Il laboratorio accreditato di diagnosi fitopatolologica
del Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura "Basile Caramia"
Trisciuzzi N. e A. Cardone
Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura “Basile Caramia”, Locorotondo (BA)
Premessa
Il Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura “Basile Caramia” (CRSA) sin
dall'avvio delle attività si è occupato di problemi fitopatologici, organizzando, con il supporto del
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata (DPPMA) dell'Università di
Bari, un laboratorio di diagnosi fitopatologica.
Successivamente all’emanazione dei DD.MM. del 14.04.1997, che presentano tra gli aspetti
innovativi il riconoscimento formale del ruolo dei laboratori di diagnosi fitopatologica per la
garanzia della qualità delle produzioni vivaistiche
(categoria C.A.C.) da parte del fornitore
(vivaista), il CRSA ha avviato presso il Servizio Fitosanitario della Regione Puglia (SFR) la
procedura per la richiesta di accreditamento del proprio laboratorio, in quanto questo risultava
conforme al disposto dell'articolo 10 dei DD.MM. del 14 aprile 1997 (Fig. 1).
Fig. 1. Il laboratorio accreditato del
C.R.S.A.
In data 6 aprile 1998 il laboratorio è stato accreditato a svolgere "analisi fitosanitarie relative
a batteri, funghi, fitoplasmi (MLO's), viroidi e virus su piantine ortive e relativi materiali di
moltiplicazione (art. 3 comma 1 lettera d del D.P.R. 21/12/1996, n.698), e su piante da frutto e
relativi materiali di moltiplicazione (art. 3 comma 1 lettera d del D.P.R. 21/12/1996, n. 697)".
Inoltre, in data 21 maggio 1999 il laboratorio è stato accreditato a svolgere anche analisi
fitosanitarie relative ai nematodi.
Attività di accreditamento
In qualità di laboratorio accreditato, il CRSA pone la sua attività al servizio del “fornitore”
(vivaista) il quale, per produrre materiale di propagazione di categoria C.A.C., dovrà presentare
apposita domanda al SFR competente per territorio, indicando il laboratorio che effettuerà le analisi
richieste. Per quanto riguarda l’iter proposto dal CRSA, il vivaista deve inoltrare al laboratorio una
domanda in cui, oltre ad indicare i dati personali e identificativi dell’azienda, deve riportare le
caratteristiche tecniche dei campi e delle strutture destinate alla produzione del materiale di
moltiplicazione categoria C.A.C.. Successivamente alla presentazione della domanda, i tecnici del
laboratorio del CRSA procederanno alla verifica dell’effettivo possesso da parte dell’azienda dei
requisiti dichiarati dal vivaista. Questa verifica è propedeutica alla sottoscrizione di un contratto
(allegato 1) tra il laboratorio e il vivaista. Con la stipula del contratto, il vivaista si impegna ad
osservare tutte le norme tecniche e gli obblighi previsti per l’accreditamento (allegato V per le
ortive e allegato VII per le piante da frutto nel rispettivo decreto del 14/4/1997) nonché le
indicazioni del laboratorio stesso (allegato 2), pena l’annullamento del contratto. Da parte sua, il
CRSA si impegna a comunicare al vivaista i risultati dei saggi eseguiti tramite il rilascio di un
certificato (allegato 3) secondo i tempi e le modalità indicati nel contratto.
Per quanto riguarda i protocolli di accertamento sanitario, il CRSA, in possesso di competenze
soprattutto nel settore virologico, si attiene alle indicazioni impartite dal SFR relativamente alle
modalità di campionamento, ai patogeni e alle tecniche di diagnosi (allegato 4), e si avvale del
supporto scientifico del DPPMA e del Centro di Studio sui Virus e le Virosi delle Colture
Mediterranee (Ce.Vi.Co.M) del CNR di Bari per l’attuazione della stessa diagnosi virologica, delle
analisi micologiche e batteriologiche; per le analisi nematologiche, si avvale della collaborazione
dell’Istituto di Nematologia Agraria del CNR di Bari.
