Indice - GulisanoLab

III-VIIIIndice26-05-200412:27Paginaiii
Indice
IX
Prefazione
X
Il codice genetico e la nomenclatura a
singola lettera degli aminoacidi
Capitolo 1
1
1
1
2
3
4
5
5
5
LA MANIPOLAZIONE GENICA,
UNA TECNICA DALLE VASTE
APPLICAZIONI
Introduzione
Sequenziamento di DNA
Analisi biochimica in vivo
La medicina molecolare
Una nuova industria: le biotecnologie
SCHEDA 1.1 LA NASCITA DI UN’INDUSTRIA
Il ruolo centrale di E. coli
Argomenti di questo libro
16
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18
18
19
19
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21
POLIMERASI PERMETTE DI OTTENERE IN MODO SEMPLICE
UN’ENORME AMPLIFICAZIONE DI SPECIFICHE SEQUENZE
BERSAGLIO
21
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22
8
8
8
8
9
11
11
12
LE TECNICHE
DI BASE
Introduzione
Il problema di base
Gli strumenti tecnici
Elettroforesi in gel di agarosio
Il trasferimento degli acidi nucleici su
membrana (blotting)
Southern blotting
SCHEDA 2.1 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
25
25
26
27
Northern blotting
SCHEDA 2.2 IL PRINCIPIO DELL’AUTORADIOGRAFIA
Western blotting
TAGLIO E SALDATURA
DI MOLECOLE DI DNA
Taglio di molecole di DNA
Restrizione e modificazione mediata
dall’ospite
Tipi di sistemi di restrizione-modificazione
(sistemi R-M)
SCHEDA 3.1 LA RESTRIZIONE: DA SISTEMA NATURALE
DI CONTROLLO DELLA GENETICA BATTERICA A
STRUMENTO RIVOLUZIONARIO DELLE TECNOLOGIE DEL
28
28
29
TRASFERITI SU MEMBRANA
13
14
15
PCR estesa ad alta fedeltà di incorporazione
(Long Accurate PCR, LA-PCR)
I principali fattori che influenzano la PCR
PCR quantitativa in tempo reale
Capitolo 3
25
Capitolo 2
Tecniche alternative di blotting
La trasformazione di E. coli
Elettroporazione
La trasformazione di altri organismi
La reazione a catena della DNA polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, PCR)
La reazione di base
RT-PCR (PCR su RNA retrotrascritti)
SCHEDA 2.3 LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA
30
30
DNA RICOMBINANTE
Nomenclatura dei sistemi R-M
I siti di riconoscimento
Numero e dimensione dei frammenti di
restrizione
Taglio e saldatura di molecole di DNA:
variazioni sul tema
Le metilasi Dam e Dcm di E. coli
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IV
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33
34
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40
Indice
L’importanza dell’eliminazione dei sistemi
di restrizione nei ceppi di E. coli utilizzati
come ospiti di molecole ricombinanti
Importanza della qualità degli enzimi di
restrizione
La saldatura di molecole di DNA
Le DNA ligasi
SCHEDA 3.2 UTILIZZO DELL’X-GAL PER VERIFICARE
LA α-COMPLEMENTAZIONE DELL’ATTIVITÀ
β-GALATTOSIDASICA
Adattatori
Sintesi di code omopolimeriche con la
terminal transferasi
La saldatura di frammenti prodotti
mediante PCR
Incorporazione di sequenze extra al 5′
del primer in un prodotto di PCR
La saldatura non enzimatica di molecole
di DNA
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Capitolo 5
61
61
61
COSMIDI, FASMIDI
E ALTRI VETTORI AVANZATI
73
Introduzione
Vettori per il clonaggio di grandi frammenti di
DNA
Vettori cosmidici
I vettori BAC e PAC come alternativa ai
cosmidi
Scelta del vettore di clonaggio
Vettori per applicazioni specializzate
Vettori in grado di produrre DNA a singolo
filamento per il sequenziamento
Vettori di espressione
Vettori per la preparazione di sonde a RNA
Vettori che massimizzano la sintesi proteica
Vettori che semplificano la purificazione
delle proteine ricombinanti
SCHEDA 5.1 OTTIMIZZAZIONE DELL’EFFICIENZA DI
77
SCHEDA 5.2 INTEINE, EXTEINE E LO SPLICING DI
61
64
66
67
67
67
68
69
72
TRADUZIONE
Capitolo 4
41
41
43
43
45
45
45
47
47
50
52
LA BIOLOGIA DI BASE
