lezione ROS

PARADOSSO dell’OSSIGENO
OSSIGENO:
essenziale per organismi complessi ma
(molto reattivo) può danneggiare gli organismi viventi
ROS
I ROS PIU’ IMPORTANTI
I ROS più noti ed importanti sono:
 Anione superossido O2-°
 Perossido di idrogeno H2O2
 Radicale ossidrilico °OH
I ROS SONO SEMPRE PERICOLOSI?
SE PRESENTI IN BASSE DOSI SONO
MODULATORI POSITIVI:
 Promuovono l’espressione dei geni che sintetizzano molecole
ad azione antiossidante
 Sono molecole segnale
 Partecipano alla difesa antimicrobica
IL DANNO INDOTTO DAI ROS:
QUALI SONO I MAGGIORI TARGET?
IL DANNO DEI RADICALI LIBERI
I ROS possono portare all’attivazione di pathways cellulari, alla stimolazione della
proliferazione cellulare e al DANNO CELLULARE a:
LIPIDI
(attaccano i lipidi di
membrana:
lipoperossidazione)
PROTEINE CELLULARI
DNA
(ossidano i residui aa
delle proteine)
(causano rotture
delle catene
del DNA ed alterazioni
delle basi)
Alte dosi di ROS possono causare morte cellulare.
FONTI DI RADICALI LIBERI
FONTI ENDOGENE
FONTI ESOGENE
PRODUZIONE ENDOGENA DI ROS
Generazione durante il normale metabolismo aerobio, in:
Membrana plasmatica: NADPH ossidasi, lipoossigenasi, mieloperossidasi.
Mitocondri: complessi enzimatici della catena respiratoria, MAO.
Perossisomi: numerose ossidasi.
REL: sistema monoossigenasico citocromo P450-dipendente (CYP2E1 e 2B).
Citosol: xantina ossidasi, prostaglandina H sintasi (PHS).
Fonti di ROS
Ossidazione microsomiale
Xantina ossidasi,
NOS isoforme
Mieloperossidasi
(fagociti)
Reticolo endoplasmico
Citoplasma
Metalli di
transizione
Lisosomi
Fe
Cu
Ossidasi
Perossisomi
Lipoossigenasi,
Prostaglandina sinatsi
NADPH ossidasi
Mitocondrio
Membrana plasmatica
Trasporto elettronico
Mitocondri e ROS
Perossisomi
Fatty Acid
Fatty acyl-CoA
synthetase
Acyl-CoA
H2O2
Acyl-CoA oxidase
Enoyl-CoA
Enoyl-CoA hydrolase
Hydroxyacyl-CoA
Hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
Ketoacyl-CoA
Thiolase
Acetyl-CoA
Acyl-CoA shortened
by two carbons
Enzymes in mammalian peroxisomes that generate ROS
Schader & Fahimi, Histochem Cell Biol, 2004
NADPH ossidasi
Presente principalmente nei neutrofili
ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING
Volume 8, Numbers 3 & 4, 2006
Activation of the gp91phox (NOX2) containing NOX complex of phagocytes involves phosphorylation of the
cytoplasmic regulator p47phox, with the translocation of the cytoplasmic p47phox, p67phox, and p40phox
regulatory components to the plasma membrane to interact with flavocytochrome-b558, which is composed of
gp91phox and p22phox. Activation of the complex also involves guanine nucleotide exchange on the GTP-binding
protein RAC stimulated by guanine nucleotide exchange factors. Guanine nucleotide exchange on RAC is associated
with release of RhoGDI and translocation of RAC from the cytosol to the NOX complex at the plasma membrane.
Prostaglandina sintasi
Co-oxidation of xenobiotics (X) during
arachidonic acid metabolism to PGH2
PHS
Fonti citoplasmatiche di ROS
Xantina ossidasi
Xantina ossidasi
Ossido nitrico sinatsi (NOS):
neuronal
nNOS (I)
endothelial
eNOS (III)
inducible
iNOS (II)
NO•
Il ruolo chiave della xantina deidrogenasi
Ipoxantina
Xantina
Xantina
Acido urico
 Xantina ossidasi 
H2O + O2
H2O2
O2
O2 •
Xantina deidrogenasi
La xantina ossidasi catalizza la formazione di anione
superossido e perossido di idrogeno nel citosol
Lisosomi come fonte di ROS
La Mieloperossiadsi è sottoposta ad una
serie di trasformazioni redox producendo
HOCl, degrada H2O2 ad ossigeno ed
acqua, converte la tirosina ed altri fenoli e
l’anilina in radicali liberi ed idrossila
substrati aromatici con una attività
citocromo P450 simile
Microsomes as a source of ROS (I)
A scheme of the catalytic cycle of cytochrome P450-containing monooxygenases. The binding of the substrate (RH) to ferric P450
(a) results in the formation of the substrate complex (b). The ferric P450 then accepts the first electron from CPR (cytochrome P450
reductase), thereby being reduced to the ferrous intermediate (c). This intermediate then binds an oxygen molecule to form
oxycomplex (d), which is further reduced to give peroxycomplex (e). The input of protons to this intermediate can result in the
heterolytic cleavage of the O–O bond, producing H2O and the ‘oxenoid’ complex (f), the latter of which then inserts the heme-bound
activated oxygen atom into the substrate molecule to produce ROH. In eukaryotic monooxygenases, reactive oxygen species (ROS)
are produced by ‘leaky’ branches (red arrows). In one such branch, a superoxide anion radical is released owing to the decay of the
one-electron-reduced ternary complex (d). The second ROS-producing branch is the protonation of the peroxycytochrome P450 (e),
which forms of H2O2. In addition to these ROS-producing branches, another mechanism of electron leakage appears to be the fourelectron reduction of the oxygen molecule with the production of water (Davydov, Trends Biochem Sci, 2001).