In questi primi anni di attività come laboratorio accreditato, il CRSA ha lavorato per
aziende vivaistiche della Puglia e della Sicilia. Nella tabella 1, che riassume l’attività svolta, si
riportano, per ciascuna delle regioni in cui il Laboratorio ha operato, le località e il numero delle
aziende interessate all’attività di accreditamento, le specie vegetali e, per ognuna di esse, il numero
delle piante saggiate ed, infine, come risultato degli accertamenti sanitari effettuati, si riporta il
numero delle piante con stato sanitario conforme a quanto previsto dal decreto per ciascuna specie,
oltre a quelle non conformi con l’indicazione del patogeno individuato.
Conclusioni
L’avvio delle attività è stato caratterizzato dalla difficoltà iniziale di far comprendere il
ruolo del laboratorio accreditato e la necessità di modificare il processo produttivo e di eseguire
interventi di carattere strutturale per poter produrre piantine di ortive e materiale di propagazione di
specie arboree con stato sanitario conforme all’allegato II dei DD.MM. del 14/4/1997, cioè
produzioni vivaistiche di categoria C.A.C.
Dopo due anni di attività, pur essendoci ancora molti problemi da risolvere, non mancano riscontri
positivi come testimoniato dall’incremento delle richieste di accreditamento e soprattutto dalla
disponibilità dei vivaisti nel mettere in atto i suggerimenti del laboratorio e dalla loro
collaborazione nelle attività di controllo.
Tabella 1. Attività svolta dal laboratorio accreditato del CRSA nel biennio 1999 - 2000
Regione località
Sicilia
n°
aziende
prov. di:
Palermo
1
Messina
3
specie
n° piante
saggiate
agrumi
186
virus e viroidi
CTV (Virus della tristezza degli agrumi)
CPV (Virus della psorosi)
CVV (Virus della variegatura infettiva)
CEVd (Viride dell’exocortite)
CCaVd (Viroide della cachessia)
CGV (concavità gommose)
Imp. (impietratura)
CCr (cristacortis)
n° piante
con stato
sanitario
conforme
147
n° piante
con stato sanitario non
conforme
39:
31 pos. ai viroidi;
4 pos. a viroidi e psorosi
1 pos. alla variegatura;
2 pos. ad agenti virussimili
fruttiferi
prov. di:
Puglia
- Foggia
8
- Bari
2
- Brindisi
3
- Lecce
1
- Taranto
2
2000
300 di
pomodoro
(corrispondenti
a circa 25
milioni di
piante);
ortive:
200 di altre
pomodoro;
ortive
altre ortive (corrispondenti
a circa 10
milioni di
piante
PPV (Virus della vaiolatura del susino)
PDV (Virus del nanismo del susino)
PNRSV (Virus della maculatura anulare
necrotica dei Prunus)
CMV (Virus del mosaico del cetriolo),
PVX (virus X della patata)
PVY (virus Y della patata)
TMV (Virus del mosaico del tabacco)
TYLCV (Virus dell’accartocciamento fogliare
giallo del pomodoro)
AMV (Virus del mosaico dell’erba medica)
TSWV (Virus dell’avvizzimento maculato del
pomodoro)
CeMV (Virus del mosaico del sedano)
LeMV (Virus del mosaico della lattuga)
WMV2 (Virus del mosaico 2 dell’anguria)
ZYMV (Virus del mosaico giallo dello
zucchino)
PMMV (Virus del mosaico lieve del peperone)
CGMV (Virus del maculatura verde del
cetriolo).
1870
130:
122 pos. a PDV;
8 pos. a PNRSV
490
10:
6 pos. a TSWV
4 pos. a CMV
Allegato 1. Fac-simile di contratto
Allegato 2. Norme tecniche ed obblighi previsti per il vivaista
I “fornitori” di fruttiferi, si impegnano:
- ad adeguare le strutture, gli impianti, i campi delle fonti iniziali, i vivai ed i semenzai a quanto
previsto dal protocollo tecnico dei punti critici del processo produttivo;
- ad indicare le fonti iniziali (piante), in impianti commerciali ubicati in aree esenti da focolai
da agenti da quarantena (tristezza e mal secco per gli agrumi; fuoco batterico per le pomacee;
sharka per le drupacee) dichiarate esenti dal Servizio Fitosanitario Regionale, e che abbiano
superato la fase giovanile ed in particolare abbiano un'età minima indicata a seconda della
specie.