DEI VETTORI PLASMIDICI
E FAGICI
Caratteristiche essenziali dei plasmidi e
vettori plasmidici di base
Lo spettro d’ospite dei plasmidi
Il numero di copie dei plasmidi
La ripartizione dei plasmidi e la stabilità
segregativa
Incompatibilità tra plasmidi
La purificazione del DNA plasmidico
Caratteristiche desiderabili dei plasmidi
come vettori di clonaggio
pBR322, il capostipite dei vettori
plasmidici artificiali
Il batteriofago λ
Caratteristiche essenziali
SCHEDA 4.1 L’IMPORTANTE RUOLO DEL
BATTERIOFAGO λ NELLA BIOLOGIA
MOLECOLARE E NELLE TECNOLOGIE DEL DNA
PROTEINE
77
79
80
Capitolo 6
82
82
83
83
88
89
89
89
90
RICOMBINANTE
52
54
55
56
57
57
59
59
Promotori e sistemi di controllo
Organizzazione del DNA nei vettori λ
Vettori λ avanzati
L’impaccamento in vitro del DNA di λ
Clonaggio in vettori a DNA a singolo
filamento
La biologia dei colifagi filamentosi
Utilizzi dei vettori a singolo filamento
Lo sviluppo dei vettori basati sui fagi
filamentosi
Vettori che favoriscono la solubilizzazione
delle proteine espresse
Vettori che promuovono l’esportazione delle
proteine
Vettori di espressione a multifunzione
91
95
96
98
100
100
STRATEGIE
DI CLONAGGIO
Introduzione
Il clonaggio di DNA genomico
Le genoteche di DNA genomico
La PCR come alternativa al clonaggio di DNA
genomico
Il clonaggio di cDNA
Proprietà del cDNA
Genoteche di cDNA
SCHEDA 6.1 VETTORI λ PER IL CLONAGGIO E
L’ESPRESSIONE DI CDNA
Preparazione dei cDNA per la generazione di
genoteche
Il clonaggio di cDNA interi
La PCR come alternativa al clonaggio di
cDNA
SCHEDA 6.2 USO DELLE EXPRESSED SEQUENCE TAGS
(EST) NELLA GENOMICA
Strategie di analisi (screening) delle genoteche
Analisi di genoteche basata sulla sequenza
dei cloni
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Indice
© 88-08-07581-8
102
SCHEDA 6.3 IBRIDAZIONE DI GENOTECHE DI
134
RIFERIMENTO ORGANIZZATE IN SET DI CLONI ORDINATI
104
(ARRAYED LIBRARIES O GRIDDED LIBRARIES)
SCHEDA 6.4 UNA PIETRA MILIARE DELLA
LETTERATURA SCIENTIFICA: L’IDENTIFICAZIONE DEL
GENE DELLA FIBROSI CISTICA MEDIANTE CHROMOSOME
135
137
138
WALKING E CHROMOSOME JUMPING
105
110
110
111
112
Analisi delle genoteche di espressione
(clonaggio di espressione)
Clonaggio differenziale
Clonaggio differenziale con genoteche di DNA
SCHEDA 6.5 ANALISI DIFFERENZIALE MEDIANTE CHIP
DI DNA
SCHEDA 6.6 UNA PIETRA MILIARE DELLA
LETTERATURA SCIENTIFICA: IL CLONAGGIO PER
139
139
140
141
141
142
SOTTRAZIONE DEL GENE UMANO DELLA DISTROFIA
DUCHENNE (DMD)
Clonaggio differenziale mediante PCR
MUSCOLARE DI
112
142
144
Capitolo 7
115
115
115
116
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121
121
121
125
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127
127
129
129
132
SEQUENZIAMENTO
E MUTAGENESI
Introduzione
Le tecniche di base per il sequenziamento
di DNA
Modifiche del protocollo di sequenziamento
mediante terminatori dideossi
Il sequenziamento automatico di DNA
Accuratezza delle sequenze
Sequenziamento di interi genomi
Analisi dei dati di sequenza
I database di sequenze
Analisi dei dati di sequenza
Ricerche nei database
La mutagenesi sito-specifica
Mutagenesi a cassetta
Mutagenesi per estensione di un primer:
il metodo a singolo oligonucleotide
Metodi di mutagenesi sito-specifica
basati sulla PCR
Selezione di peptidi mutanti tramite
phage- e phasmid-display
Mutagenesi sito-specifica in vivo
Capitolo 8
133
133
133
IL CLONAGGIO IN BATTERI
DIVERSI DA ESCHERICHIA COLI
Introduzione
Introduzione di DNA in cellule batteriche
145
146
146
146
147
148
149
Mantenimento del DNA ricombinante
all’interno di un nuovo ospite
SCHEDA 8.1 TRASFORMAZIONE DI BACILLUS SUBTILIS
CON DNA PLASMIDICO
Integrazione del DNA ricombinante
Clonaggio in batteri Gram-negativi diversi da E.
