TUTOR
Marco Seri
TITOLO DEL PROGETTO
Identificazione di un nuovo gene responsabile di una nuova forma recessiva di paraparesi spastica
ereditaria
DESCRIZIONE DEL PROGETTO
Stato dell’Arte e Razionale
Le paraparesi spastiche ereditarie (HSP) sono un gruppo di patologie neurodegenerative clinicamente e
geneticamente eterogenee che colpiscono i neuroni del tratto corticospinale e delle colonne posteriori del midollo
spinale.
Attualmente più di 70 loci genetici sono stati associati a forme di HSP con trasmissione autosomica dominante o
recessiva, X-linked o mitocondriale.
Il gene SPAST è mutato in circa il 40-45% delle famiglie con paraparesi autosomica dominante e nel 19% dei casi
sporadici. Mutazioni nel gene SPG11 sono invece la causa principale (15-21%) tra i pazienti affetti da forme
recessive. I geni causativi “minori” hanno invece un impatto molto più basso, con mutazioni patogenetiche trovate
in poche o singole famiglie, e, nonostante l’elevato numero di geni ad oggi identificati, circa il 20% delle famiglie
e il 52% dei casi sporadici rimangono senza una diagnosi molecolare.
Lo scopo di questo progetto è l’identificazione e la caratterizzazione della mutazione causativa in una famiglia
con HSP autosomica recessiva, in cui tramite Whole Exome Sequencing (WES) sono state identificate varianti
candidate in omozigosi, in 3 diversi geni, HEATR4 (Glu985Argfs*10), NRXN3 (p.Ala683Thr) e RAD23A
(p.Glu23Lys).
Obiettivi
Al fine di identificare il gene responsabile della nuova forma di paraparesi in esame, verranno perseguiti due
obiettivi principali:
Obiettivo 1. Ottenere evidenze funzionali che supportino la rilevanza biologica di una delle tre varianti candidate.
A tale scopo verranno effettuati saggi biochimici e funzionali a seconda della specifica attività della proteina, in
modo da valutare il ruolo patogenetico di ciascuna variante.
Obiettivo 2. Identificare mutazioni aggiuntive in uno dei tre geni candidati in una coorte di 60 pazienti con HSP
sporadica (con possibile trasmissione di tipo recessivo) e 40 famiglie con paraparesi autosomica recessiva, in cui
lo screening dei geni SPAST o SPG11 è risultato negativo.
Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…)
Obiettivo 1.
Le tre varianti identificate in RAD23A, NRXN3 e HEATR4 verranno testate attraverso saggi biochimici e
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
funzionali per valutare il possibile ruolo causativo di ciascuna di esse.
La proteina RAD23A è coinvolta (1) nei meccanismi di riparazione del DNA per escissione dei nucleotidi (NER)
e (2) nell’indirizzamento delle proteine ubiquitinate alla degradazione tramite proteasoma. Esperimenti pianificati:
1. saggi NER (Oligonucleotide Retrieval Assay, ORA) sui fibroblasti del paziente e di controlli sani per testare la
capacità di riparazione del DNA da parte della proteina mutata;
2a. trasfezione dei fibroblasti del paziente e di controlli sani con UbG76V-GFP, che in condizioni fisiologiche
viene degradata, per monitorare l’attività del proteasoma. L’eventuale alterazione del sistema di degradazione
determinerà un accumulo della molecola.
2b. esperimenti di co-immunoprecipitazione effettuati sia sui fibroblasti del paziente, sia in cellule trasfettate con
vettori esprimenti la proteina wild-type o mutata, per valutare la capacità della proteina mutante di interagire con
il proteasoma.
2c. saggi di co-immunoprecipitazione anche per valutare l’impatto della mutazione sul legame tra RAD23A e
ATXN3, suo interattore fisiologico, per il quale sono state descritte mutazioni responsabili di SCA3.
La proteina Neurexina-3 (NRXN3) ha un ruolo di recettore transmembrana e molecola di adesione sulla superficie
dei neuroni. Esperimenti pianificati:
1. Analisi delle modificazioni post-traduzionali (glicosilazione, fosforilazione, ponti disolfuro) in cellule HEK293
trasfettate con cDNA wild-type o mutato;
2. Preparazione di co-colture con le cellule HEK293 trasfettate e neuroni dell’ippocampo che esprimono
neuroligine (interattori di Neurexina-3) e valutazione della localizzazione cellulare della proteina mutata e della
sua capacità di clusterizzare con le neuroligine, tramite esperimenti di immunofluorescenza.
