Gazzetta ufficiale delle Comunità europee
20 . 3 . 92
N. L 74/23
REGOLAMENTO (CEE) N. 690192 DELLA COMMISSIONE
del 19 marzo 1992
che definisce un metodo di riferimento per individuare la caseina di latte
vaccino nei formaggi prodotti con latte di pecora
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica
europea,
visto il trattato d'adesione della Spagna e del Portogallo, in
particolare l'articolo 67, paragrafi 1 e 2, l'articolo 98, l'arti­
colo 234, paragrafo 2 e l'articolo 310,
visto il regolamento (CEE) n. 1677/85 del Consiglio,
dell' I 1 giugno 1985, relativo agli importi compensativi
monetari nel settore agricolo ('), modificato da ultimo dal
regolamento (CEE) n. 2205/90 (2), in particolare l'articolo
1 , paragrafo 1 ,
visto il regolamento (CEE) n. 804/69 del Consiglio,
importi compensativi adesione e esclusa dagli scambi di
formaggi a base di latte di pecora da e verso la Spagna ai
sensi del regolamento (CEE) n. 466/86 del Consiglio, del
25 febbraio 1986, che stabilisce le norme generali del
regime degli importi compensativi adesione nel settore
del latte e dei prodotti lattiero-caseari a seguito dell'ade­
sione della Spagna (8), dal regolamento (CEE) n. 3640/90
del Consiglio, dell'I 1 dicembre 1990, che stabilisce le
norme generali del regime degli importi compensativi
adesione nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari
durante la seconda tappa dell'adesione del Portogallo (9) ;
considerando che attualmente la Commissione ha effetti­
vamente adottato le disposizioni di cui sopra per quanto si
riferisce ai formaggi a base di latte di pecora, per cui è
necesssario verificare mediante controlli adeguati che nei
prodotti in questione non è stato aggiunto latte vaccino ;
del 27 giugno 1968, relativo all'organizzazione comune
che è necessario definire un metodo di riferimento comu­
dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero­
nitario atto a individuare la presenza di latte vaccino, salvo
restando l'impiego dei metodi correnti, se conformi a certi
caseari (3), come dall'ultima modifica del regolamento
(CEE) n. 374/92 (4), in particolare l'articolo 9, paragrafo 3,
l'articolo 14, paragrafo 7 e l'articolo 17, paragrafo 4,
visto il regolamento (CEE) n. 876/68 del Consiglio, del
28 giugno 1968, che stabilisce, nel settore del latte e dei
prodotti lattiero-caseari, le norme generali relative alla
concessione delle restituzioni all'esportazione e ai criteri
per la fissazione del loro ammontare (% modificato da
ultimo dal regolamento (CEE) n. 1344/86 (% in particolare
criteri ;
considerando che il comitato di gestione per il latte e i
prodotti lattiero-caseari non ha emesso alcun parere nel
termine fissato dal suo presidente,
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO :
l'articolo 6, paragrafo 3,
Articolo 1
considerando che i formaggi prodotti esclusivamente da
latte di pecora sono soggetti a talune norme specifiche nel
quadro dei regolamenti comunitari nel settore agricolo ;
che, prima dell'applicazione di queste norme, è necessario
verificare che il prodotto in questione non contenga latte
vaccino ;
considerando che è possibile concedere un aiuto all'am­
masso privato di formaggi a base di latte di pecora ai sensi
del regolamento (CEE) n. 508/71 del Consiglio,
Per verificare che il formaggio da produrre obbligatoria­
mente con solo latte di pecora non contenga caseina di
latte vaccino deve essere applicato il metodo d'analisi di
riferimento che figura nell'allegato.
Si considera che la caseina di latte vaccino è presente se il
tenore apparente di caseina di latte vaccino nel campione
da analizzare è pari o superiore al tenore del campione di
riferimento descritto nell'allegato.
dell'8 marzo 1971 , che stabilisce le norme generali per la
concessione di aiuti all'ammasso privato di formaggi a
lunga stagionatura (J) ; che, a norma del regolamento
(CEE) n. 876/68, può essere prevista una speciale restitu­
zione per questi stessi prodotti ; che, a norma del regola­
mento (CEE) n. 1677/85 del Consiglio, nessun importo
compensativo monetario viene imposto agli scambi di
prodotti a base di latte di pecora ; che l'imposizione di
(')
0
0
(4)
(*)
GU
GU
GU
GU
GU
n.
n.
n.
n.
n.
