La regolazione dell`espressione dei geni.

La regolazione dell’espressione dei geni.
(prof. Paolo Marchesi)
…..siete pregati di non divulgare questo materiale senza il consenso dell’autore, grazie…..
Problema: Il DNA di una cellula contiene i geni di tutto l’organismo. Come mai a seconda di dove si trova la
cellula, alcuni si esprimono ed altri no ? Ad esempio, il gene “crescita dei capelli” si trova anche nelle cellule
della punta delle dita, ma in quelle cellule “non funziona” ovvero non viene espresso. Anche nei procarioti
esistono problemi analoghi. Come può una cellula attivare o disattivare i geni a seconda del contesto ? ad
esempio per sintetizzare o meno una certa sostanza ?
Principio di funzionamento: i geni (che stanno sul DNA) producono effetti SOLO se vengono poi
tradotti in proteine attraverso la serie di passaggi:
nei procarioti:
negli eucarioti:
DNA  RNA Proteina
DNA  RNA  RNA maturo  proteina
Occorre premettere che esistono geni, chiamati geni costitutivi, che vengono sempre trascritti in tutte le cellule
(es. quelli che codificano gli enzimi della glicolisi) e ne esistono altri, chiamati geni regolati (a loro volta
suddivisi in geni inducibili e geni reprimibili) che vengono trascritti solo se necessita, in quel dato contesto, la
proteina da essi codificata.
Nel caso dei geni inducibili quindi basta semplicemente bloccare una di queste fasi per impedire che dal gene si
arrivi alla proteina. Se un gene non riesce a produrre la proteina (quindi non riesce a funzionare) dice che non
viene espresso
Passiamo ora in rassegna i meccanismi di controllo nelle due principali suddivisioni di esseri
viventi.
PROCARIOTI
Il seguente schema a blocchi riassume le tappe principali dell’espressione dei geni nei procarioti
1) Passaggio DNA al RNA (trascrizione)
2) Passaggio RNA-PROTEINA (traduzione o sintesi)
3) Controlli post traduzionali (rielaborazione delle proteine e durata delle
proteine stesse )
1. Passaggio DNA al RNA (trascrizione)
È controllato dal meccanismo dell’operone1. Dall’ambiente circostante la cellula (o anche dall’ambiente
interno) possono arrivare molecole che attivano l’operone (induttori) o che lo disattivano (corepressori)
In alcuni casi è presente un enzima che può staccare anticipatamente l’RNA polimerasi (facendo si che
il messaggero prodotto non sia funzionale) si parla allora di regolazione co-trascrizionale o
attenuazione
2. Passaggio RNA-PROTEINA (traduzione o sintesi)
Nei procarioti questo tipo di controllo non è particolarmente frequente. La durata del mRNA è
generalmente costante perché gli enzimi che degradano il mRNA sono presenti in quantità costanti a
prescindere dal gene
3. Rielaborazione delle proteine prodotte (controlli post traduzionali)
Si tratta di meccanismi in grado di rielaborare la proteina prodotta. Ad esempio la rimozione
dell’amminoacido iniziale (tutte le proteine iniziano con la formil-Metionina). Se la proteina è un
enzima la rielaborazione può permetterne o meno il funzionamento. Le strutture proteiche (secondaria,
terziaria ecc.) dipendono dalla sequenza di amminoacidi della proteina (strutt. Primaria) ma sono
facilitate dalla presenza di altre proteine (il gruppo più importante è genericamente chiamato proteine
chaperon, poi vi sono anche enzimi non chaperon come la disolfuro isomerasi e la peptidil prolil
isomerasi). Le Chaperon sono anche coinvolte nei processi di degradazione delle proteine prodotte dalla
sintesi (anche la loro durata influenza l’espressione di un gene). Anche se abbastanza rara nei procarioti,
si può menzionare anche la Glicosilazione, ovvero l’aggiunta di zuccheri alla proteina, attività che in
alcuni casi è determinante per rendere la proteina funzionale.