Il gene HEATR4 codifica per una proteina con ripetizioni HEAT dalla funzione ancora non nota. Per questo
motivo, gli esperimenti saranno volti alla caratterizzazione della proteina, attraverso l’analisi della sua
localizzazione cellulare per immunofluorescenza e attraverso l’identificazione degli interattori con saggi pulldown.
Obiettivo 2.
Nei 100 probandi affetti da HSP verrà analizzata, tramite sequenziamento Sanger, l’intera sequenza codificante
dei tre geni per un totale di 9 esoni in RAD23A, 17 in NRXN3 e 18 in HEATR4.
Le varianti in omozigosi o possibile eterozigosi composta, non sinonime o che alterino i siti di splicing verranno
valutate per quanto riguarda la frequenza nella popolazione generale, utilizzando database pubblici (ExAc, EVS e
1000 Genomes Browser). Le varianti nuove o rare (<0,5%) verranno testate all’interno delle singole famiglie per
valutarne la segregazione. Diversi tool di predizione verranno utilizzati per valutare in silico l’effetto delle varianti
non sinonime sulla funzionalità della proteina (PolyPhen-2, SIFT, Mutation Tester, CADD, VEP) e delle varianti
di splicing sulla trascrizione (HSF, BDGP splice site). Le varianti non sinonime selezionate verranno sottoposte
agli esperimenti sopra descritti sulla base del gene interessato, mentre l’effetto delle varianti di splicing verrà
testato attraverso l’analisi dell’RNA dei pazienti, tramite RT-PCR, quando possibile.
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Risultati attesi
Lo svolgimento del progetto consentirà di ottenere evidenze sia genetiche che funzionali sulla patogenicità di una
delle 3 varianti identificate tramite exome sequencing e quindi di identificare un nuovo gene responsabile di HSP.
DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA
Competenze richieste: l’assegnista deve avere esperienza in:
analisi di sequenza dei geni (PCR e sequenziamento Sanger)
utilizzo dei database pubblici e dei tool bioinformatici di predizione dell’effetto delle varianti sui trascritti
o sulle proteine
clonaggio di cDNA in appropriati vettori di espressione e mutagenesi per ottenere le forme mutate delle
proteine in esame
analisi tramite RT-PCR dell’RNA estratto da sangue e fibroblasti
Attività dell’assegnista: l’ attività dell’assegnista sarà principalmente dedicata al raggiungimento dell’obiettivo 2
e di parte dell’obiettivo 1:
Mese 1: disegno e messa a punto dei primer per l’amplificazione e il sequenziamento dei singoli esoni dei
tre geni candidati (obiettivo 2);
Mesi 2-12: screening della sequenza dei geni candidati nei 100 pazienti affetti da paraparesi spastica
ereditaria e valutazione in silico delle varianti identificate (obiettivo 2);
Mesi 1-4: clonaggio dei cDNA dei 3 geni candidati in vettori di espressione e mutagenesi per introdurre
le varianti nucleotidiche identificate (obiettivo 1)
Mesi 10-12: eventuali estensione dell’analisi di sequenza nei familiari dei pazienti positivi allo screening
e studi funzionali sulle nuove varianti candidate, identificate tramite lo screening di sequenza, in
particolare sulle varianti che modificano i siti di splicing, attraverso RT-PCR e sequenziamento dei
trascritti
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Obiettivi: l’obiettivo principale dell’attività dell’assegnista sarà l’identificazione di eventuali nuove varianti
potenzialmente causative di paraparesi spastica in uno dei tre geni candidati sottoposti a screening (RAD23A,
NRXN3 e HEATR4), in modo da stabilire quale dei tre può essere considerato un nuovo gene responsabile di
paraparesi spastica ereditaria. Inoltre i risultati dell’analisi dell’effetto funzionale della variante causativa,
consentiranno di elucidarne il meccanismo patogenetico molecolare e cellulare e di definire il ruolo fisiologico
della proteina corrispondente nella normale fisiologia neuronale.
Scheda attività assistenziale (se prevista)
PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA
ATTIVITÀ
N. ORE SETTIMANA
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