologica al trattamento
iposensibilizzante attivi precocemente
la regolazione dei linfociti T e lo shift
Th2/Th1. Questa modulazione del pattern citochinico è stata dimostrata, per
quanto riguarda l’immunoterapia sublinguale, in diversi lavori con l’allergoide monomerico carbamilato (LAIS®,
Lofarma S.p.A, Milano), che è particolarmente appropriato per la somministrazione sublinguale, grazie alle sue
specifiche caratteristiche chimiche (1,
2). Infatti la carbamilazione dell’allergene a pH alcalino con cianato di potassio, che comporta la sostituzione di
gran parte dei gruppi aminici dei residui di lisina, ne preserva la dimensione
molecolare, migliorando e potenziando
le sue capacità immunogeniche. Queste
modifiche comportano una riduzione
dell’allergenicità, tramite la drammatica
diminuzione del legame con le IgE specifiche, preservandone però l’immunogenicità, senza l’alterazione degli epitopi
T. Tali modificazioni assicurano inoltre
un suo adeguato assorbimento orale e
una resistenza alla degradazione enzimatica gastrica, che ne garantisce quindi
l’alta biodisponibilità (3).
Il dimostrato potente effetto immunogeno rende pertanto l’allergoide monomerico particolarmente adatto per
l’identificazione di marker immunologici espressivi di efficacia dell’immunoterapia.
obiettivo dello studio
In quest’ottica abbiamo voluto studiare
se le variazioni della produzione di citochine, cui si assiste durante il trattamento
immuno-specifico con l’allergoide monomerico, possano essere utili per identificare un marker di beneficio clinico.
In particolare è stata valutata la correlazione tra la precoce riduzione della produzione di IL-4 e l’aumento di IFN-γ
ed il beneficio clinico della terapia con
LAIS® a 18 mesi in pazienti affetti da
allergia respiratoria ad acari.
Correlazioni tra variazioni della VAS
dopo 18 mesi di terapia con le modifiche della produzione
di Il-4 e IFN-γ a 6 mesi.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
Figura 1
e
: modifiche
della produzione di IL-4
e
: modifiche
della produzione di IFN-γ
93
lofarma news
pazienti e metodi
Sono stati arruolati 22 pazienti adulti
(con età compresa tra 20 e 45 anni, 14
uomini e 8 donne) con allergia respiratoria ad acari, i cui sintomi e la positività dei
test cutanei e sierologici giustificavano la
prescrizione di immunoterapia specifica,
secondo le linee guida GINA/ARIA.
A tutti i pazienti è stato prescritto il trattamento con LAIS® acari, con protocollo rush senza la fase d’induzione, partendo direttamente dalla dose di 1000 AU
in compresse, assunte 3 volte la settimana. In tutti è stata valutata anche la compliance per la terapia prescritta.
I pazienti sono stati sottoposti a controllo clinico ogni 6 mesi ed in occasione di
tali visite hanno espresso un giudizio sul
beneficio clinico del trattamento (rispetto alla variazione della condizione clinica
di base) tramite valutazione VAS, dove
0 era il valore peggiore e 10 il migliore,
considerando 5 come valore di stabilità o
non modifica dei sintomi.
Il dosaggio delle interleuchine è stato
eseguito prima della terapia (T0) e dopo
6 mesi di trattamento (T1).
Per la determinazione della produzione
di interleuchine allergene-indotte dai
linfociti periferici sono state prelevate
cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dei singoli pazienti e coltivate (2,0 x 105 cellule/pozzetto) per 72
ore a 37°C in presenza di 5 pg/ ml Der
p1, in condizioni di base; simili esperimenti sono stati effettuati anche in 5
pazienti sani come controllo.