L
L
L
L
L
164 del 24. 6. 1985, pag. 6.
201 del 31 . 7. 1990, pag. 9.
148 del 28. 6. 1968, pag. 13.
41 del 18. 2. 1992, pag. 9.
155 del 3. 7. 1968, pag. 1 .
(é) GU n. L 119 dell'8. 5. 1986, pag. 36.
O GU n. L 58 dell' I 1 . 3. 1971 , pag. 1 .
Articolo 2
I metodi correnti per individuare la caseina di latte
vaccino nei formaggi a base di latte di pecora possono
essere usati nelle seguenti condizioni :
— il limite di rivelazione non deve essere superiore a
0,5% ;
— non si devono avere risultati falso-positivi. Se ciò
avviene, qualsiasi campione che dia un risultato dovrà
essere analizzato col metodo di riferimento ;
(8) GU n. L 53 dell' i . 3. 1986, pag. 23.
M GU n. L 362 del 27. 12. 1990, pag. 3.
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— la caseina di latte vaccino deve essere individuabile
con la precisione necessaria persino dopo i lunghi
periodi di maturazione consueti in commercio. Se
detto requisito non viene rispettato per un certo tipo
di formaggio a base di latte di pecora, quest'ultimo
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Articolo 3
Il presente regolamento entra in vigore, il terzo giorno
successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale
delle Comunità europee.
dovrà essere analizzato col metodo di riferimento.
Esso si applica a decorrere dal 16 settembre 1992.
Il presente regolamento e obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile
in ciascuno degli Stati membri.
Fatto a Bruxelles, il 19 marzo 1992.
Per la Commissione
Ray MAC SHARRY
Membro della Commissione
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N. L 74 25
ALLEGATO
METODO DI RIFERIMENTO PER INDIVIDUARE LA CASEINA DI LATTE BOVINO IN FORMAGGI PRODOTTI
CON LATTE DI PECORA
1.
Oggetto
Ricerca della caseina di latte bovino in formaggi prodotti con latte di pecora mediante focalizzazione isoelettrica delle
y-caseine, previa plasminolisi.
2.
Campo d'applicazione
Il metodo serve a individuare in modo sensibile e specifico la caseina di latte vaccino in formaggi freschi e stagionati prodotti
con latte di pecora.
3.
Principio del metodo
3.1 .
Isolamento della caseina dal formaggio.
3.2.
Solubilizzazione della caseina isolata ed azione plasminica sulla stessa (EC 3.4.21.7).
3.3.
Focalizzazione isoelettrica della caseina trattata con plasmina in presenza di urea e colorazione delle proteine con Coomassie
Brilliant Blue G-250.
3.4.
. Determinazione dei profili della y2-caseina (prova della presenza di latte bovino) confrontando il profilo del campione con
quelli ottenuti sullo stesso gel a partire da standard contenenti lo 0 % e l' I % di latte bovino.
4.
Reattivi
Se non è indicato altrimenti, devono essere usate reattivi chimici con grado di purezza analitica. L'acqua deve essere bidistil­
lata o di purezza equivalente.
Nota : I particolari che seguono si riferiscono a gel di poliacrilamide contenenti urea, aventi dimensioni 265 x 125 x 0,25
mm, prodotti in laboratorio. Se si usano gel di dimensioni e tipi diversi, le condizioni di separazione devono essere modificate.
Focalizzazione isoelettrica
4.1 .
Reattivi per la produzione di gel di poliacrilamide contenenti urea
4.1.1 .
Soluzione madre di gel
Sciogliere :
4,85 g di acrilamide
0,15 g di N,N'-metilen-bis-acrilamide (BIS)
48,05 g di urea
12,22 g di glicerol (all'87 % p/p)
in acqua e portare a 100 mi conservando poi in frigorifero in una bottiglia di vetro scuro.
