- Miotonici in Associazione

Facoltà di Farmacia
Dip. Farmaco-Biologico
Sezione di Farmacologia
Dalla relazione genotipo-fenotipo
alla terapia farmacologica
delle miotonie
Jean-François Desaphy
2° Incontro Annuale
Associazione M.I.A. onlus
Le canalopatie del muscolo scheletrico
Myotonia
Myotonia
Congenita
Generalized
Myotonia
Chromosome 7
CLCN1 gene
Chloride channel
J-F Desaphy
Periodic Paralysis
Potassium-aggravated
Myotonia
Paramyotonia
Congenita
Chromosome 17
SCN4A gene
Sodium channel
Hyperkalemic
Periodic
Paralysis
Hypokalemic
Periodic
Paralysis
Chromosome 1
CACNL1A4 gene
Calcium channel
Andersen-Tawil
Syndrome
Chromosome 17
KCNJ2 gene
Potassium channel
CANALI e TRASPORTI IONICI
CANALI IONICI
Na+ Cl-
Na+
145 mM
J-F Desaphy
TRASPORTATORI
K+
Na+
Ca2+
4 mM
K+
Na+
12 mM
Ca2+
ATP
155 mM
Ca2+
1.8 mM
Ca2+
0.1 µM
ATP
K+
Cl15 mM
NUCLEO
Cl150 mM
POMPE
Na+
K+
CELLULA
PROTEINE CANALI
Gating
Voltaggio
agonista diretto
stiramento
proteina G
Ioni calcio
Modulazione
Fosforilazione
Ossidazione
Citoscheletro
Stiramento
ATP
Ioni calcio
altri ioni
J-F Desaphy
Più di 400 geni codificano
per altrettanti canali
Porta di
attivazione
ione
K+
Na+
Ca2+
H+
non-selettivi
Cl-
S
E
N
S
O
R
E
Subunità
ausiliaria
Porta di
inattivazione
Siti di legame per piccole molecole
FUNZIONE DEI CANALI IONICI
5 sensi
J-F Desaphy
contrazione
neurotrasmissione
ion
S
E
N
S
O
R
Proliferazione cellulare
Differenziamento cellulare
risposta immunitaria
Secrezione ormonale
secrezione esocrina
CANALI IONICI e MALATTIE
Coinvolgimento
in patogenesi
aritmie cardiache
disordini psichici
disfunzioni cognitive
sensazione del dolore
ipertensione
patologie renali
diabete
cancro
Canalopatie primarie
Muscolo scheletrico
paralisi periodica
miotonia
miastenia
ipertermia maligna
malattia “central core”
Mutazioni nel gene CFTR
Difetti di un canale del cloro
Canalopatie secondarie
intossicazione
distrofia miotonica
malattie autoimmuni
iperalgesia
Aritmie cardiache
Sistema nervoso centrale
epilessia
atassia
emicrania
ipereplessia
1/2500 europei affetti
recessivo
1/20 portatori sani
J-F Desaphy
fibrosi cistica
Malattie renali
osteopetrosi
diabete
ipertensione
eritermalgia
SCID
Più di 60 geni mutati
Centinaia di mutazioni
CANALI IONICI e FARMACI
J-F Desaphy
~5% dei bersagli di farmaci sono canali ionici
Canali per il calcio
antiangina, anti-ipertensivi, antiaritmici, antiepilettici
Canali per il sodio
anestetici locali, antiaritmici, antiepilettici, anti-miotonici, diuretici
Canali per il cloro
antiepilettici, ansiolitici, ipnotici, anestetici generali, rilassanti muscolari
Canali per il potassio
antidiabetici, anti-ipertensivi, antiaritmici
Farmacologi di Bari e le canalopatie
J-F Desaphy
Sezione di Farmacologia – Facoltà di Farmacia
Team leader: prof.ssa Diana Conte Camerino
Canali del sodio
Canali del potassio
J-F. Desaphy
A. De Luca
M. De Bellis
T. Costanza
R. Carbonara
M. Dinardo
Farmaci
D. Tricarico
A. Mele
GL. Cannone
G. Camerino
M. Dinardo
S. Calzolaro
Farmaco
Canali del cloro ClC-1
S. Pierno
J-F. Desaphy
A. Liantonio
M. De Bellis
G. Camerino
M. Dinardo
G. Gramegna
M. Cannone
Canali del cloro ClC-K, renali
A. Liantonio
G. Gramegna
A. Scaramuzzi
G. Camerino
M. Dinardo
Canalopatie Muscolari
Ipertermia maligna
miastenia
miotonia
Paralisi periodica
Il difetto genetico determina una proteina alterata che funziona:
poco (perdita di funzione)
troppo (guadagno di funzione).