Vale la pena sottolineare che anche in questo caso, la presenza di proteine nell’ambiente cellulare può in
definitiva, influenzare il funzionamento di una proteina prodotta dalla sintesi ovvero l’espressione di un
gene.
1
Per il funzionamento di questo processo biologico si rimanda all’articolo “l’operone” dello stesso autore sempre su questo stesso
sito
EUCARIOTI
Il seguente schema a blocchi riassume le tappe principali dell’espressione dei geni negli eucarioti
1)
Passaggio DNA al RNA
(Controlli sulla
spiralizzazione del DNA)
1 bis) copie multiple del gene
(Amplificazione genica )
2)
passaggio DNA al RNA
(controlli su attacco RNA
polimerasi)
3) Maturazione del RNA (dal
trascritto primario di RNA al
4) Controlli sul trasporto
(mRNA deve uscire dal
nucleo)
5) Controlli sulla durata del
mRNA
6) controlli traduzionali
7) controlli post traduzionali
1 bis) Copie multiple di uno stesso gene (amplificazione genica)
Negli Eucarioti un gene può essere presente in più copie sul DNA (Amplificazione genica). In questo
modo la produzione della proteina può avvenire più velocemente e, in combinazione con il controllo
sulla spiralizzazione (vedi oltre), può essere controllato da proteine diverse in punti diversi del
cromosoma.
1) Passaggio DNA al RNA (Controlli sulla spiralizzazione del DNA)
Negli Eucarioti le proteine associate al DNA (in particolare gli istoni) ne determinano un arrotolamento
del DNA su se stesso (spiralizzazione). Il DNA spiralizzato (viene detto anche condensato) si colora
intensamente e assume un aspetto scuro, non uniforme, si parla allora di eterocromatina. Se invece il
DNA è poco spiralizzato (cioè poco condensato) la colorazione appare chiara e abbastanza uniforme, si
parla cioè di eucromatina. L’RNApolimerasi NON può attaccarsi al DNA se questo si trova sottoforma
di etero cromatina, mentre può attaccarsi solo se il DNA è in forma di eucromatina. Esistono proteine in
grado di influenzare la spiralizzazione del DNA in alcune zone (proteine rimodellanti) quindi la
presenza o meno di queste proteine può permettere o meno la trascrizione dei geni
2) Passaggio DNA al RNA (controlli su attacco RNA polimerasi)
Ogni gene è preceduto da una sequenza di basi specifica che serve per far avvenire la trascrizione. Tale
sequenza è genericamente definita sito promotore che, negli eucarioti è a sua volta suddiviso in un sito
di legame della proteina regolatrice, un sito di legame dei fattori di trascrizione e un sito di legame del
RNApol. A seguire troviamo il gene la cui parte iniziale è detta sito di inizio della trascrizione. Ad una
certa distanza dai geni poi, possono trovarsi uno o più siti (chiamati, a seconda della modalità di azione,
enhancer oppure silencer) dei quali illustreremo dopo la funzione. Nel sito di legame per l’RNApol è
individuabile una sequenza particolare chiamata TATAbox2 (vedremo oltre la sua funzione)
Sito prot.
regolatrice
Sito legami fatt trascrizione
Sito Promotore
Sito RNApol
(contiene il TATA box)
Sito inizio trascr.
Parte restante del gene da trascrivere
Gene
Negli eucarioti l’RNApol non è in grado da solo di legarsi al DNA , esso necessita di alcuni fattori
proteici, chiamati appunto fattori di trascrizione. L’insieme del RNApol e dei fattori di trascrizione
forma il complesso di trascrizione. Oltre a questi fattori esiste una proteina detta proteina regolatrice
che, come vedremo meglio dopo, ha un ruolo importante nella trascrizione. in grado di aumentare
l’efficienza far modulare ulteriormente il meccanismo di trascrizione.