I “fornitori” di piantine di ortive si impegnano:
- ad osservare tutte le norme tecniche e gli obblighi di adeguamento previste per
l’accreditamento pena il mancato rilascio del certificato da parte del Centro;
- consentire al personale tecnico del Centro l’accesso agli impianti e agli appositi registri o
moduli in cui saranno annotati relativamente alle piantine da sottoporre ai saggi, i dati relativi
all’origine delle sementi, e al calendario dei trattamenti effettuati;
- controfirmare apposito che attesta l’avvenuto prelievo dei campioni secondo i criteri previsti.
Allegato 3. Fac-simile di certificato rilasciato dal laboratorio
Allegato 4. Tecniche di diagnosi adottate dal laboratorio accreditato del C.R.S.A.
@ Virus:
-
diagnosi sierologica : ELISA
diagnosi molecolare: - ibridazione molecolare
- amplificazione genica
- estrazione ed analisi in dsRNA
In associazione a rilievi
sintomatologici e saggi
biologici su piante indicatrici
@ Funghi: - isolamento e allevamento su idonei substrati colturali
@ Batteri: - isolamento e allevamento su idonei substrati colturali
@ Nematodi: - setacciamento, decantazione ed osservazione al microscopio ottico.
Allegato 5. Campionamento e saggi
Fruttiferi
Nei periodi stabiliti, le piante indicate dal vivaista vengono sottoposte a rilievi
sintomatologici per verificare l'assenza di malattie e dei patogeni specifici (insetti, acari, batteri,
funghi) e, quindi, ad analisi di laboratorio indispensabili per i virus. Si preleva un campione di
materiale vegetale per ogni fonte iniziale (costituito da rami e/o foglie prelevati da quattro punti
della pianta). Il campione, inserito in busta numerata per l'identificazione dello stesso, viene
conservato in una borsa frigo e trasportato al laboratorio, ove sarà sottoposto ad analisi specifiche
a seconda della specie da saggiare: ELISA (fig. 2) per la diagnosi di virus degli agrumi (CTV,
CPV, CVV), e delle drupacee (PPV, PDV, PNRSV, ACLSV); ibridazione molecolare per la
diagnosi dei viroidi degli agrumi (CEVd e CcaVd), PCR, ibridazione molecolare e dsRNA per la
diagnosi di virus dell'olivo; trasmissione meccanica e/o per innesto per l'identificazione di
infezioni degli agrumi e delle drupacee.
Ortive
Sulla base al ciclo produttivo, tecnici con specifiche competenze programmano con il
vivaista il numero di campionamenti da effettuare. Il campionamento è condotto nel seguente
modo: da tutti i lotti in allevamento si prelevano campioni di foglie dalle piantine da sottoporre al
saggio di laboratorio per i più importanti virus contemplati nel D.M. per ciascuna specie. Un
campione, costituito da 12-15 subcampioni (porzioni di foglie), è prelevato in modo
“tecnicamente e statisticamente attendibile”, ogni 100 mila piantine o frazione. La raccolta dei
subcampioni dai bancali viene eseguita con un attrezzo telescopico che permette il loro prelievo
fino alla distanza di quattro metri dall'operatore.
I subcampioni, inseriti in una bustina, appositamente numerata per l'identificazione, devono essere
conservati in borsa frigo fino al trasporto in laboratorio. La diagnosi sarà effettuata e mediante
ibridazione molecolare (Fig. 3) o attraverso trasmissione meccanica su piante spie.
Caricamento campioni su
piastra ELISA
Lettura risultati
Figura 2. Fasi di diagnosi immunoenzimatica
(ELISA)
Spot su membrana di nylon+ di un
campione di ortive
Rilevazione positivi
Figura 3. Fasi di diagnosi molecolare
(ibridazione molecolare)