J-F Desaphy
Ruolo del Farmacologo
J-F Desaphy
Relazione genotipo/fenotipo
Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci
Farmaco
Alla ricerca del farmaco migliore
Ruolo del Farmacologo
J-F Desaphy
Relazione genotipo/fenotipo
1° esempio: le canalopatie da sodio muscolari
2° esempio: la miotonia da cloro
Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci
Farmaco
Alla ricerca del farmaco migliore
Relazione Genotipo-Fenotipo
J-F Desaphy
+10
Canalopatie muscolari da sodio
30 ms, 0.1 Hz
-80
-120
R1448C
I
II
III
IV
+
+
+
+
+
+
+
+
Paramyotonia Congenita
out
recettore LA
in
COOH
G1306E
NH2
A1156T
Miotonia aggravata dal K+
Paralisi periodica ipercalemica
Desaphy et al., Neurology 2001
Relazione Genotipo-Fenotipo
J-F Desaphy
+10
Canalopatie muscolari da sodio
30 ms, 0.1 Hz
-80
-120
R1448C
I
II
III
IV
+
+
+
+
+
+
+
+
Paramyotonia Congenita
out
recettore LA
in
COOH
G1306E
NH2
A1156T
Miotonia aggravata dal K+
Paralisi periodica ipercalemica
Mutagenesi sito-diretta, espressione eterologa, patch-clamp
Desaphy et al., Neurology 2001
Relazione Genotipo-Fenotipo
J-F Desaphy
+10
Canalopatie muscolari da sodio
30 ms, 0.1 Hz
-80
-120
R1448C
I
II
III
IV
+
+
+
+
+
+
+
+
Paramyotonia Congenita
out
recettore LA
in
COOH
G1306E
NH2
A1156T
Miotonia aggravata dal K+
Paralisi periodica ipercalemica
Mutagenesi sito-diretta, espressione eterologa, patch-clamp
Farmaco
Farmaco
Farmaco
Desaphy et al., Neurology 2001
Genotype/phenotype correlation
J-F Desaphy
Missense mutations
Impaired fast inactivation
Enhanced activation
Impaired slow inactivation
Sarcolemma hyper-excitability
Sarcolemma inexcitability
Myotonia (muscle stiffness)
Paralysis (muscle weakness)
Miotonia da cloro
J-F Desaphy
F167L
Mauro LoMonaco, Anna Modoni
F167L
//
AR
ts
G190S
miotonia
debolezza
F167L
100
Vm (mV)
Open Probability
ry
in
a
pr
el
im
WT
ub
lis
he
d,
4
G190S
Un
p
6
I (nA)
Current amplitude
re
su
l
G190S
WT
F167L
G190S
Vm (mV)
200
La mutazione F167L riduce il passaggio degli ioni attraverso il canale
Riduzione della corrente
La mutazione G190S modifica la dipendenza dal voltaggio
MIOTONIA
Ruolo del Farmacologo
J-F Desaphy
Relazione genotipo/fenotipo
Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci
Farmaco
Alla ricerca del farmaco migliore
Alla ricerca del farmaco migliore
Farmaco noto con meccanismo d’azione ignoto (uso empirico)
Meccanismo d’azione dell’acetazolamide nella miotonia
Farmaco noto con meccanismo d’azione noto
Nuovi farmaci nella terapia della miotonia
flecainide e propranolol
Farmaci mancanti
Nuovi ligandi per i canali al cloro
J-F Desaphy
Alla ricerca del farmaco ideale