Nota : È preferibile usare una soluzione pronta di acrilamide/BIS, disponibile in commercio, invece di pesare le quantità
delle singole acrilamidi neurotossiche. Qualora una siffatta soluzione contenga il 30 % p/v di acrilamide e lo 0,8 % p/v di
BIS, per la formulazione sarà necessario usare un volume di 16,2 mi invece del peso prestabilito. La conversabilità massima
della soluzione madre è di 10 giorni ; se la sua conduttività è superiore a 5 μS, deionizzare mediante agitazione con 2 g di
Amberlite MB-3 per 30 minuti, quindi filtrare attraverso una membrana di 0,45 μm.
4.1.2.
Soluzione di gel
Preparare una soluzione di gel mescolando additivi e anfoliti con la soluzione madre di gel (vedi 4.1.1).
9,0 mi di soluzione madre
24 mg di 6-alanina
500 *U di anfolita pH 3,5-9,5 (')
500 |μl di anfolita pH 6-7 (l).
Miscelare la soluzione di gel e degassare per 2 o 3 minuti in un bagno ad ultrasuoni o sotto vuoto.
Nota : Preparare la soluzione di gel immediatamente prima di versarla (vedi 6.2).
(') I prodotti Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) e Servalyt pH 6-7 (Serva) si sono dimostrati particolarmente idonei per ottenere la separazione di y-ca­
seine richiesta.
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4.1.3.
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Soluzioni dei catalizzatori
Persolfato di ammonio (PER) al 40 % p/v : sciogliere 800 mg di PER in acqua e portare a 2 mi.
N,N,N'N'-tetrametilendiamina (TEMED).
Nota : Usare sempre una soluzione di PER preparata di recente.
4.2.
Fluido di contatto
Cherosene oppure paraffina liquida
4.3.
Soluzione anodica
Portare 5,77 g di acido fosforico (all'85 % p/p) a 100 mi con acqua.
4.4.
Soluzione catodica
Sciogliere 2,00 g di idrossido di sodio in acqua e portare a 100 mi con acqua.
Preparazione del campione
4.5.
Reattivi per l'isolamento delle proteine
Diclorometano
Acido acetico diluito (25,0 mi di acido acetico glaciale portato a 100 mi con acqua).
Acetone.
4.6.
Tampone per la solubilizzazione delle proteine
Sciogliere :
5,75 g di glicerolo (all'87 % p/p)
24,03 g di urea
250 mg di ditiotreitolo
in acqua distillata e portare a 50 mi.
Nota : Conservare in frigorifero, conservabilità massima 1 settimana.
4.7.
Reattivi per l'attacco della caseina da parte della plasmina
4.7.1 .
Tampone di carbonato di ammonio
Titolare una soluzione di bicarbonato di ammonio 0,2 mol/1 (1,58 g/100 mi di acqua) con una soluzione di carbonato di
ammonio 0,2 mol/1 (1,92 g/ 100 mi di acqua) a pH 8.
4.7.2.
Plasmina bovina (EC. 3.4.21.7), attività minima 5 U/ml.
4.7.3.
Soluzione inibente l'enzima
Sciogliere 2,624 g di acido e-amminocapronico (acido 6-amino-n-esanoico) in 100 mi di etanolo al 40 % (v/v).
4.8.
Preparazione degli standard di coagulo presamico a partire da latte scremato di pecora contenenti lo 0 % e l' I % di latte
bovino.
Il latte scremato viene preparato centrifugando latte crudo di massa, ovino o bovino, a 37 0 C, a 2 500 g per 20 minuti. Dopo
aver rapidamente raffreddato il tubo e il contenuto a 6-8 °C, lo strato di grasso affiorato viene completamente allontanato. Per
la preparazione dello standard all'I % aggiungere 5,00 mi di latte bovino scremato a 495 mi di latte ovino scremato in un
bicchiere da 1 1, portare il pH a 6,4 mediante aggiunta di acido lattico diluito (al 10 % . p/v). Regolare la temperatura a 35 °C
ed aggiungere 100 |il di presame di vitello (attività del caglio, 1:10 000, circa 3 000 U/ml), agitare per 1 minuto e lasciare
quindi il bicchiere coperto con un foglio di alluminio a 35 ° C per 1 ora, in modo da consentire la formazione di cagliata. Una
volta formatasi quest'ultima, tutto il latte coagulato viene liofilizzato senza che sia necessario omogeneizzare previamente
oppure scolare il siero. Dopo la liofilizzazione, esso è finemente macinato in modo da produrre ua polvere omogenea.