FONTI ESOGENE DI RADICALI LIBERI
Agenti fisici: radiazioni ionizzanti e raggi UV
Agenti chimici: ozono, metalli, alcuni farmaci e
molti xenobiotici possono indurre stress
ossidativo.
EFFETTI DEI ROS SU STRUTTURA E FUNZIONI
CELLULARI
•Perossidazione dei lipidi
•Ossidazione di aa, proteine e carboidrati
•Modificazioni enzimatiche
•Lesioni del DNA
•Morte cellulare
POSSIBILI RIMEDI ???
I SISTEMI DI DIFESA ANTIOSSIDANTE
Gli organismi viventi hanno sviluppato un
complesso sistema di difesa antiossidante,
(extracellulare e intracellulare).
Sono definiti agenti riducenti.
Possono essere sintetizzati dall’organismo o
assunti con la dieta.
ANTIOSSIDANTI: CLASSIFICAZIONE
Gli antiossidanti possono essere classificati secondo diversi criteri:
-in base all’origine: endogeni ed esogeni,
-in base alla natura chimica: enzimatici e non enzimatici,
-in base alla solubilità: liposolubili e idrosolubili,
-in base al meccanismo d’azione:
preventivi (tranferrina, lattoferrina, emopessina, ceruloplasmina, albumina),
scavenger (α-tocoferolo),
agenti di riparo (idrolasi, transferasi, polimerasi),
agenti di adattamento (esercizio fisico e regime alimentare equilibrato).
CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLA NATURA CHIMICA
Molto più frequente è la classificazione in base alla natura chimica:
Antiossidanti enzimatici:
superossido dismutasi (SOD)
catalasi
glutatione perossidasi (GPx) e glutatione reduttasi (GRed)
Antiossidanti non enzimatici:
glutatione (GSH)
ubichinone (CoQ10)
acido α-lipoico (ALA)
vitamina C (ascorbato)
α-tocoferolo (vitamina E)
carotenoidi
polifenoli
glucosinolati
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
SUPEROSSIDO
DISMUTASI (SOD)
È il principale antiossidante cellulare che mantiene bassa la
concentrazione di O2-•
Funziona in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
CATALASI (CAT)
2 H2O2
2 H2O + O2
E’ una eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC
Insieme alla SOD permette la rapida detossificazione del O2-•
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px)
2 H2O2
2 H2O + O2
ROOH
ROH + H2O
2 GSH
GSSG
GLUTATIONE REDUTTASI
NADP+
NADPH2
E’ una Se-proteina presente nel citosol.
E’ il principale detossificatore di H2O2 della cellula.