Le concentrazioni di citochine nei surnatanti sono state determinate tramite
ELISA (Pierce, Rockford, IL, USA) con
94
un sandwich anti-citochine. Sono state misurate le concentrazioni di IL-1β,
IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α e IFN-γ. La
sensibilità di ELISA era 12,5 pg/ml di
IL-1β, 3,1 pg/ml di IL-4, 6,3 pg/ml di
IL-5, 21,9 pg/ml di IL-6, 12,5 pg/ml per
il TNF-α, e 31,3 pg/ml di IFN-γ.
L’analisi statistica è stata eseguita sui valori normalizzati ottenuti sottraendo il
rilascio spontaneo da quello stimolato
dall’allergene. L’analisi statistica dei dati
è stata eseguita mediante valutazione
della correlazione di Spearman, confrontando i valori di VAS con le variazioni
percentuali di IL-4 e IFN-γ, effettuando
anche una regressione per valutare la dipendenza tra le variabili.
risultati
Tutti i pazienti hanno concluso il periodo di terapia, in assenza di effetti
collaterali. Il beneficio clinico, valutato
dopo 18 mesi di terapia tramite la compilazione della VAS, è stato il seguente:
17 pazienti su 22 hanno riportato un
miglioramento dei sintomi iniziali con
una VAS ≥ 5, 1 paziente aveva un valore
di VAS pari a 5, denotando una stabilità
rispetto ai sintomi iniziali, mentre 4 avevano una VAS inferiore a 5, riportando
un peggioramento dei sintomi.
Prima dell’inizio della terapia si osservava una produzione di IL-4 allergeneindotta significativamente superiore a
quella dei soggetti sani, mentre nessuna
differenza veniva rilevata nella secrezione
dell’IFN- γ.
Dopo 6 mesi di trattamento la produzione di IL-4 allergene-indotta era significativamente ridotta (-35,6% ±24,35)
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
rispetto ai valori di base, mentre si osservava un incremento dell’IFN-γ pari a
28,1% ± 29,86.
La Figura1 mostra la correlazione tra
VAS, determinata a 18 mesi e le variazioni percentuali di IL-4, prima della terapia
(T0) e dopo 6 mesi di terapia (T1). La
correlazione risultante è statisticamente
significativa (ρ= 0,001; Spearman’s rho
test). Non è invece significativa la correlazione tra IFN-γ e VAS (Spearman’s rho
test, R Sq linear=2,74E-4).
L’analisi della regressione ha mostrato
che alla variazione di un’unità di VAS la
percentuale di IL-4 si riduce in modo significativo (p<0,001) di un valore pari a
-8,8%. Pertanto una riduzione dell’IL-4
superiore al 45% è significativamente
correlata ad una VAS superiore a 6.
conclusioni
Lo studio conferma i dati di letteratura sul
beneficio clinico, la sicurezza e l’efficienza
del trattamento delle allergopatie respiratorie con allergoide monomerico. Infatti, il
77,27% dei pazienti ha avuto un notevole
miglioramento dei sintomi senza effetti
collaterali ed una compliance del 100%,
dovuta sia ai frequenti controlli clinici che
alla facilità di assunzione del farmaco.
Peculiarità del lavoro è il rilievo che
l’immunoterapia specifica con allergoide monomerico induce a 6 mesi
significative modificazioni dell’assetto
immunologico in senso Th1, con riduzione dell’IL-4 e tendenza all’aumento
dell’IFN-γ. L’immunoterapia attiva precocemente la regolazione dei linfociti T
e lo shift Th2/Th1, modulando di conseguenza lo specifico pattern citochinico.
lofarma news
Tali modifiche non sono però evidenti nelle
fasi iniziali, quando prevale un incremento
dell’IL-10, che sottintende un aumento
della soppressione immune da parte di
cellule T regolatorie, come già dimostrato
con l’allergoide monomerico (4). Nelle fasi
successive si assiste, parallelamente alla riduzione dell’IL-4, ad una progressiva riduzione di IL-10 con incremento dell’IFN-γ,
che raggiunge la piena significatività dopo
circa un anno di terapia (5).