Per la preparazione dello standard allo 0 %, ripetere lo stesso procedimento usando 500 mi di puro latte ovino scremato.
Nota : È consigliabile verificare la purezza del latte ovino mediante focalizzazione isoelettrica della caseina trattata con
plasmina prima della preparazione degli standard.
Reattivi per la colorazione della proteina
43.
Reattivo per la fissazione delle proteine
Sciogliere 150 g di acido tricloroacetico in acqua e portare a 1 000 mi.
4.10.
Soluzione decolorante
Portare 500 mi di metanolo e 200 mi di acido acetico glaciale a 2 000 mi con acqua distillata.
Nota : Preparare ogni giorno una soluzione decolorante fresca ; essa può essere preparata mescolando volumi eguali di solu­
zioni madre di metanolo al 50 % (v/v) e di acido acetico glaciale al 20 % (v/v).
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4.11 .
Soluzioni coloranti
4.11.1 .
Soluzione colorante (soluzione madre 1 )
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Sciogliere 3,0 g di Coomassie Brilliant Blue G 250 (C.L. 42655) in 1 000 mi di metanolo al 90 % (v/v) usando un agitatore
magnetico (circa 45 minuti), filtrare attraverso due filtri pieghettati a velocità di filtrazione media.
4.112.
Soluzione colorante (soluzione madre 2)
Sciogliere 5,0 g di solfato di rame pentaidrato in 1 000 mi di acido acetico al 20 % (v/v).
4.11.3.
Soluzione colorante (soluzione di lavoro)
Mescolare 125 mi di ciascuna delle soluzioni madre (4.11.1 , 4.11.2) immediatamente prima della colorazione.
Nota : La soluzione colorante non dovrebbe essere riutilizzata il giorno successivo a quello della preparazione.
5.
Apparecchiatura
5.1 .
Piastre di vetro (265 x 125 X 4 mm); rullo di gomma (larghezza 15 cm) ; piano di appoggio con livello regolabile.
5.2.
Foglio di supporto del gel (265 x 125 mm).
5.3.
Foglio di copertura (280 x 125 mm). Attaccare una striscia di nastro adesivo (280 x 6 x 0,25 mm) a ciascuno dei lati lunghi
(vedi figura 1 ).
5.4.
Camera di elettrofocalizzazione con piastra di raffreddamento (ad es. 265 x 125 mm) con una opportuna sorgente di diffe­
renza di potenziale (> 2,5 kV) oppure altro sistema per elettroforesi.
5.5.
Criostato a circolazione, termostaticamente controllato a 12 ± 0,5 °C.
5.6.
Centrifuga regolabile a 3 000 g.
5.7.
Strisce per elettrodi (> 265 mm di lunghezza).
5.8 .
Bottiglie di plastica con contagocce per le soluzioni dell'anodo e del catodo.
5.9.
Applicatori del campione (10 x 5 mm, filtro di viscosa o di carta a basso assorbimento di proteine).
5.10.
Forbici, bisturi e pinzette in acciaio inossidabile.
5.1 1 .
Vaschette per la colorazione e la decolorazione in acciaio inossidabile o in vetro (ad esempio, bacinella per strumenti chirur­
gici di 265 x 150 mm).
5.12.
Omogenizzatore ad asta regolabile (diametro 10 mm), regolabile da 8 000 a 20 000 giri al minuto.
5.13.
Agitatore magnetico.
5.14.
Bagno ultrasonico.
5.15.
Saldatore di pellicole.
5.16.
Micropipette da 5,25 |xl.
5.17.
Concentratore sotto vuoto o liofilizzatore.
5.18 .
Bagnomaria termostatico regolabile a 35 e 40 ± 1 °C con agitatore.
5.19.
Apparecchiatura per densitometria con lettura a X = 634 nm.
6.
Procedimento
6.1 .
Preparazione del campione
6.1.1 .
Isolamento della caseina.