SISTEMI ANTIOSSIDANTI NON ENZIMATICI
Acido ascorbico (vitamina C)

Sostanza a basso peso molecolare, idrofila, esogena
•
 Scavenger nei confronti di vari radicali (HO•, ROO• e O2 )
 Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E
HO
O
OH
O
OH
OH
Acido urico

Sostanza a basso peso molecolare, idrofila
 Potente scavenger contro vari ossidanti (HO•,O2*, O3,HClO)
 Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu)
 Previene l’ossidazione Fe-dipendente dell’ascorbato
OH
N
N
OH
HO
N
N
H
Acido lipoico

Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila
 Scavenger nei confronti di vari ossidanti (HO•, O2*, HClO)
 Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu)
 Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E
SH
SH
Forma ridotta (attiva)
S
COOH
S
Forma ossidata
COOH
Caroteni e xantofille

Sostanze lipofile contenute in frutta e verdure
 Quencher dell’ossigeno singoletto (O2*)
 Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO•)
CH3
CH3
CH3
CH3
C
CH
CH2
C
CH2
C
CH2
CH3
C
CH
CH
CH
C
CH
CH
CH
CH
CH
CH
C
CH3
CH3
b-carotene
CH
CH
CH
C
CH3
CH
CH2
C
CH2
C
CH2
C
CH3
CH3
Tocoferoli (vitamina E)

Potenti antiossidanti lipofili
 Doppia azione (chain breaker e scavenger)
 Oltre a quella antiossidante, esibiscono altre attività biologiche
CH3
C
HO
C
C
CH2
C
C
C
H3C
CH2
C
CH3
O
CH3
CH3
CH2
CH2
CH3
CH
CH2
CH2
CH2
CH3
CH
CH2
CH2
CH2
CH
CH2
CH3
Tocoferoli (vitamina E)
Effetti diversificati a livello delle membrane cellulari
Coenzima Q10

Sostanza lipofila a basso peso molecolare
 Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO•)
 Consente la rigenerazione dei tocoferoli
O
H3CO
CH3
CH3
(CH2 – CH = C – CH2)10H
H3CO
O
Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E
nell’inibizione della perossidazione lipidica
L–H
Fe3+ O2
UQH2
INIZIO
L•
Fe3+ H2O2
UQ•
O2
PROPAGAZIONE
LOO•
L–H
UQH2
E – OH
E–O
L•
LOOH
UQ•
A• UQ•
AH- UQH2
Polifenoli e flavonoidi
 Ampia
classe di sostanze naturalmente occorrenti in natura
 Comprendono antociani ed antoxantine (frutta e verdura)
•
 Azione scavenger nei confronti dei radicali HO• e O2
 Possibile azione anti-aterogena
O
OH
O
Agenti chelanti
Chelanti naturali
OH-
R-O-O-H
(Alchil)idroperossido
Fe2+
R-O-O•
Radicale (idro)perossile
Farmaci chelanti
R-O•
X
H+
Radicale alcossile
Fe3+
X
R-O-O-H
(Alchil)idroperossido
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
NON ENZIMATICI
PROTEINE -SH:
Agiscono principalmente come antiossidanti plasmatici.
Acquistano un e- dando vita ad un radicale sulfidrilico (-S•) più stabile.
Il GSH è abbondante
nel citosol, nel nucleo
e nei mitocondri ed è
presente anche a
livello plasmatico.
Può reagire anche
non enzimaticamente
con radicali (ONOO-,
tocoferile, ascorbile).
RUOLO DELL’OMOCISTEINA
E’ un aa sulfidrilico, prodotto intermedio del metabolismo della Met.
I livelli plasmatici di tale aa sono regolati da due vie metaboliche:
1)può essere ri-metilata a Met in una reazione catalizzata dalla metionina sintasi e
dipendente da 5-metiltetraidrofolato (donatore di –CH3) e viamina B12 (co-fattore),
2)può subire essere trasformata in S-adenosil-metionina (SAM) e rimossa dal
circolo in un processo vit. B6-dipendente che porta alla produzione di cisteina.
OMOCISTEINA E STRESS OSSIDATIVO
Ruolo dell’omocisteina come marcatore e stimolo di stress ossidativo:
lo stress ossidativo può causare la deplezione dei folati e danneggiare il
metabolismo della Met con conseguente iperomocisteinemia.
OMOCISTEINA E STRESS OSSIDATIVO
Livelli Omocisteina plasmatica:
Livelli normali: 5-15 µmol/L;
Moderata Omocisteinemia: 16-30 µmol/L
Alta Omocisteinemia: 30-100 µmol/L
Severa Omocisteinemia: >100 µmol/L.
Fattore di rischio indipendente per le patologie cardiovascolari
(ogni incremento di 5µmol/L: aumento del rischio cardiovascolare del 20%).
Possibili meccanismi d’azione nel promuovere il danno endoteliale:
stimola la formazione di ROS e promuove lo stress ossidativo,
induce l’ossidazione delle lipoproteine LDL,
aumenta l’adesione e l’aggregazione piastrinica (formazione di trombi)
E’ fondamentale che vi sia un giusto EQUILIBRIO tra ROS e antiossidanti!
Quando la produzione di radicali liberi è
eccessiva si genera una condizione nota come
STRESS OSSIDATIVO.
I sistemi enzimatici e gli antiossidanti
intracellulari non riescono più a far fronte alla
sovrapproduzione e i radicali liberi generano
danno cellulare che può essere:
-reversibile o
-irreversibile
con conseguente morte cellulare
(apoptosi o necrosi).
Lo STRESS OSSIDATIVO è indotto da un eccesso di ROS in seguito a:
loro aumentata produzione e/o
ridotta efficienza dei sistemi di difesa antiossidante.
Danno cellulare
(invecchiamento
e malattie)
Protezione
dalle malattie
Antiossidanti
Radicali Liberi
ROTTURA DI UN EQUILIBRIO
STRESS OSSIDATIVO: conseguenza di uno squilibrio tra processi
proossidanti e processi antiossidanti.