coli
Vettori derivati dal gruppo di plasmidi IncQ:
il plasmide RSF 1010
Vettori derivati dai plasmidi del gruppo IncP
Vettori derivati dal plasmide Sa del gruppo
IncW
Vettori derivati da pBBR1
Clonaggio in batteri Gram-positivi
Vettori per il clonaggio in Bacillus subtilis ed
altri organismi a basso contenuto di GC
Influenza della modalità di replicazione del
DNA: vettori derivati da pAMβ1
SCHEDA 8.2 LE DUE MODALITÀ DI REPLICAZIONE DEI
DNA CIRCOLARI
Trascrizione e traduzione
Espressione controllata in B. subtilis ed in
altri ospiti a basso contenuto di GC
Vettori di secrezione per i batteri a basso
contenuto di GC
Vettori per l’inattivazione sistematica di geni
Clonaggio in streptomiceti
Vettori per gli streptomiceti
Ricombinazione omeologa
Capitolo 9
150
150
150
151
152
152
152
153
153
153
154
158
158
159
160
162
V
CLONAGGIO
IN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
ED IN ALTRI FUNGHI
Introduzione
Introduzione di DNA nei funghi
Il destino del DNA introdotto nei funghi
Vettori plasmidici utilizzabili nei funghi
Plasmidi episomici di lievito
Plasmidi replicativi di lievito
Plasmidi centromerici di lievito
Cromosomi artificiali di lievito
Vettori retrovirus-simili
Scelta del vettore per il clonaggio
Costruzione di plasmidi mediante
ricombinazione omologa in lievito
Espressione dei geni clonati
Sovraespressione di proteine in funghi
SCHEDA 9.1 IL METABOLISMO DEL GALATTOSIO ED IL
SUO CONTROLLO IN S. CEREVISIAE
Vettori specializzati
III-VIIIIndice 26-05-2004 12:27 Paginavi
VI
163
163
164
165
Indice
Surface display in lievito
Individuazione di interazioni proteinaproteina
Identificazione di geni che codificano per
specifiche attività cellulari
SCHEDA 9.2 VARIAZIONI SUL TEMA DEL SISTEMA
A DUE IBRIDI
166
Attribuzione della funzione associata ai
geni isolati
© 88-08-07581-8
201
203
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208
208
210
211
211
Capitolo 10
169
169
169
170
170
172
172
TRASFERIMENTO GENICO
IN CELLULE ANIMALI
Introduzione
Panoramica sulle strategie di trasferimento
genico
Trasformazione mediata da DNA
Tecniche di trasformazione
Trasformazione con DNA non replicativo
SCHEDA 10.1 GENI REPORTER E ANALISI DI
PROMOTORI
179
182
182
183
184
185
186
188
190
191
193
193
Trasformazione con vettori contenenti
repliconi
Trasferimento genico mediante trasduzione
virale
Principi generali di funzionamento dei
vettori virali
Adenovirus
Virus adenoassociato
Baculovirus
Vettori basati su herpesvirus
Vettori retrovirali
Sindbis virus e Semliki forest virus (alfavirus)
Il virus del vaiolo vaccino ed altri vettori
basati su poxvirus
Riassunto dei sistemi di espressione per le
cellule animali
SCHEDA 10.2 REALIZZAZIONE DI COSTRUTTI PER
OTTENERE ALTI LIVELLI DI ESPRESSIONE IN CELLULE
ANIMALI
Possibili applicazioni dei topi geneticamente
modificati
SCHEDA 11.1 EFFETTO DI POSIZIONE
Altri mammiferi ed uccelli
Trasferimento di DNA in altri vertebrati
Trasferimento genico in Xenopus
Trasferimento genico nei pesci
Trasferimento di DNA in invertebrati
Mosche transgeniche
Capitolo 12
214
214
214
217
217
217
218
219
220
222
IL TRASFERIMENTO GENICO
NELLE PIANTE
Introduzione
Il callo e la coltivazione in vitro di cellule
vegetali
Panoramica sulle strategie di trasferimento
genico
Trasformazione mediata da Agrobacterium
Tumore del colletto (crown-gall disease)
Plasmidi che inducono tumori: i plasmidi Ti
Il trasferimento del T-DNA
Plasmidi Ti disarmati come vettori per il
trasferimento genico nelle piante
SCHEDA 12.1 IL CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE DEI
GENI ESOGENI NELLE PIANTE
223
225
227
227
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229
229
229
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231
231
232
233
235
SCHEDA 12.2 MARCATORI DI SELEZIONE NELLE PIANTE
Una semplice procedura sperimentale per la
trasformazione mediata da Agrobacterium
Agrobacterium e le monocotiledoni
Vettori binari ad alta capacità
Agrobacterium rhizogenes e plasmidi Ri
Trasferimento diretto di DNA alle piante
Trasformazione di protoplasti
Bombardamento con particelle