La sequenza di funzionamento è la seguente:
1) Il primo fattore di trascrizione si attacca al TATAbox. Una volta attaccato esso costituisce una base
di attacco per il successivo fattore il quale favorirà l’attacco del successivo e cosi via…. I primi
fattori di trascrizione non si attaccano al sito di legame per i fattori di trascrizione.
2) Dopo i primi tre fattori di trascrizione si attacca RNApol. Questi si attacca ai fattori e
successivamente si posiziona correttamente sul sito di attacco per RNApol
3) Si attaccano i successivi fattori di trascrizione (il cui numero totale dipende dal gene) fino al
completamento del complesso di trascrizione. I fattori si attaccano agli altri fattori già presenti e si
posizionano sul sito di legame per i fattori di trascrizione
4) Quando tutti i fattori e l’RNApol si sono correttamente attaccati, il complesso di trascrizione è
completo,
A questo punto potrebbe avvenire la trascrizione ma con tempi lunghi e scarsa efficienza
5) La proteina regolatrice può attaccarsi al sito di legame per la proteina regolatrice. La presenza
della proteina regolatrice fa aumentare notevolmente l’efficienza del processo di trascrizione
Un ulteriore controllo dell’efficienza del processo di trascrizione avviene grazie due gruppi di proteine
chiamate attivatori (o proteine attivatrici) e repressori. Entrambi i tipi di proteine si legano a specifici
siti del DNA chiamati siti Enhancer (dove si attaccano gli attivatori) e Silencer (dove si attaccano i
repressori). L’attacco della proteina su questi siti provoca il ripiegamento del DNA fino a posizionare la
proteina in prossimità del complesso di trascrizione. Se si tratta di una coppia enhancer/attivatore si
avrà un’accelerazione nella formazione del complesso di trascrizione e nell’efficienza di questo nella
trascrizione Si potrebbe infatti osservare che un gene può essere trascritto anche più volte, attraverso la
formazione di più complessi di trascrizione. Analogamente la presenza di una coppia silencer/repressore
può rallentare sia la formazione del complesso di trascrizione che l’efficienza del processo di
trascrizione. Per usare una metafora automobilistica, la messa in marcia dell’automobile dipende dal
sistema cambio/frizione (i fattori generali e la proteina regolatrice ) la regolazione fine della velocità è
data dal pedale dell’acceleratore che può essere premuto (enhancer/attivatore) o sollevato
(silencer/repressore)
La figura riassume in modo schematico quanto descritto fino ad ora.
2
La sequenza TATA è spesso presente anche nei procarioti e rappresenta il punto di riconoscimento del promotore da parte del
RNApol
3) Maturazione RNA
Negli Eucarioti il trascritto primario del RNA non è traducibile direttamente in proteine da parte dei
ribosomi se prima non viene “rielaborato”. Tale rielaborazione è operata da alcuni enzimi che:
1) Aggiungono un cappuccio di testa sul RNA con legame insolito 5’-5’, (formato da un particolare
nucleotide, la metil guanosina trifosfato) tale fase è chiamata capping. Il cappuccio premette al RNA
di essere riconosciuto dal ribosoma, di essere guidato dalle proteine di trasporto e ne regola la durata
nel tempo (persistenza) e ne facilita lo splicing (vedi oltre)
2) Effettuano una ripulitura del trascritto eliminando le sequenze interne al geni che non sono
necessarie alla codifica (introni) e ricucendo tra di loro le sequenze necessarie alla codifica (esoni).
Tale fase è operata da proteine chiamate snRNPs (pronounced "snurps") ed è chiamata fase di
splicing . Riassumendo in estrema sintesi quindi lo splicing consiste nel taglio degli introni e
saldatura degli esoni fra di loro. Va detto che in alcuni casi certi introni non vengono tagliati e si
trasformano pertanto in esoni codificanti. In questo caso si parla di Splicing alternativo. Lo splicing
alternativo è importante perché permette ad uno stesso gene di produrre proteine anche diverse a
seconda del contesto cellulare. Questo spiega ad esempio perché nel DNA umano sono presenti solo
25000 geni pur avendo l’uomo oltre 150000 fenotipi proteici diversi.