Radiazioni, farmaci, metalli pesanti
Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento
Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà
infezioni ed altre malattie
Specie reattive
Ridotta assunzione,
e/o diminuita sintesi,
e/o ridotta capacità di utilizzazione
Difese antiossidanti
DANNO CELLULARE
Malattie
cardiovascolari
Demenza,
M. di Parkinson
Invecchiamento
precoce
Infiammazioni,
Tumori
Altre
malattie
STRESS OSSIDATIVO
INFIAMMAZIONE
PATOLOGIE
Infiammazione acuta
ROS
ROS
Stress ossidativo
ROS
Infiammazione cronica
Patologie
STRESS OSSIDATIVO E ATEROSCLEROSI:
Le cause vascolari rappresentano il principale fattore eziologico (afflusso
arterioso e/o deflusso venoso) di infertilità
Radicali liberi e lipoperossidi esercitano un effetto lesivo sulla membrana delle
cellule endoteliali.
Caratterizzata da:
 modificazione delle lipoproteine plasmatiche (ox delle LDL) con accumulo di
colesterolo nei macrofagi e loro trasformazione in cellule schiumose
(placca ateromatosa).
STRESS OSSIDATIVO E DIABETE
La glicazione o glicosilazione non enzimatica (proteina + zucchero)
può essere indotta dai ROS.
Il processo di glicazione determina la formazione, reversibile, di prodotti precoci
della glicosilazione (basi di Shiff e prodotti di Amadori come ad es. HbA1c).
Emoglobina glicata (HbA1c): hb esposta ad una elevata [glucosio plasmatico].
La glicosilazione dell’hb è associata allo sviluppo di malattie cardiovascolari,
nefropatie e retinopatia del diabete mellito
(monitoraggio di HbA1c nei pz con diabete I).
STRESS OSSIDATIVO E DIABETE
In condizioni ossidative e in presenza di ROS questi prodotti precoci subiscono lenti
riarrangiamenti che portano alla formazione di prodotti avanzati della glicazione
(AGEs), che tendono ad accumularsi nei tessuti di pz diabetici.
Gli AGEs possono inoltre generare stress ossidativo.
IPERGLICEMIA,ENDOTELIO E STRESS
OSSIDATIVO
L’endotelio produce due importanti molecole, dotate di funzioni opposte:
 ossido nitrico
esercita un’azione antitrombotica, anticoagulante, fibrinolitica,
antinfiammatoria, antiaterogena.
 endotelina-1
esercita un’azione protrombotica, procoagulante,
antifibrinolitica, proinfiammatoria, aterogena.
In condizioni di normalità prevalgono la produzione e gli effetti
dell’ossido nitrico
Nel diabete prevalgono la produzione e gli effetti della endotelina1 (disfunzione endoteliale)
Endothelium
R
ET-1
ETB
-
R
NOS
NO
ETA
L-arginine
-
?
O
2
?
-
EDHF
ETB
CONTRACTION
Smooth Muscle cells
R
RELAXATION
RELAXATION
Attività vasocostrittrice, Alterata permeabilità, Maggiore proliferazione
cellulare, Attività procoagulante, Attività antifibrinolitica, Maggiore
aggregazione piastrinica
Endothelium
Iperglicemia
Dislipidemia
Stress ossidativo
Fumo,ipertensione
Insulino-resistenza
Fattori genetici
Smooth Muscle cells
CONTRACTION
vasocostrizione
CONTRACTION
Infiammazione
fibrinolisi
CONTRACTION
Coagulazione
Diabete
Antiossidanti:
distribuzione negli alimenti
E' stata stabilita una misura del potere antiossidante dei vegetali, ed è
stata definita una unità di misura, cui è stato dato il nome di
ORAC
(oxigen radical absorbance capacity)
 I cibi sono stati suddivisi in tre gruppi, a seconda del loro potere
antiossidante
Alimenti con 200 ORAC a porzione
Nel primo gruppo sono inclusi i cibi che apportano circa 200 unità ORAC
per porzione:
 Albicocche 3 = 172 unità
 Melone tre fette = 197 unità
 Pera 1 = 222 unità
 Pesca 1 = 248 unità
 Banana 1 = 223 unità
 Mela 1 = 301 unità
 Melanzana 1 = 326 unità
 Cetrioli 1 = 360 unità
 Pomodoro 1 = 116unità
 Spinaci crudi 1 piatto = 182 unità
Valore suscettibile di variazione a seconda del clima, terreno di coltura, tipo di
trattamento, varietà…
Alimenti con 500 ORAC a porzione
Nel 2° gruppo sono compresi alimenti che apportano circa 500 unità per
porzione :
 Avocado 1 = 571 unità
 Kiwi 1 = 458 unità
 Uvetta nera 1 cucchiaio = 396 unità
 Cipolla 1 = 360unità
 Cavolfiore cotto una tazza = 400 unità
 Peperone 1 = 529 unità
 Susina 1 = 626 unità
 Patata arrosto 1 = 575 unità
 Uva nera 1 grappolino = 569 unità
 Uva bianca 1 grappolo = 357 unità
 Fagiolini cotti una tazza = 404 unità.
