Analisi biochimiche dei tessuti di piante sottoposte a stress ambientali

Assegno di ricerca con decorrenza dal 01/03/2011 al 29/02/2012
“Analisi biochimiche dei tessuti di piante sottoposte a stress ambientali”
(allegare il progetto dell’attività da svolgere):
Il programma di ricerca prevede la caratterizzazione fitochimica di specie sempreverdi mediterranee
e alla valutazione delle attività biologiche dei composti di natura antiossidante (in particolare
flavonoidi) in relazione alle condizioni ambientali e in particolare agli effetti di stress di natura
abiotica come luce e salinità. Tale caratterizzazione consentirà di approfondire le conoscenze sulle
cause di stress e sulle risposte metaboliche delle piante a condizioni avverse, mettendo in evidenza
se e come meccanismi di cross tolerance possono essere utilizzati per indurre nella pianta una
migliore capacità di minimizzare gli effetti negativi indotti da stress di natura biotica e abiotica.
Non ultimo tra gli obiettivi del progetto, l’individuazione di molecole o di estratti vegetali ad
elevata attività antiossidante da destinare ad ulteriori approfondimenti per un loro utilizzazione nella
prevenzione di patologie tumorali e cardiovascolari.
In particolare verrà condotta una classica ricerca inter-disciplinare che parte da una analisi accurata
delle caratteristiche morfo-anatomiche delle foglie – che soprassiedono l’efficienza dei meccanismi
di “avoidance”- fino ai cambiamenti nella espressione di geni implicati nella biosintesi dei
flavonoidi antiossidanti – che giocano un ruolo cruciale nel regolare la capacità di vari comparti
cellulari di contrastare le variazioni, indotte dalla luce, nella omeostasi redox cellulare.
I tratti morfologici di superficie saranno analizzati attraverso misure condotte in ESEM, attraverso
una datata collaborazione esistente con il Ce.M.E. Le modificazioni a livello sub-cellulare e
l’accumulo di H2O2, qui preso come uno dei markers di danno ossidativo, saranno analizzate
attraverso TEM (Tattini et al., 2005; Guidi et al., 2010).
La stima del danno ossidativo sarà conclusivamente valutata attraverso misure in vivo di
spettroscopia ESR condotta su foglie intatte (Melgar et al., 2009), attraverso la stima del segnale
radicalico a g = 2.002-2.004.
Il primo step relativo all’analisi delle difese antiossidanti attivate in risposta allo stress luminoso
sarà completato da misure delle attività di enzimi antiossidanti (SOD, CAT, APX, POD) e di
metaboliti antiossidanti quali acido ascorbico e tocoferolo (quest’ultimo attraverso analisi HPLCDAD).
Il secondo sistema antiossidante che sarà valutato riguarda i cosiddetti “carboidrati solubili”, e
primariamente nelle due specie in esame, mannitolo. Mannitolo svolge una azione antiossidante nel
metabolismo cellulare poiché è in gradi di limitare la generazione di radicali liberi, oltre ad essere
un efficace scavenger del radicale ossidrile (radicale libero che non può essere ridotto dagli enzimi
antiossidanti, Tattini et al., 1996).
Il terzo sistema di difese antiossidanti sotto analisi concerne i carotenoidi, e in particolare i pigmenti
del ciclo della violaxantina. Si valuteranno quindi le concentrazioni relative di carotenoidi e
clorofilla, e specificatamente la concentrazione di violaxantina, anteraxantina, e zeaxantina,
attraverso analisi HPLC-DAD. I carotenoidi non solo sono capaci di “ridurre” lo stato di tripletto
della clorofilla e quindi di limitare la produzione di ossigeno di singoletto, ma a concentrazioni
tipicamente riscontrate in foglie di sole, si comportano come effettivi antiossidanti del cloroplasto.
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Si analizzerà lo spettro polifenolico delle specie in esame attraverso HPLC-DAD. Le due specie
presentano una simile composizione flavonoidica, che consiste di flavonoli antiossidanti (derivati
della quercetina), flavoni antiossidanti (derivatio della luteolina 7-O) e flavoni non antiossidanti:
luteolina 4’-O-glucoside e derivati della apigenina 7-O).
Si valuterà l’espressione dei seguenti geni: F3’H, flavonoid-3’-idrossilase che è responsabile della
sintesi delle strutture orto-di-idrossilate nell’anello B dello scheletro flavonoidico, che conferisce
abilità antiossidante ai flavonoidi; FLS, flavonol sintase, che catalizza la sostituzione OH in
posizione 3, anello A dello scheletro. Tali analisi saranno condotte dal gruppo della Dr. Tegli del
Dip. di Biotecnologie Agrarie della Università di Firenze.
In aggiunta a queste misure si descriverà lo stato di stress luminoso effettivamente vissuto dalle
foglie, che sarà primariamente eseguito attraverso misure (1) di assimilazione netta della CO2 come
funzione della intensità esterna di luce foto sinteticamente attiva [saturazione della fotosintesi netta]
(2) di efficienza della fotochimica del foto sistema II (PSII), come stimata dalla analisi della
cinetica della fluorescenza della clorofilla a [da essere posta in relazione con sintesi di carotenoidi,
e misure di eccesso di energia di eccitazione che raggiunge il cloroplasto].
Data 16 dicembre 2010
Firma del Responsabile Scientifico_______________________
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