Ristrutturazione della cromatina e riparazione del DNA

annuncio pubblicitario
LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE DI LIEVITO
Ristrutturazione della cromatina e riparazione del DNA
Mario Moscariello, Carla Florio e John Pulitzer
La continuità del DNA nei cromosomi è soggetta a interruzioni dovute sia a cause estrinseche (mutageni) che a processi
intrinsechi come la replicazione e ricombinazione. L’interruzione è spesso un taglio a doppia elica che le esonucleasi
possono far evolvere in un “buco” (GAP). La replicazione esige che ogni discontinuità sia riparata; alla riparazione è
adibito un vasto repertorio di enzimi. Un’alterazione nei meccanismi di riparazione può causare morte cellulare oppure
riarrangiamenti cromosomici che nei vertebrati sono responsabili di numerose malattie, incluso il cancro.
IL PROCESSO
Concettualmente, per la riparazione di un gap nell’elica del DNA sono
possibili due modalità di riparazione:
(1) Le estremità vengono semplicemente saldate (Non Homologous End Joining:
NHEJ) con perdita dell’ informazione “erosa” nel GAP
(2) Il GAP viene riparato per ricombinazione omologa (HR) con recupero
dell’informazione deleta, se della sequenza danneggiata esiste una seconda copia
integra (ad esempio, il cromosoma omologo),
LA CROMATINA
Il DNA, è avvolto a gomitolo intorno agli istoni (nucleosomi), che a loro volta sono “superavvolti” in solenoidi.Così
formattato in cromatina (cromosomi) il DNA è schermato ed atto ad essere efficientemente segregato durante la
mitosi
LA RIPARAZIONE
xt
La riparazione come ogni altro processo che coinvolge il DNA richiede una riformattazione mirata della cromatina. I motori della
riformattazione agiscono modificando chimicamente specifiche regioni della cromatina (acetilasi, metilasi) oppure dissociando
temporaneamente il DNA dai nucleosomi. In quest’ultimo caso il motore utilizza energia fornita dall’idrolisi dell’ATP.
Noi ci occupiamo di uno di questi riformattatori, ATP dipendenti, il complesso Rsc e le sue interazioni con Htl1 un peptide di 78 aminoacidi.
RSC: un complesso multiproteico di c.
1MDa. Le subunità formano una cavità
che racchiude il nucleosoma e per
azione della subunità ATPasi Sth1 libera
sequenzialmente il DNA dagli istoni .
Nucleosoma
Htl1: minuscolo peptide di 78 aminoacidi, strutturato ad alpha elica lega
transitoriamente la subunità Rsc8.
A comprova della rilevanza fisiologica del legame abbiamo sostituito tre leucine
presenti nella sequenza ad alfa-elica con proline. Per ragioni steriche la prolina
è poco compatibile con la configurazione ad elica. La sostituzione inattiva Htl1 e
simultaneamente impedisce il legame a Rsc8.
Presentiamo qui alcuni esperimenti sugli effetti dell’inattivazione di Htl1 sulla riparazione del DNA e sulle loro conseguenze
Per saggiare la riparazione (NHEJ oppure HR), introduciamo in lievito plasmidi circolari portatori di geni essenziali per la crescita, nelle
condizioni sperimentali scelte. In ambedue gli esperimenti il plasmide è tagliato con un enzima di restrizione. Se il taglio non viene saldato
il plasmide si perde e la cellula muore
A e B sono i risultati di esperimenti in cui le cellule di lievito vengono trasformate con plasmidi tagliati e si valuta l’efficienza e la
modalità di riparazione (NHEJ oppure HR)
A
Il plasmide è tagliato con EcoRI in una
sequenza di cui non vi è copia omologa
in lievito. Il grafico rappresenta
l’efficienza di NHEJ in un ceppo
selvatico e in uno mutato nel gene HTL1. La NHEJ è inibita nel mutante htl-1
ma
è
recuperata
(per
complementazione)
in
seguito
all’espressione di Htl-1 transgenico.
Trp
Amp
% t ransf ormant s recovered relat ive t o uncut vect or
EcorI
100
htl1+ pBM272-HTL1
90
80
selvatico
70
60
50
40
htl1+ pBM272 vuoto
30
htl1
20
B,
Nel plasmide portatore della marcatore selettivo KAN, è stato creato un
“buco” nella sequenza URA3 necessaria per la crescita in assenza di
Uracile. Una copia della sequenza mancante è presente nella cellula.
Pertanto il DNA sul plasmide può essere riparato o per saldatura (NHEJ)
con perdita dell’informazione URA3 o per ricombinazione omologa (HR)
con recupero della sequenza funzionale. In cellule selvatiche è preferita la
NHEJ, mentre nel mutante htl-1 è preferita la ricombinazione
omologa (HR) con recupero della prototrofia per uracile.
KAN
CEN
H H
URA3
5 36
6 78
ura3 -52
Ty1 nt 12 1
- Uracil
+ Uracil
WT
htl1
10
0
Alcune conseguenze della saldatura inefficiente dei tagli
In lievito esistono tre tipi sessuali: a ed ⟨ aploidi che coniugano
per dare il terzo tipo diploide a/⟨, capace di entrare in meiosi ma
non di coniugare. Nelle cellule aploidi quasi ad ogni divisione
cellulare si genera un taglio sito specifico (che si allarga a
buco) in corrisponente di un gene sesso specifico (MAT) ad opera
dell’endonucleasi HO. Nella riparazione il buco fa da ricevente per
sequenze donatrici che determinano il cambio del tipo
sessuale.
Tetrade
A seguito del cambiamento
sporadico ed incontrollato del
tipo sessuale si formano ceppi
ermafroditi che si incrociano sia
con ceppi Mata che Mat ⟨
1
α
sir3
incrociati
con Mat α
a/ α
α
La perdita di controllo può
determiare cambiamento del
tipo sessuale α/α (στεριλε) in
α/α οππυρε α/α φερτιλι χηε,
ινχορχιανδοσι α λορο ϖολτα,
φορµανο τετραπλοιδι....
α
a/ α
Endonucleasi HO
Nei ceppi di laboratorio il gene HO è inattivato. Ciononostante, nei mutanti htl1 si osserva
sporadica conversione del tipo sessuale. Ipotizziamo che la saldatura inefficiente dei tagli a
doppia elica, che si formano sporadicamente durante replicazione del sito MAT, a causa del
NHEJ difettoso nei mutanti htl1, si allarghino a buchi (gap) e vengano riparati per
ricombinazione omologa utilizzando sequenze donatrici del tipo sessuale opposto
2
α
a/ α
a/ α
sequenza donatrice
incrociati
con Mata
aploide diploide
tetraploide
htl1
SELVATICO
Tagli non riparati del DNA
sono altamente
ricombinogeni e possono
generare traslocazioni che
forse sono all’origine
dei“supercloni” che
sporadicamente
compaiono nei ceppi htl1.
aploide a
ž ht l1
WT
a/ α
ž ht l1 ,sir3
aploide
a
ž ht l1 ,sir3
WT
aploide
a
aploide
a
SWIT CH
HO indipendent e
Scarica