Valore suscettibile di variazione a seconda del clima, terreno di coltura, tipo di
trattamento, varietà…
Alimenti con 1200 ORAC a porzione
Nel 3° gruppo sono compresi gli alimenti più ricchi
di antiossidanti (1200 unità per porzione):
 Fragole una tazza = 1170 unità
 Prugne nere 3 = 1454 unità
 Arancia 1 = 983 unità
 More 1 tazza = 1466 unità
 Barbabietola cotta 1 tazza = 1782 unità
 Succo di pompelmo 1 bicchiere = 1274 unità
 Pompelmo rosa 1 = 1188 unità
 Succo di arancia 1 bicchiere = 1142 unità
 Cavoli di Bruxelles cotti 1 tazza = 1384 unità
Valore suscettibile di variazione a seconda del clima, terreno di coltura, tipo di
trattamento, varietà…
Antiossidanti:
accorgimenti
 Per mantenersi in forma, ogni persona dovrebbe introdurre una
quantità di antiossidanti pari a 5000 unità al giorno.
 E' essenziale mangiare il più possibile crudo o poco cotto (la
cottura riduce o distrugge il potere antiossidante).

GLI ORTAGGI E LA FRUTTA CONSUMATI SUBITO
DOPO
ESSERE STATI RACCOLTI E CRUDI, OFFRONO LA MASSIMA
UTILIZZAZIONE
DEL
LORO
CONTENUTO
VITAMINICOANTIOSSIDANTE.

QUINDI E’ DI ESTREMA IMPORTANZA UNA CORRETTA
CONSERVAZIONE E UN’ADEGUATA COTTURA DEGLI ALIMENTI.
RIDUZIONE DEL CONTENUTO VITAMINICO
 IL CONTENUTO VITAMINICO DI UN ALIMENTO PUO’ RIDURSI O
ANNULLARSI PER:
1. ESPOSIZIONE ALL’ARIA (VITAMINE OSSIDABILI A, C, E, B9)
2. EFFETTO DEL CALORE (VITAMINE TERMOLABILI DEL GRUPPO
B)
3. CONTATTO CON L’ACQUA (VITAMINE IDROSOLUBILI, C )
Perdita di vitamina C
Esempio della facilità con cui la vitamina C va incontro ad ossidazione
nel tempo per cui si ha una diminuzione della sua concentrazione in
un alimento. 100 g di patate forniscono circa 15-20 mg di vitamina C.
Patate
Dopo 1-3 mesi
Perdita % del
fresco
33
Dopo 4-5 mesi
50
Dopo 6-7 mesi
66
Dopo 8-9 mesi
75
Epicatechina
Epigallocatechina
estratti antiossidanti del te’ verde (GTE)
Epicatechina gallata
Epigallocatechina
gallata
I colori dei fitocomposti
Colore
Vegetali
Fitocomposti
Azione
Rosso
Pomodoro, radicchio, anguria,
lampone, ribes
Licopene
antocianine
Prevengono le MCV,
tumori, proteggono i vasi
sanguigni
Gialloarancione
Zucca, carota, peperone, kaki,
nespola, albicocca, pesca,
arancia, pompelmo
Carotenoidi vari
Riducono le MCV, forme
tumorali, proteggono la
vista, favoriscono la
funzione immunitaria
Verde
Asparagi, broccoli, cavoli,
cicorie, lattuga, rucola, spinaci,
kiwi
Luteina
Carotenoidi
glucosinolati
Blu-viola
Frutti di bosco, mirtillo
melanzane, prugne, radicchio,
uva nera
Antocianine,
proantocianidine
polifenoli
Riducono il rischio di
alcune forme tumorali e
prevengono la fragilità
capillare
Bianco/
Verde chiaro
Aglio, cavolfiore, cipolla,
finocchio, porri, sedano, mela,
pera, banana
Quercitina,
Composti solforati
(glucosinolati)
Riducono il rischio di
alcune forme tumorali,
sono efficaci
antinfiammatori
Riducono il rischio di
tumori, di malattie vacolari,
proteggono la vista
E’ buona regola consumare tutti i giorni almeno 5 porzioni di frutta e verdura dei diversi colori
ANALISI BIOCHIMICHE EMATICHE
•
Antiossidanti liposolubili plasmatici:
carotenoidi (luteina, licopene, a e b-carotene)
vitamina A (retinolo)
vitamina E (d, g, a-tocoferolo)
•
Marcatori plasmatici di danno ossidativo:
lipoproteine a bassa densità ossidate (LDLox)
omocisteina
•
Indici plasmatici di infiammazione:
interleuchina 6 (IL-6)
fattore di necrosi tumorale (TNF-a)
leucotriene B4 (LTB4)
prostaglandina E2 (PGE2)
tromboxano B2 (TBX2)
ROM test
Reactive Oxygen Metabolites
ROM TEST: PRINCIPIO
I ROM (idroperossidi, ROOH), presenti nel campione biologico da analizzare, in
presenza di Fe (liberato dalle proteine plasmatiche da un tampone acido, R2)
generano, per la reazione di Fenton, radicali alcossilici e perossilici che, reagendo
con un’ammina aromatica sostituita (contenuta in una miscela cromogena, R1),
ossidano quest’ultima trasformandola in un derivato di colore rosa.