E’ stato recentemente dimostrato che
il passaggio dalla produzione di IL-10
a quella di IFN-γ possa coinvolgere le
stesse sottopopolazioni linfocitarie che,
in fasi intermedie, producono ambedue
le citochine (6). Questo conferma come
l’immunoterapia specifica sublinguale
agisca sia con meccanismi di immunoregolazione, che di immunodeviazione,
anche se non è ancora perfettamente
chiarita la correlazione tra le modifiche
osservate in vitro ed il beneficio clinico.
E’ noto che solo una parte di pazienti,
anche se maggioritaria, beneficia del trattamento immunoterapico, mentre una
quota non presenta modificazioni della
condizione clinica o addirittura lamenta
un peggioramento. Per tale motivo sarebbe auspicabile identificare un parametro
predittivo precoce che possa discriminare
i non responder dai futuri responder, a cui
dovrebbe essere riservata la prosecuzione
del trattamento. Un recente studio (7)
mostra come la riduzione di IL-4 sierica
rilevata a 6 mesi possa essere utile a tale
scopo, in quanto il trend di riduzione di
tale citochina ha una correlazione di tipo
predittivo con il beneficio clinico con il
90% di efficienza.
Il nostro studio conferma come la riduzione dell’IL-4 sia il parametro che, in
una fase precoce, è più correlato con il
beneficio clinico dall’immunoterapia,
mentre le variazioni dell’IFN-γ, anche
se precocemente rilevabili, non risultano
correlate con l’esito positivo dell’ITS.
La peculiarità del nostro studio sta nel
fatto che la produzione di IL-4 da noi
valutata è indotta specificamente in seguito alla stimolazione con l’allergene
sensibilizzante e quindi è meno soggetta
alle variazioni legate allo stato di salute del
paziente. Al momento lo studio in vitro
della produzione di IL-4 allergene-indotta può essere eseguito solamente in centri
di Allergologia altamente specializzati con
costi notevoli; sarà quindi utile valutare il
rapporto costo-beneficio per il Sistema
Sanitario e per il singolo paziente.
stric administration induces local and systemic
tolerogenic response involving IL-10-producing
CD4(+)CD25(+) T regulatory cells in mice. Int J
Immunopathol Pharmacol 2010;23(4):10211031.
4. Di Gioacchino M, Perrone A, Petrarca C, Di
Claudio F, Mistrello G, Falagiani P, Dadorante V,
Verna N, Braga M, Ballone E, Cavallucci E- Early
cytokine modulation after the rapid induction
phase of sublingual immunotherapy with mite
monomeric allergoids. Int J Immunopathol
Pharmacol 2008;21(4):969-976.
5. Bohle B, Kinaciyan T, Gerstmayr M, Radakovics A, Jahn-Schmid B, Ebner C- Sublingual
immunotherapy induces IL-10-producing T regulatory cells, allergen-specific T-cell tolerance,
and immune deviation. J Allergy Clin Immunol
2007;120(3):707-713.
6. Cosmi L, Santarlasci V, Angeli R, Liotta F,
Maggi L, Frosali F, Rossi O, Falagiani P, Riva G,
Romagnani S, Annunziato F, Maggi E- Sublingual immunotherapy with Dermatophagoides
monomeric allergoid down-regulates allergenspecific immunoglobulin E and increases both
interferon-gamma- and interleukin-10-production. Clin Exp Allergy 2006;36(3):261-272.
7. Ciprandi G, De Amici M, Murdaca G,
Colombo BM, Quaglini S, Marseglia G, Di
Gioacchino M- Serum IL-4 as a marker of
immunological response to sublingual immunotherapy. J Biol Regul Homeost Agents
2008;22(2):117-123.