Farmaco noto con meccanismo d’azione ignoto (uso empirico)
Meccanismo d’azione dell’acetazolamide nella miotonia
Farmaco noto con meccanismo d’azione noto
Nuovi farmaci nella terapia della miotonia
flecainide e propranolol
Farmaci mancanti
Nuovi ligandi per i canali al cloro
J-F Desaphy
Sindromi miotoniche
Paramiotonia congenita
Miotonia aggravata dal K+
J-F Desaphy
Miotonia congenita
Miotonia generalizzata
Nav1.4
ClC-1
sodio
Distrofia miotonica
cloro Miopatia miotonica prossimale
aumentata
attività
ridotta
attività
Ipereccitabilità del sarcolemma
Mexiletina Farmaco
Bloccante canali al sodio
SINDROMI
MIOTONICHE
Rigidità muscolare
Difficoltà al rilassamento
Antimiotonico mexiletina
J-F Desaphy
Mexiletina, bloccante canali al sodio
Farmaco antimiotonico di 1° scelta
Trial clinico in corso
Non tutti i pazienti rispondono
Possibili effetti collaterali
I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina ?
Quali nuovi farmaci per la miotonia ?
J-F Desaphy
I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina ?
Dipendenza dal voltaggio
1.2
WT, n=38
G1306E, n=31
A1156T, n=21
R1448C, n=42
R1448C
Spostamento negativo
della curva
Normalized Current
1.0
0.8
0.6
G1306E
Spostamento positivo della curva
0.4
0.2
0.0
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
Prepulse Potential (mV)
Mexiletine
NH2
Flecainide
CF3
O
N
H
O
H
N
O
CF3
Desaphy et al., J Physiol 2004
J-F Desaphy
I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina ?
Dipendenza dal voltaggio
1.2
WT, n=38
G1306E, n=31
A1156T, n=21
R1448C, n=42
Normalized Current
1.0
R1448C
Spostamento negativo
della curva
Più sensibile alla
mexiletina e alla
flecainide
G1306E
Spostamento positivo della curva
0.8
0.6
Meno sensibile alla mexiletina
Più sensibile alla flecainide
0.4
0.2
0.0
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
Prepulse Potential (mV)
Mexiletine
NH2
GE, 300 µM Mexiletine
GE, 100 µM Flecainide
O
10 Hz
10 Hz
O
Flecainide
CF3
N
H
0.1 Hz
H
N
O
0.3 Hz
CTRL
500 pA
500 pA
2 ms
CTRL
2 ms
CF3
Desaphy et al., J Physiol 2004
J-F Desaphy
FARMACOGENETICA: medicina personalizzata
Dipendenza dal voltaggio
negative shift
no shift
I141V
I1160V
PAM
positive shift
S804F
V1589M
Q1633E
unknown
L250P
A1481D
G1306A
G1306E
G1306V
G1306E
PMC
I693T
R1148C
R1448P
R1448H
R1448S
V445M
V1293I
Blocco normale
Blocco maggiore
Mexiletine
NH2
O
L266V
Q270K
T704M
A1152D
F1705I
T1313A
T1313M
L1433R
F1473S
M1370V
R1448L
V1458F
M1476I
L1436P
G1456E
R1460Q
Blocco minore
Flecainide
CF3
O
N
H
H
N
O
CF3
Desaphy et al., submitted
J-F Desaphy
Quali nuovi farmaci antimiotonici ?
Blocco dei canali Nav1.4 ?