Tale derivato viene quantificato fotometricamente.
L’intensità del colore sviluppato è direttamente proporzionale alla concentrazione
dei ROM (legge di Lambert-Beer).
BAP test
Biological Antioxidant Power
BAP TEST: PRINCIPIO
Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+) complessati ad un
cromogeno (colorata), di decolorarsi quando gli ioni Fe3+ sono ridotti a Fe2+ come
accade se si aggiunge ad esso un sistema riducente (antiossidante).
Il campione di plasma da analizzare viene disciolto in una soluzione colorata
ottenuta aggiungendo una fonte di ioni ferrici (FeCl3, R2) ad un cromogeno
(tiocianato, reagente R1). Dopo incubazione la soluzione si decolora:
più la decolorazione è marcata più il plasma avrà ridotto gli ioni Fe3+ inizialmente
presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico.
MDA (Malonildialdeide)
L’MDA, indice di ossidazione lipidica, è un sottoprodotto della perossidazione
lipidica formata dalla β-scissione dei PUFA. E’ comunemente misurata dalla
derivatizzazione con TBA che dà un composto di colore rosso.
Rivelazione nel visibile a 532 nm o in fluorescenza a 515-553 nm.
Analisi in HPLC a fase inversa dopo reazione con TBA.
MDA
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
MDA
Curva standard (TEP)
200000
Cromatogramma a 532 nm (MDA 6’-7’)
MDA (µM) =[Area-1598.6]/34979.2
180000
160000
140000
Area picco
120000
Valore normale di
riferimento <1 µM
100000
80000
60000
40000
20000
0
0
1
2
TEP (µM)
3
4
5
ox-LDL
L’ossidazione delle lipoproteine LDL rappresenta una delle cause dell’aterosclerosi.
LDL
~ 2/3 vengono rimosse dal circolo mediante il legame con recettori specifici
1/3 rimane in circolo per diversi giorni in caso di aumento della permeabilità
endoteliale, le LDL circolanti possono infiltrarsi nell’intima del vaso e legarsi alle
proteine della matrice.
Vanno incontro così a reazioni di ossidazione e glicosilazione, che ne determinano
modificazioni conformazionali.
Le LDL ossidate (oxLDL)
esercitano attività
pro-infiammatoria e
pro-trombotica.
RUOLO DEGLI ANTICORPI ANTI-OXLDL
Durante l’ossidazione, le lipoproteine LDL vanno incontro ad alterazioni strutturali
che le rendono antigeniche e portano alla formazione di ab anti LDL ossidate.
Tali anticorpi possono essere misurati nel siero e rispecchiano l’insorgenza dei
processi di ossidazione in vivo.
Ab IgG per le oxLDL: associati a proprietà pro-aterogeniche,
Ab IgM per le oxLDL: svolgono un ruolo protettivo.
Pz con sindrome coronarica acuta (tra cui infarto al miocardio), presentano livelli
più elevati di anticorpi anti oxLDL vs i controlli.
Tuttavia alcuni studi hanno messo in dubbio il loro contributo nell’aterogenesi.
LDLox
La misura dei livelli di LDLox si effettua in maniera diretta, su campioni di plasmaEDTA, mediante l’utilizzo del saggio ELISA (sandwich) che si basa sull’utilizzo di
micropiastre, nelle quali è adeso un ab specifico (ab 1ario) diretto contro l’ag da
ricercare.
Nei pozzetti vengono aggiunti standard, controlli e campioni; segue una I°
incubazione (1h, RT) durante la quale l’ag (LDL ox), si lega in maniera specifica
all’ab.
Dopo un I° lavaggio, viene aggiunto un ab 2ario coniugato con la perossidasi che si
lega al complesso ab-ag (riconosce l’ag) e forma un triplo strato (sandwich). Segue
una II° incubazione (1h, RT), un ulteriore lavaggio e l’aggiunta di tetrametilbenzidina
(TMB), quale substrato della perossidasi.
Infine viene aggiunta una soluzione acida che blocca la reazione tra perossidasi e
TMB, la quale ha generato un prodotto di colore giallo.
L’intensità del colore, misurata spettrofotometricamente a 450 nm, è direttamente
proporzionale alla concentrazione di LDL ox presenti nel campione.
Sandwich ELISA
HRP
LDLox
2,4
2,2
LDLox (ng/ml)=(Abs
-0.356)/0.00692
450
2,0
1,8
1,6
Abs 450 nm
La concentrazione di LDLox presente nei
campioni, espressa in ng/mL, è ricavata
dalla curva di taratura ottenuta utilizzando
standards a concentrazioni note.