Altri metodi per il trasferimento genico diretto
Trasformazione in planta
Trasformazione di cloroplasti
I virus delle piante come vettori
I virus a DNA come vettori di espressione
I virus a RNA come vettori di espressione
Capitolo 11
196
MANIPOLAZIONE GENETICA
DEGLI ANIMALI
Capitolo 13
237
196
197
197
199
Introduzione
Manipolazione genetica in mammiferi
Metodi per la produzione/generazione
di topi transgenici
Gene targeting in cellule ES
237
237
237
238
PROGRESSI DELLE TECNICHE
DI TRANSGENESI
Introduzione
Sistemi di espressione inducibili
Promotori inducibili endogeni
Sistemi inducibili ricombinanti
III-VIIIIndice 26-05-2004 12:27 Paginavii
Indice
© 88-08-07581-8
243
243
244
246
246
Applicazioni della ricombinazione sito-specifica
La ricombinazione sito-specifica
Delezione sito-specifica di sequenze del
transgene
Integrazione sito-specifica del transgene
SCHEDA 13.1 GENI MARCATORI CON FENOTIPO
273
274
274
275
276
RILEVABILE VISIVAMENTE
247
248
249
249
251
253
255
255
256
258
261
Ingegneria cromosomica
Creazione di mutanti condizionali nel
topo mediante l’utilizzo di Cre
Ulteriori metodiche transgeniche per inibire
l’espressione genica
Inibizione genica a livello dell’RNA
SCHEDA 13.2 SILENZIAMENTO DEL TRANSGENE,
COSOPRESSIONE E RNA INTERFERENCE
Inibizione genica a livello di prodotto
proteico
Le tecnologie transgeniche nella genomica
funzionale
Mutagenesi inserzionale
Gene tagging
Costrutti di intrappolamento
SCHEDA 13.3 INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITE
279
280
280
280
284
284
285
286
286
287
287
287
287
288
Capitolo 14
263
263
263
263
264
266
267
268
270
APPLICAZIONI
DELLA TECNOLOGIA
DEL DNA RICOMBINANTE
Introduzione
Tema 1: gli acidi nucleici come strumenti
diagnostici
Introduzione al tema
Individuazione di sequenze mediante
ibridazione e PCR
Analisi comparativa di sequenze:
polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP)
Polimorfismi dovuti alla variazione del
numero di sequenze ripetute in tandem
(Variable Number Tandem Repeats, VNTR)
Applicazioni dei VNTR nella genetica
forense
SCHEDA 14.1 USO DEL DNA FINGERPRINTING IN UN
PROCESSO PER IMMIGRAZIONE CLANDESTINA
270
271
271
271
La genetica nelle datazioni e nelle
ricostruzioni storiche
Tema 2: nuovi farmaci e nuovi trattamenti
per le malattie genetiche
Introduzione al tema: le proteine come
farmaci
Animali e piante transgenici come bioreattori
288
289
289
290
290
291
292
294
295
296
298
298
298
303
304
VII
Le piante come bioreattori
L’impatto della genomica
Animali transgenici come modello di
patologie umane
SCHEDA 14.2 XENOTRAPIANTO
Trasferimento genico nell’uomo – terapia
genica
L’importanza degli SNP
Tema 3: lotta alle malattie infettive
Introduzione al tema
Nuove vie per la vaccinazione
Individuazione di bersagli molecolari per
nuovi agenti antimicrobici
In Vivo Expression Technology (IVET)
Induzione di fluorescenza differenziale
Mutagenesi signature-tagged
Environomics
Tema 4: ingegnerizzazione di proteine
Introduzione al tema
Miglioramento di proteine terapeutiche
mediante cambiamenti di singoli aminoacidi
Miglioramento di enzimi: la subtilisina
come paradigma dell’ingegnerizzazione
di proteine
SCHEDA 14.3 VARIANTI DELLA α 1-ANTITRIPSINA
(AAT) RESISTENTI ALL’OSSIDAZIONE
Metodi per l’ingegnerizzazione di proteine:
l’approccio razionale
L’ingegnerizzazione di proteine mediante
«evoluzione guidata»
Le famiglie geniche come strumento di
supporto per l’ingegnerizzazione di proteine
Tema 5: ingegneria metabolica
Introduzione al tema
Sovraespressione pianificata di fenilalanina
Nuove vie per la sintesi di piccole molecole
Biosintesi combinatoria
Controllo di vie metaboliche ricombinanti
mediante ingegneria metabolica
Ingegneria metabolica nelle cellule vegetali
Tema 6: selezione e coltivazione di specie
vegetali nel ventunesimo secolo
Introduzione al tema
Miglioramento delle caratteristiche
agronomiche
Modifiche delle caratteristiche produttive
SCHEDA 14.4 LA TECNOLOGIA DEI SEMI TERMINATORI:
COME PROTEGGERE I PROPRI INVESTIMENTI
305
Epilogo: dai geni ai genomi
307
Bibliografia
364
Indice analitico