Farmaco β-agonista
doping
SI
Farmaco β-agonista
anti-asmatico
No
Farmaci β-antagonisti
anti-aritmici
SI
No
Bloccante canali al sodio
anti-aritmico,
antimiotonico
SI
Studi pre-clinici
Tempo di raddrizzamento
l
o
r
e
t
u
b
n
e
l
c
0.5 s
l
o
l
o
n
a
p
o
r
p
Unp
lts
u
s
e
yr
r
a
n
imi
l
e
r
,p
e
n
i
t
e
l
i
x
e
m
CTRL
hed
s
i
l
ub
J-F Desaphy
l
o
l
o
d
a
n
100
4s
% of TRR reduction
l
o
m
a
t
u
b
l
a
s
9AC ratto miotonico
80
60
40
20
9AC + farmaco antimiotonico
0
5
1s
15
40
[DRUG] (mg/kg)
il propranololo potrebbe rappresentare una valida alternativa alla mexiletina
nella terapia antimiotonica
Desaphy, Costanza, Gramegna & Conte Camerino, in preparation
Studi pre-clinici
J-F Desaphy
SALBUTAMOL
CLENBUTEROL / PROPRANOLOL
Activation of Na+/K+ pump
Activation of Na+/K+ pump
Inhibition of sodium channels
Anabolic action
Sarcolemma hyperpolarization
Hyperkalemic periodic paralysis
Sarcolemma hyperpolarization
Inhibition of AP firing
Myotonic syndromes
Including myotonic dystrophy
Conclusioni
J-F Desaphy
L’impegno del Farmacologo nelle malattie rare
elaborare solide basi scientifiche per trial clinici
esplicitare i test pre-clinici di efficacia e di tossicità
studiare la farmacogenetica
inventare nuovi farmaci (in collaborazione con i chimici farmaceutici)
individuare nuovi farmaci efficaci pronti all’uso
delucidare il meccanismo d’azione di farmaci empirici
individuare nuovi possibili bersagli per farmaci
Trovare il
farmaco ideale
Studiare la relazione
genotipo/fenotipo
Ringraziamenti
J-F Desaphy
Sezione di Farmacologia (2011)
Dottorandi
Post-doc
Diana CONTE
Annamaria DE LUCA
Domenico TRICARICO
Jean-François DESAPHY
Chimica farmaceutica
Facoltà di Farmacia
Bari Carlo Franchini
Fulvio Loiodice
…
Teresa COSTANZA
Gianluca GRAMEGNA Valeria SBLENDORIO
Sabata PIERNO
Antonella LIANTONIO Anna COZZOLI
Gianluigi CANNONE
Marilena DINARDO
Michela DE BELLIS
Roberta CARBONARA
Roberta CAPOGROSSO Antonella SCARAMUZZI
Antonietta MELE
Giulia CAMERINO
Maria CANNONE
Sara CALZOLARO
Collaborazioni esterne
Alfred L. George, USA
Frank Lehmann-Horn, Germania
Bertrand Fontaine, Francia
Ramone Latorre, Cile
Patrick Delmas, Francia
Michael Pusch, Genova
Mauro Lomonaco, Roma
Giovani Meola, Milano
Pharmaceutical
I ndustries
Continuiamo
a lavorare
Commenti
J-F Desaphy
Le sindromi miotoniche appartengono ad un gruppo di malattie dei muscoli scheletrici,
comprendendo anche le paralisi periodiche. Tutte queste patologie hanno in comune di
essere la conseguenza di mutazioni a carico di geni codificanti per i canali ionici, di cui il
neologismo “canalopatie”.
I canali e trasportatori ionici sono delle proteine presenti nelle membrane delle nostre
cellule che permettono il passaggio selettivo di ioni e controllano l’omeostasi cellulare.
Questi ioni partecipano a molte se non tutte le funzioni cellulari.
Più di 400 geni sono stati identificati nel genoma umano che codificano per le subunità dei
canali ionici. Questi canali sono diversi per la specie ionica che permea, per i meccanismi
di apertura/chiusura del canale, per la loro modulazione da parte di segnali fisici e
biochimici, per la loro sensibilità alle tossine e ai farmaci.
Questi canali sono espressi nell’intero organismo e sono coinvolti in tutti i processi
fisiologici, compreso i sensi, la neurotrasmissione, la contrazione muscolare, la
secrezione degli ormoni, la secrezione esocrina, la risposta immunitaria, il ciclo cellulare,
la proliferazione e il differenziamento cellulare.