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
50
100
150
LDLox (ng/ml)
200
250
300
LDLox: Range di riferimento
Range di riferimento:
90 e 128 ng/ml
Media:
115±12 ng/ml
AOPP
Advanced Oxidation Protein Products
AOPP: prodotti dell’ox avanzata delle
proteine, proposti come nuova classe di
mediatori dell’infiammazione in grado di
attivare neutrofili, monociti, linfociti.
Inoltre interferiscono con il metabolismo
delle HDL svolgendo un ruolo nello
sviluppo di malattie cardiovascolari.
Comprendono:
1)di-tirosina, derivante dall’ox di residui aa
di tyr presenti nelle proteine circolanti
(albumina),
2)pentosidina, derivante dalla glicazione
proteica connessa allo stress ossidativo,
3)carbonili, derivanti dall’ox delle proteine
catalizzata da metalli di transizione.
Dosaggio spettrofotometrico a 340 nm in
seguito a reazione del plasma con acido
acetico e KI.
TIOLI TOTALI
I gruppi tiolici plasmatici (gr. SH
delle proteine e del GSH) sono
molecole antiossidanti
idrosolubili che hanno la capacità
di contrastare le reazioni di
propagazione radicalica e di
neutralizzare l’azione del
radicale ossidrile.
Dosaggio spettrofotometrico a 412
nm dopo reazione con l’acido 5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB).
I gruppi tiolici (-SH) della barriera antiossidante plasmatica prevengono il danno
ossidativo cellulare bloccando i ROS nel sangue.
ROS
-SH
Altri gruppi chimici
Esiste una correlazione diretta tra quantità di Acido Ascorbico e qualità del liquido
seminale e questo costituisce una base per una terapia vitaminica dei pz.
30
R
P
---------------------------------------0,71929
- 3,51095E-4
28
60
24
80
20
18
Morfologia
40
30
16
14
12
10
8
20
6
4
10
2
0
0
-10
50
100
150
200
R
P
-------------------------------0,63373
0,0027
22
50
Motilita totale (%)
100
250
300
350
400
450
Vitamina C (µM)
Motilità totale % vs Concentrazione Vit.C
60
6
70
26
R
P
----------------------------------0,95857
<0.000
1
Concentrazione (10 /ml)
80
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Vitamina C (µM)
Morfologia vs Concentrazione Vit.C
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Vitamina C (µM)
Concentrazione spermatozoi vs Concentrazione Vit.C
VITAMINA C
L’acido ascorbico è una vitamina
idrosolubile che si ossida facilmente,
per questo il plasma eparinato deve
essere trattato subito dopo il prelievo
con un agente deproteinizzante
(TCA, MPA, metanolo).
Preparazione:
100 µl plasma + 400 µl metanolo
Vortex 20 sec
Centrifuga 10 min a 10000g a 4°C
20 µl surnatante in HPLC
HPLC:
Colonna C18 250 mm x 4.6 mm; 5 µm
Fase mobile: metanolo 5% in NaH2PO4 25 mM pH 4.8
Flusso 0.5 ml/min
Detector UV 265 nm
VITAMINA C
Curva standard
Cromatogramma a 265 nm
200000
Vitamina C (µM) = (Area-56461) / 604
(Vitamina C 6’)
180000
Area picco
160000
140000
120000
100000
Range di riferimento
43-57 µM
80000
60000
20
40
60
80
100
120
140
Acido ascorbico (µM)
160
180
200
220
CATALASI (RBC)
Enzima antiossidante localizzato principalmente nei perossisomi (elevate
concentrazioni nel fegato). E’ una metalloproteina il cui gr. prostetico (Fe) ha la
funzione di decomporre il perossido di idrogeno ad acqua e ossigeno:
0,7
Assorbimento H 2O 2 230 nm
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
1
2
3
Tempo (minuti)
4
5
GPx (RBC) GLUTATIONE PEROSSIDASI
E’ una metalloproteina contenente Se, localizzata sia a livello della membrana
cellulare che a livello extracellulare. A seconda delle varie isoforme agisce
riducendo sia il perossido di idrogeno (a) che i perossidi lipidici (b) degli acidi grassi
e dei fosfolipidi con contemporanea ossidazione del GSH a GSSG:
La rigenerazione di GSH avviene per
opera di una glutatione reduttasi (GR) con
contemporanea ossidazione del NADPH a
NADP+ (c):
0,7
Assorbimento NADPH 340 nm
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
1
2
3
4
5
6
Tempo (minuti)
7
8
9
10
GLUTATIONE O GSH (RBC)
E’ un tripeptide con proprietà
antiossidante.
Protegge gli RBC dall’ossidazione
(emolisi).
Elemento importante per il suo
funzionamento è il NADPH, cofattore
ossido-riduttivo dell’enzima GR il quale
rigenera il GSH attraverso gli e- ceduti
dal NADPH che vengono trasferiti sul
GSSG.