Pesare l'equivalente di 5 g di sostanza secca di formaggio o di standard — per il formaggio a crosta fiorita, se possibile, la
parte centrale non matura — in un tubo da centrifuga da 100 mi, aggiungere 60 mi di acqua distillata ed omogeneizzare con
un omogenizzatore ad asta (8 000-10 000 giri al minuto). Portare a pH 4,6 con acido acetico diluito (4,5) e centrifugare (5
minuti, 3 000 g). Eliminare per travaso grasso e siero, omogeneizzare il residuo a 20 000 giri al minuto in 40 mi di acqua
distillata [portata a pH 4-5 con acido acetico diluito (4.5)], aggiungere mo mi di diclorometano (4.5), omogeneizzare e centrifu­
gare (5 minuti, 3 000 g). Recuperare con una spatola lo strato di caseina compreso tra la fase acquosa e quella organica (figura
2) ed eliminare entrambe le fasi. Riomogeneizzare la caseina in 40 mi di acqua distillata (vedi sopra) e 20 mi di diclorometano
e centrifugare. Ripetere questo procedimento finché entrambe le fasi di estrazione diventano incolori (2-3 volte). Omogeneiz­
zare il residuo proteico con 50 mi di acetone anidro (4.5) e filtrare attraverso carta da filtro pieghettata a velocità di filtrazione
media. Lavare il residuo sul filtro con due aliquote separate di 25 mi di acetone e far essiccare all'aria o in corrente di azoto,
quindi triturare finemente in mortaio.
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Nota : Gli isolati proteici secchi possono essere conservati indefinitamente a temperatura ambiente. Ai fini di un rapido
isolamento delle proteine omogeneizzare l'equivalente di 5 g di sostanza secca di formaggio due volte, ciascuna volta con 100
mi di acetone (4.5) a 20 000 giri al minuto, lasciar riposare 5 minuti e filtrare su un filtro a pieghe. Essiccare il residuo
proteico con acetone, come descritto prima, in modo da ottenere finalmente la polvere essiccata con acetone. Il metodo
rapido non può essere applicato a formaggi del tipo Roquefort.
6.1.2.
Idrolisi delle 6-caseine con plasmina per intensificare le bande di y-caseine
Sospendere 25 mg di caseina isolata oppure 50 mg degli standard liofilizzati (4.8) o della polvere, essiccata con acetone, prove­
niente dall'isolamento delle proteine con il sistema veloce in 0,5 mi di tampone di carbonato ammonico (4.7.1 ), ed omoge­
neizzare per 20 minuti ricorrendo, per esempio, al trattamento ultrasonico. Scaldare a 40 °C e aggiungere 10 (il di plasmina
(4.7.2), mescolare e incubare per 1 ora a 40 ° C agitando continuamente. Per inibire l'enzima aggiungere 20 jxl di soluzione di
acido e-amminocapronico (4.7.3), aggiungere quindi 200 mg di urea solida e 2 mg di ditiotreitolo.
Nota : Per ottenere più simmetria nelle bande di caseine focalizzate è consigliabile liofilizzare la soluzione dopo aver
aggiunto l'acido E -amminocapronico e aver sciolto i residui in 0,5 mi di tampone urea (4.6).
6.2.
Preparazione del gel di acrilamide contenenti urea
Aiutandosi con poche gocche d'acqua stendere il foglio di supporto del gel (5.2) su una piastra di vetro (5.1 ), rimovendo
l'acqua in accesso con fazzoletti di carta oppure con del tessuto. Stendere il foglio di copertura (5.3) con dei distanziatori (0,25
mm) su un'altra piastra di vetro nello stesso modo. Disporre la piastra orizzontalmente su un piano livellabile.
Aggiungere 10 |xl di ciascuna delle soluzioni catalizzatrici TEMED e PER (4.1.3) alla soluzione di gel preparata e disaerata
(4.1.2), mescolare rapidamente e versare in modo uniforme sul centro del foglio di copertura. Sistemare un bordo della piastra
di supporto del gel (con il lato del foglio verso il basso) sulla piastra del foglio di copertura e abbassarla in modo che tra i fogli
si formi uno strato di gel uniforme e senza bolle (figura 3). Far abbassare la piastra di supporto del gel con cautela e completa­
mente, aiutandosi con una spatola sottile e sistemare su di essa altre tre piastre di vetro che agiscano da peso. Una volta che la
polimerizzazione si è completata (circa 60 minuti dopo) rimuovere il gel polimerizzato sul foglio di supporto assieme al foglio
di copertura eliminando le piastre di vetro. Pulire accuratamente la parte posteriore della piastra di supporto del gel in modo
da rimuovere residui di gel e di urea. Saldare il gel posto tra i due fogli in un tubo di pellicola e conservare in un frigorifero
(massimo 6 settimane).