Not Allergol Anno 32 - 2013 • Vol. 31, n. 2
95
Bibliografia
1. Di Gioacchino M, Cavallucci E, Ballone E,
Cervone M, Di Rocco P, Piunti E, Filardo GS, Turi
MC, Mangifesta R, Quecchia C, Mistrello G, Braga M, Petrarca C- Dose-dependent clinical and
immunological efficacy of sublingual immunotherapy with mite monomeric allergoid. Int J
Immunopathol Pharmacol 2012;25(3):671-679.
2. Quercia O, Bruno ME, Compalati E, Falagiani P, Mistrello G, Stefanini GF- Efficacy and
safety of sublingual immunotherapy with grass
monomeric allergoid: comparison between two
different treatment regimens. Eur Ann Allergy
Clin Immunol. 2011;43(6):176-183.
3. Petrarca C, Lazzarin F, Pannellini T, Iezzi M,
Braga M, Mistrello G, Falagiani P, Di Giampaolo L,
Di Gioacchino M- Monomeric allergoid intraga-
calendario congressi
Ottobre 2013
■ Novità in tema di pneumologia
ed allergologia pediatrica
18-19 ottobre
Genova
Segr. org.: iDea congress
■ VIII World Congress
of Immunopathology,
Respiratory Allergy & Asthma
12 - 15 ottobre
Dubai (UAE)
Segr. org.: World Immunopathology
Organization
■ PAAM 2013- Pediatric Allergy
and Asthma Meeting
17 - 19 ottobre
Atene (Grecia)
Segr. org.: EAACI Headquarters
■ Congresso AAITO 2013
24-26 ottobre
Ancona
Segr. org.: AIM Group International
Novembre 2013
■ Rinite, asma, COPD &allergie
alle muffe: diagnosi, trattamento
e risk management
9 novembre
Mantova
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■ Highlights in allergy and respiratory
diseases
14-16 novembre
Genova
Segr. org.: iDea congress
■ Le allergie del mondo occidentale
16 novembre
Foggia
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■ DAM 16
26-29 novembre
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Milano
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2013
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Emilia-Romagna. Le allergie nel bambino:
uniformità e ottimizzazione delle cure
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Parma
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6-7 dicembre
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Segr. org.: Dafne congressi
Milano
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nuove strategie
13-14 febbraio
Segr. org.: iDea congress
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Riniti, asma e BPCO VII Edizione
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Segr. org.: iDea congress
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Locri (RC)
Segreterie organizzative
• iDea congress
Via della Farnesina, 224 - 00194 Roma
Tel. 06 36381573, Fax 06 36307682
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[email protected], www.wipocis.org
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Genferstrasse, 21 - 8002 Zurich - Switzerland
Tel. +41 44 205 55 33, Fax +41 44 205 55 39
[email protected], www.eaaci-paam2013.com
• Update International Congress
Via dei Contarini, 7 - 20133 Milano
Tel. +39 02 70125490, Fax +39 02700503943
[email protected], www.upcongr.it
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www.aimgroup.eu
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I
l Notiziario Allergologico è una pubblicazione quadrimestrale di aggiornamento nel campo della Allergologia e delle discipline ad essa
correlate, rivolta ai Medici ed ai Ricercatori. Il Notiziario Allergologico
non pubblica articoli sperimentali, ma aggiornamenti e rassegne concordati
tra la Redazione e gli Autori, sia per quanto riguarda i contenuti che la lunghezza. Il Comitato Scientifico partecipa al reperimento delle informazioni
e controlla la correttezza scientifica della rivista; comunque le affermazioni
e le opinioni espresse negli articoli sono quelle degli Autori e non esprimono
necessariamente il parere del Comitato Scientifico o della Redazione.
• I manoscritti per la pubblicazione devono venire inviati tramite posta
elettronica a: [email protected]
Nei manoscritti, oltre al nome completo degli Autori, dovrà essere indicata
l’affiliazione degli stessi e l’indirizzo postale dell’Autore al quale verranno
inviate le bozze.