3) Aggiungono una coda di circa 200 nucleotidi di adenina (coda poli A) questa fase è anche chiamata
poliadenilazione (o semplicemente aggiunta di coda poliA). La funzione della coda poliA sembra
essere legata alla traduzione (la sintesi non avviene se non c’e’ la coda) e alla stabilità del mRNA
In definitiva se non avviene la fase di maturazione l’RNA non è utilizzabile al fine della traduzione. Nel
caso ad esempio di trascrizione multipla dei geni, l’abbondanza o meno delle proteine che effettuano la
maturazione può rendere più o meno efficiente il la formazione finale delle proteine
4) Controlli sul trasporto di mRNA
Negli eucarioti l’mRNA si forma nel nucleo mentre la sintesi avviene nel citoplasma o nel Reticolo
Endoplasmatico. Quindi l’efficienza globale del processo di traduzione dipende anche dalla fase di
trasporto. A sua volta questo dipende dall’abbondanza dei pori nucleari e dalle strutture proteiche
funzionali al trasporto, dalle proteine mediatrici del trasporto e dalle strutture del mRNA aggiunte in
fase di capping
5) Controlli sulla durata del mRNA
Più a lungo dura la molecola di mRNA, più volte avviene la traduzione di quel gene. La degradazione
del mRNA dipende da enzimi tipo mRNA-asi (principalmente chiamati ARE e IREs). La scarsità di
questi enzimi aumenta il numero di molecole proteiche prodotte
6) Controlli traduzionali
Esistono proteine in grado di impedire l’attacco del mRNA al ribosoma modificando chimicamente il
cappuccio di testa. In altri casi esistono proteine specifiche chiamate repressori della traduzione che si
attaccano al mRNA al posto del ribosoma. Questi repressori devono essere attivati/disattivati da altre
molecole, in genere proprio quelle prodotte dalla sintesi, si viene così a costituire un meccanismo di
feedback. Se la concentrazione della proteina tradotta è elevata, si attiveranno molti repressori che
saranno in grado di inibire la sintesi, viceversa se il numero di proteine prodotte dalla sintesi è
abbastanza basso, non ci saranno molecole a sufficienza per attivare i repressori e quindi la sintesi non
verrà rallentata/bloccata.
7) Controlli post traduzionali
Oltre ai meccanismi di rielaborazione già citati in questo stesso articolo per i procarioti, esistono anche
sistemi tipici degli eucarioti che portano alla degradazione delle proteine. Il principale sistema è basato
su una proteina segnale chiamata ubiquitina3, e si attua attraverso questi passaggi:
1) Un enzima lega l’ubiquitina alla proteina-bersaglio da distruggere
2) Dopo la prima molecola di ubiquitina se ne legano altre formando un complesso poli-ubiquitina
3) Il complesso si lega poi ad una particolare struttura sovra molecolare enzimatica chiamata
proteasoma4. Il proteasoma è formato da varie sub unità ciascuna in grado di catalizzare la rottura in
specifici punti delle catene polipeptidiche
4) La proteina da degradare “scorre” all’interno della cavità del proteasoma e viene tagliata in singoli
frammenti e l’ubiquitina viene liberata e resa disponibile per nuove degradazioni.
La figura sottostante riassume i passaggi di questo processo degradativo
In definitiva la quantità di proteasomi e ubiquitine e soprattutto dell’enzima che lega proteina e
ubiquitina, possono determinare la durata delle proteine prodotte dalla sintesi
3
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In sistema basato sull’ubiquitina è presente anche in alcuni procarioti, tuttavia nelle cellule eucariote è universale e sempre presente
Dal punto di vista funzionale è simile ai lisosomi, ma non è dotato di membrana e compartimentazioni come i lisosomi