Commenti
J-F Desaphy
Non è quindi sorprendente che i canali ionici contribuiscano all’insorgenza di un numero
elevato di malattie debilitanti o letali, che includono le aritmie cardiache, l’ipertensione, le
malattie renali, il diabete, il dolore cronico, i disordini cognitivi e psichici, o ancora la
progressione del cancro.
Le canalopatie primarie sono le malattie che originano da mutazioni nei geni codificanti
per i canali ionici.
Queste malattie sono rare con un incidenza che varia, dal caso pressoché unico ad 1 caso
su 2500 europei come per la fibrosi cistica dovuta a mutazioni in un canale del cloro.
Nell’insieme, le canalopatie includono più di 60 malattie e diverse centinaia di mutazioni.
Sono malattie rare monogeniche, ma il loro studio negli anni recenti ha significativamente
contribuito alla comprensione di molte malattie multifattoriali.
Visto il loro coinvolgimento in molte malattie, i canali ionici costituiscono degli importanti
bersagli per l’azione dei farmaci. Sono noti farmaci che agiscono sui canali del calcio, del
sodio, del potassio, e del cloro.
Commenti
J-F Desaphy
I farmacologi della Facoltà di Farmacia dell’Università di Bari studiano da anni i canali
ionici, loro ruolo nelle canalopatie, e la loro sensibilità ai farmaci
I muscoli scheletrici si contraggono in risposta ad uno stimolo proveniente dal cervello
attraverso il nervo motore.
Questo nervo rilascia un messaggero, l’acetilcolina, che stimola il muscolo attraverso
l’attivazione di vari canali/trasportatori ionici presenti nelle membrane dei muscoli.
Mutazioni in questi canali sono stati associati a vari patologie muscolari.
In particolare, mutazioni a carico del canale al cloro o del canale al sodio sono state
associate a la miotonia.
La ridotta attività dei canali del cloro o l’esagerata attività dei canali del sodio rendono il
muscolo troppo eccitabile.
In condizioni normali, il muscolo scarica potenziali d’azioni in risposta ad uno stimolo
proveniente del nervo, scarica che si interrompe allo cessare dello stimolo.
In persone affette da miotonia, la scarica dei potenziali d’azioni dura oltre lo stimolo,
quindi il muscolo ha difficoltà a rilassarsi dopo la contrazione e rimane rigido: questo è la
miotonia.
Commenti
J-F Desaphy
Quali sono i compiti del farmacologo ?
Studiare la relazione tra genotipo e fenotipo per …
… Individuare possibili bersagli per i farmaci e …
… Trovare il farmaco migliore
Il primo esempio riguarda le canalopatie muscolari da sodio. Mutazioni nel gene che
codifica per il canale del sodio del muscolo scheletrico sono responsabili di una serie di
malattie caratterizzate da momenti di paralisi flaccida (paralisi ipercaliemica) o di rigidità
muscolare (miotonia).
Mediante tecnologie avanzate, abbiamo studiato in vitro l’effetto di 3 mutazioni, e abbiamo
potuto correlare l’insorgenza di paralisi ad una corrente al sodio persistente e la miotonia
al rallentamento del decadimento delle correnti al sodio.
Tali difetti biofisici diventano quindi dei possibili bersagli per l’azione di farmaci efficaci
contro la paralisi o contro la miotonia.
Il secondo esempio riguarda la miotonia congenita, che deriva da mutazioni nel gene che
codifica per il canale al cloro muscolare ClC-1.
In collaborazione con i dott.ri LoMonaco e Modoni, abbiamo studiato 2 mutazioni, F167L e
G190S, entrambi associate a miotonia. La mutazione G190S pero è anche associata a
l’insorgenza di debolezza muscolare di breve durata ma che può inficiare i movimenti.
Le due mutazioni riducono le correnti del cloro ma con meccanismi molecolari diversi.
Studi in corso mirano a correlare il difetto molecolare ai sintomi clinici.