• Il testo dovrà essere in formato Word o analogo senza usare programmi di impaginazione specifici.
• Le illustrazioni, le fotografie e le tabelle dovranno essere salvate e
inviate in files separati (JPG, TIFF, PDF).
RIAssuNtO e summARy
Ogni articolo sarà preceduto da un riassunto breve (250 parole, 1700 caratteri spazi inclusi) e da un summary in inglese più ampio (450 parole, 3000
caratteri spazi inclusi).
• Parole chiave: la lista di 4-8 parole chiave deve mettere in evidenza gli
argomenti più significativi trattati nel lavoro.
BIBLIOgRAfIA
La bibliografia verrà scritta in base alle indicazioni riportate di seguito:
• Lavori comparsi in periodici: cognome e iniziale del nome degli Autori,
titolo del lavoro, titolo abbreviato del periodico, anno, numero del volume,
pagina iniziale e finale.
es: Holt PG - Mucosal immunity in relation to the development of oral
tolerance/sensitization. Allergy 1998;4:16-19.
• monografie e i trattati: cognome e iniziale del nome degli Autori, titolo, editore, luogo e anno di pubblicazione.
es: Errigo E - Malattie allergiche. Etiopatogenesi, diagnostica e terapia.
Lombardo Editore, Roma, 1994.
• Lavori pubblicati come capitoli di volumi: indicare cognome e iniziale dei nomi degli Autori, titolo del capitolo, titolo del volume in cui il
lavoro è pubblicato, preceduto dall’indicazione del Curatore, e seguita da
quella dell’Editore, luogo e anno di pubblicazione, pagina iniziale e finale
del capitolo citato.
es: Philips SP, Whisnant JP - Hypertension and stroke. In: Laragh JH,
Brenner BM (Eds.) Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. 2nd ed., New York, Raven Press, 1995, p. 465-478.
La bibliografia verrà ordinata in ordine di citazione nel corso del testo e
ogni citazione verrà contrassegnata da un numero progressivo di identificazione. In casi particolare, quando la bibliografia sia composta da riviste
sintetiche, trattati, monografie e sia limitata a poche voci, non verrà citata
nel testo ma raggruppata alla fine del lavoro sotto il titolo “Letture consigliate”. I titoli delle riviste dovranno essere abbreviati secondo le indicazioni
del Cumulated Index Medicus.
CItAzIONI DI sPeCIALItà
Ogni composto farmaceutico deve essere citato in base al suo nome chimico e/o alla sua denominazione comune internazionale, evitando di citare il
nome del marchio. Quest’ultimo potrà essere indicato solo se inevitabile e
con la lettera iniziale in maiuscolo.
ABBRevIAzIONI
Abbreviazioni e simboli usati, secondo gli standard indicati in Science
1954; 120: 1078.
Una volta definiti, essi possono venire usati come tali nel corso del testo.
BOzze
Le prime bozze verranno inviate al primo Autore, a meno che non venga
altrimenti indicato. Le seconde bozze verranno corrette in Redazione. Le
bozze dovranno venire restituite nello spazio di sette giorni dalla data di
arrivo, con l’approvazione dell’Autore.
Unità di misura Unit
conte per minuto
curie
millicurie
microcurie
chilogrammo
grammo
milligrammo
microgrammo
nanogrammo
picogrammo
femtogrammo
litro
millilitro
microlitro
nanolitro
picolitro
chilometro
metro
centimetro
millimetro
micrometro
nanometro
picometro
Angstrom
kilo Daltons
ora
minuto primo
minuto secondo
counts per minute
curie
millicurie
microcurie
kilogram
gram
milligram
microgram
nanogram
picogram
femtogram
litre
millilitre
microlitre
nanolitre
picolitre
kilometre
metre
centimetre
millimetre
micrometre
nanometre
picometre
Angstrom
kilo Daltons
hour
minute
second
cpm
Ci
mCi
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Kg
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mg
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kDa
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