Nota : Il foglio di copertura con i distanziatori può essere riutilizzato. Il gel di poliacrilamide può essere tagliato in porzioni
più piccole, il che è auspicabile se si tratta di pochi campioni o se viene usato un dispositivo automatico di elettroforesi (2 gel,
dimensione 4,5 x 5 cm).
6.3 .
Focalizzazione isoelettrica
Regolare il termostato refrigerante a 1 2 ° C. Pulire il supporto del gel con cherosene, quindi far cadere poche gocce di chero­
sene (4.2) sul centro del blocco di raffreddamento. Far poi ruotare il gel a sandwich con la parte del supporto verso il basso, su
di esso, avendo cura di evitare bolle d'aria. Eliminare eventuali eccessi di cherosene e rimuovere il foglio di copertura. Immer­
gere le strisce per elettrodi nelle soluzioni elettrodiche (4.3, 4.4), tagliarle nel senso della lunghezza del gel e sistemarle nelle
posizioni previste (distanza tra elettrodi 9,5 cm).
Effettuare la focalizzazione nelle seguenti condizioni.
6.3.1 .
Dimensioni del gel 265 x 125 x 0,25 mm
Operazione
Tempo
(min)
voltaggio
(V)
corrente elettrica
potenza
volt/ora
(mA)
(W)
(Vh)
1 . Prefocalizzazione
30
max.
2 500
max.
15
const.
4
c.
300
2. Focalizzazione del campione (*)
60
max. 2 500
max.
15
const.
4
c.
1 000
3 . Focalizzazione
60
max.
2 500
max.
5
max.
20
c.
3 000
40
max.
2 500
max.
6
max.
20
c.
3 000
30
max.
2 500
max.
7
max .
25
c.
2 500
(") Applicazione del campione : dopo la prefocalizzazione (fase 1 ) pipettare 18 (il di ciascuna delle soluzioni di campione sugli applicatori del
campione (10 x 5 mm), sistemarli sul gel ad intervalli di 1 mm l'uno dall'altro e a 5 mm di distanza in senso longitudinale dall'anodo
premendo leggermente. Eseguire la focalizzazione nelle condizioni sopra descritte, rimuovere accuratamente gli applicatori dei campioni
dopo 60 minuti dall'inizio della focalizzazione.
Nota : Se si cambia lo spessore o la larghezza dei gel, i valori relativi alla corrente elettrica e alla potenza devono essere
aggiustati (ad esempio, se si usa un gel di 265 x 125 x 0,5 mm devono essere raddoppiati i valori della corrente elettrica e
della potenza).
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6.3.2.
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Esempio di programma di voltaggio per un dispositivo automatico di elettroforesi (2 gel di 5,0 x 4,5 cm), elettrodi senza
strisce applicati direttamente al gel.
Operazione
1 . Prefocalizzazione
2. Focalizzazione del campione f)
3. Focalizzazione
4. Focalizzazione
Voltaggio
Corrente elettrica
Potenza
Temperature
1 000 V
250 V
1 200 V
1 500 V
Volt/ora
10,0 mA
3,5 W
8°C
85 Vh
5,0 mA
2,5 W
8°C
30 Vh
10,0 mA
5,0 mA
3,5 W
7,0 W
8°C
8°C
80 Vh
570 Vh
Porre lapplicatore del campione nella fase 2 a 0000 Vh
Rimuovere lapplicatore del campione nella fase 2 a 0030 VH
6.4.
Colorazione delle proteine
6.4.1 .
Fissaggio delle proteine
Allontanare le strisce elettrodiche immediatamente dopo aver tolto la corrente e mettere il gel immediatamente in una
vaschetta per colorazione/decolorazione contenente 200 mi di soluzione di fissaggio (4.9); lasciar riposare per 15 minuti,
agitando di tanto in tanto.
6.4.2.
Lavaggio e colorazione della piastra di gel
Eliminare accuratamente tutto il liquido di fissaggio e lavare la piastra due volte per 30 secondi, ogni volta con 1 00 mi della
soluzione decolorante (4.10). Eliminare la soluzione decolorante e riempire il dischetto con 250 mi della soluzione colorante
(4.11.3); lasciar colorare per 45 minuti agitando delicatamente.