ALTRI BIOMARCATORI
F2-Isoprostani: sintetizzati in vivo in seguito a perossidazione lipidica dell’AA da parte dei
ROS. Una volta liberati dalle membrane, gli isoprostani raggiungono diversi liquidi biologici
(plasma), dove persistono grazie alla loro abbondanza e stabilità chimica e successivamente
eliminati nelle urine. Dosaggio ELISA.
Carbonili: prodotti precoci dell’ox proteica (azione di metalli, glicazione, legami con aldeidi).
In seguito all’attacco dei ROS i residui aa che formano i derivati carbonilici sono lisina,
arginina, prolina, treonina, acido glutamico e istidina. Le modificazioni ossidative che danno
origine ai gr. carbonilici causano perdita delle funzioni catalitiche e strutturali.
Dosaggio spettrofotometrico a 370 nm in seguito a reazione del plasma con
dinitrofenilidrazina (DPNH) o dosaggio ELISA.
8-OHdG (8-Idrossideossiguanosina): la deossiguanosina è un costituente del DNA. Se
ossidata si trasforma in 8-OHdG e viene eliminata attraverso le urine. L'analisi evidenzia un
danno ossidativo estremo, tale da alterare, dopo membrana cellulare e nucleare, perfino gli
acidi nucleici. Oncologia: il dato espresso dall'8-OhdG esprime in maniera sensibile il turnover cellulare ed è quindi capace di valutare l'aggressività distruttiva tumorale.
Medicina del lavoro: i livelli di 8-OhdG possono valutare il grado di esposizione dei lavoratori
per alcune sostanze tossiche. Dosaggio ELISA.
PARAOXONASI I (PON-1)
L’enzima PON 1 (enzima antiossidante) la cui attività paraoxonasica si valuta sui
campioni sierici attraverso dosaggio spettrofotometrico.
Il campione da analizzare viene sciolto in un buffer di TRIS-HCl 100 mM pH 8
contenente CaCl2 2 mM in presenza di Paraoxon (O,O-diethyl-O-pnitrophenylphosphate) quale substrato e incubato a 37°C per 30 secondi.
L’attività dell’enzima è analizzata mediante spettrofotometro a 412 nm monitorando
la quantità di Paraoxon idrolizzata enzimaticamente a p-nitrofenolo.
L’attività viene calcolata mediante coefficiente di estinzione molare (ε= 17000 M-1
cm-1) e i risultati espressi in U/L.
Una unità di attività di PON I è definita come 1 nmol di p-nitrofenolo formata per
minuto.
INTERLEUCHINA 1-BETA (IL-1 B)
L’ IL-1β è una citochina pro-infiammatoria, la cui determinazione quantitativa si
effettua su campioni sierici mediante l’utilizzo del kit EIA, che si basa sull’utilizzo
di un ab specifico per l’IL-1β, immobilizzato su micropiastre, in grado di legare l’IL1β presente negli standard e nei campioni.
Nei pozzetti viene aggiunto un Mab biotinilato in grado di legare il complesso abIL1β. Dopo una I° incubazione (3h, RT), lo standard, i campioni e l’ab in eccesso
vengono eliminati tramite lavaggio. Viene poi aggiunta una soluzione contenente
Streptavidina coniugata con Perossidasi di rafano, che si lega all’ab biotinilato.
Segue una II° incubazione (30’, RT), un lavaggio e l’aggiunta del substrato, che
porta alla formazione di un composto colorato.
Dopo breve incubazione la reazione enzimatica viene interrotta dall’aggiunta di
una stop solution e il colore generato viene letto a 450 nm.
La densità ottica misurata è direttamente proporzionale alla concentrazione di IL1β.
I valori di concentrazione di IL-1β dei campioni, espressi in pg/ml, sono estrapolati
dalla curva di taratura ottenuta utilizzando standards a concentrazioni note.
Sandwich ELISA
H
RP
CONCLUSIONI
I ROS giocano un ruolo importante nell’eziologia dell’infertilità maschile:
alti livelli sono stati riscontrati nel 25%-40%dei campioni di liquido seminale di uomini
infertili (Sharma et al, 2009) e per questo la loro quantificazione potrebbe essere un
valido strumento diagnostico nella pratica clinica.
Dai dati è emerso che i pz infertili, vs i controlli, presentano livelli di carotenoidi e
vitamina E più bassi e un accumulo di MDA nel plasma seminale.
Ciò correla negativamente con motilità e morfologia a conferma che nell’infertilità
maschile una iperproduzione di ROS indebolisce fortemente le difese antiossidanti del
plasma seminale creando una condizione di stress ossidativo che porta a scarsa
qualità del liquido seminale.
Insieme allo stress ossidativo seminale, di recente anche quello ematico è stato
proposto quale biomarker per la valutazione della qualità del liquido seminale, di
ausilio alle analisi di routine condotte sui semi.