Commenti
J-F Desaphy
Quindi una volta definita la relazione genotipo/fenotipo, il farmacologo si impegna a
trovare il farmaco migliore per curare la malattia rara in attesa di una terapia
genica/cellulare efficace ed applicabile.
Il farmacologo deve definire il meccanismo d’azione dei farmaci usati in modo empirico.
Il farmacologo può cercare nuovi farmaci con meccanismi d’azione noti per la cura delle
malattie rare.
Il farmacologo, con l’aiuto dei chimici farmaceutici può inventare nuovi farmaci in grado di
colpire i canali ionici, ove essi mancano.
Commenti
J-F Desaphy
Prendiamo di nuovo l’esempio delle miotonie, malattie caratterizzate da rigidità muscolare
che complicano la normale funzionalità dei muscoli scheletrici.
Ci sono miotonie da sodio, dovute a mutazioni nel gene del canale del sodio, e miotonie
da cloro, dovute a mutazioni nel gene del canale del cloro.
Il guadagno funzionale dell’uno o la ridotta funzionalità dell’altro inducono
l’ipereccitabilità muscolare che produce i sintomi clinici della malattia.
Quindi, oggi si cerca di opporsi all’ipereccitabilità utilizzando un farmaco bloccante dei
canali del sodio, la mexiletina.
La mexiletina è il farmaco di prima scelta nel trattamento delle miotonie, con alcuni limiti
importanti: non tutti i pazienti rispondono alla mexiletina; il farmaco può provocare effetti
avversi che ne limitano l’uso
Ci siamo quindi posti due domande: 1) i canali del sodio mutati sono sensibili alla
mexiletina ? 2) ci sono altri farmaci potenzialmente utili nel trattamento della miotonia ?
Commenti
J-F Desaphy
Per rispondere alla prima domanda, abbiamo studiato nel dettaglio gli effetti delle
mutazioni sulla funzione del canale.
Abbiamo osservato che due mutazioni provocando miotonia possono alterare in modo
opposto la dipendenza dal voltaggio, e abbiamo saggiato due farmaci: la mexiletina ed un
altro bloccante dei canale del sodio, la flecainide.
Il canale mutato con una voltaggio-dipendenza più negativa è molto sensibile a entrambi i
farmaci, ed i pazienti portatori di quella mutazione rispondono bene alla mexiletina.
Il canale mutato con una voltaggio-dipendenza più positiva sono meno sensibili alla
mexiletina, e i pazienti traggono in effetti meno beneficio dal farmaco. Invece, per le sue
specifiche proprietà, la flecainide è ancora molto efficace su questo canale mutato.
Sulla base di questi risultati, abbiamo dunque definito un meccanismo farmacogenetico,
cioè una risposta diversa all’azione dei farmaci in funzione della mutazione.
E’ questo il presupposto per una medicina personalizzata, che già ha riscontrato un certo
successo nell’ambito del trattamento delle miotonie da sodio.
Commenti
J-F Desaphy
Per la seconda domanda, cioè se ci sono farmaci disponibili potenzialmente utili nel
trattamento della miotonia, siamo partiti da un risultato ottenuto qualche anno fa nel
nostro laboratorio che dimostrava che alcuni farmaci noti come ligandi dei recettori per
l’adrenalina erano anche potenti bloccanti dei canali del sodio alla pari della mexiletina.
Abbiamo quindi recentemente sviluppato, anche su richiesta di ditte farmaceutiche, un
modello in vivo di miotonia, per potere esplicitare dei test preclinici di efficacia.
Se si gira un ratto sul dorso, l’animale metterà meno di un secondo per raggirarsi su se
stesso.
Se si somministra un bloccante dei canali del cloro muscolari, si ricrea la condizione di
miotonia da cloro, e l’animale impiegherà circa 4 secondi per rimettersi sulle 4 zampe.
Il tempo di raddrizzamento dipenderà quindi dell’effetto antimiotonico del farmaco
saggiato.
E abbiamo così confermato in vivo l’effetto antimiotonico del propranololo, che
suggeriamo poter essere utilizzato quindi dai pazienti.