6.4.3.
Decolorazione della piastra
Eliminare la soluzione colorante, lavare la piastra due volte, usando ogni volta 100 mi di soluzione decolorante, agitare quindi
per almento 2 x 15 minuti con 200 mi di soluzione decolorante finché il fondo non diventa chiaro e incolore. Sciacquare
quindi la piastra con acqua distillata (2x2 min) ed essiccare all'aria (2-3 ore) oppure con un asciugacapelli (10-15 min).
Nota : Effettuare il fissaggio, il lavaggio, la colorazione e la decolorazione a 20 °C. Non usare temperature elevate.
7.
Determinazione quantitativa
La determinazione quantitativa viene effettuata confrontando il profilo proteico del campione con quello dei campioni di rife­
rimento posti sullo stesso gel. La presenza di latte bovino nel latte di pecora o nei prodotti derivati da quest'ultimo viene rile­
vata attraverso le caseine y2 e y3 la cui intensità sia stata aumentata mediante trattamento con plasmina (vedi 6.1.2), i cui punti
isoelettrici variano tra pH di 6,5 e 7,5 (figure 4 e 5). Il limite di rivelazione è al di sotto dello 0,5 % . Per una valutazione visiva
del quantitativo di latte bovino presente è consigliabile uniformare le concentrazione dei campioni e degli standard in modo
da ottenere lo stesso livello di intensità delle caseine y2 ovine (vedi « y2S » nelle figure 4 e 5). Dopo di che il quantitativo di
latte bovino (inferiore, pari o superiore all' I %) nel campione in esame può essere stimato direttamente confrontando l'inten­
sità delle caseine y2 bovine (vedi « y2C » nelle figure 4 e 5). Se possibile, ricorrere alla densitometria (5.19) per la determina­
zione del rapporto tra le aree dei picchi della caseina y2 bovina e di quella ovina (vedi figura 5). Confrontare questo valore col
rapporto tra caseine y2 presenti nello standard all'I % analizzato sullo stesso gel.
Nota : Il metodo funziona in modo soddisfacente se vi è un segnale chiaramente positivo per la caseina y2 bovina nello stan­
dard all' I %, ma non nello standard allo 0 % . In caso negativo, ottimizzare la procedura rispettando accuratamente i partico­
lari del metodo.
8.
Bibliografia
Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A. : Use ofplasmin to increase
the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusing of y 2 -caseins. Milchwissenschaft 45,
708-711 (1990).
Krause I., Berner I, Klostermeyer H. : Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte
— and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing ofy 2-caseins using plasmin as signal amplifier.
In : Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.), pag. 389-393, Bode-Verlag, Munchen (1989).
Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P. : Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -Käse durch isoelektrische
Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).
Krause I., Berner I., Klostermeyer H. : Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in preparazione).
Radola B.J. : Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 \im polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester
films. Electrophoresis 1 , 43-56 (1980).
N. L 74/30
Gazzetta ufficiale delle Comunità europee
20 . 3. 92
Figura 1 Rappresentazione schematica del foglio di copertura.
Figura 2 Strato di caseina all'interfaccia tra fase acquosa e fase organica dopo centrifugazione.
Figura 3 Tecnica per preparare con stampi gel di poliacrilamide ultrasottih :
a = nastro distanziatore (0,25 mm) ; b = foglio di copertura (5.3); c, e = piastre di vetro (5.1 ); d = soluzione di gel (4.2);
f = foglio di supporto del gel (5.2)
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Figura 4 Focalizzazione isoelettrica della caseina preparata da campioni di formaggi del tipo Pecorino dopo trattamento con plasmma,
contenenti differenti quantitativi di latte bovino : % di CM = percentuale di latte bovino ; C = vacca ; S = pecora.
Formaggio del tipo Pecorino contenente :
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Figura 5 Sovrapposizione di densitogrammi relativi a campioni di formaggio del tipo Pecorino contenenti 0, 1 , 2, 3 e 7 % di latte bovino
dopo focalizzazione isoelettrica. È stata analizzata a X •= 634 nm, la parte del gel nella quale sono presentì le bande di interesse
pratico. STD = standard contenenti lo 0 e l' I % di latte bovino.
