Diapositiva 1

Seconda Università degli Studi di Napoli
DiSTABiF
Anno Accademico 2015-16
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA
Insegnamento di
BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE
degli ALIMENTI
Prof. Augusto Parente
Lezione 19-20
CARBOIDRASI
Le CARBOIDRASI sono enzimi che catalizzano idrolisi e sintesi dei “carboidrati”.
Esse comprendono:
1- Amilasi che agiscono sull’amido
2- Maltasi che agiscono sul maltosio (per dare glucosio)
3- Lattasi che agiscono sul lattosio (per dare galattosio e glucosio)
4- Invertasi e saccarasi che agiscono sul saccarosio (per dare glucosio e fruttosio)
5- Glucanasi che agiscono sui glucani (i.d. polimeri del glucosio: amilosio,
cellulosa, zimosano (prodotto glucidico che non ha una ben definita
composizione. Corrisponde al residuo insolubile del lievito autolisato. Contiene
essenzialmente -1->3 glucani e glucomannani), glicogeno, amilopectina,
pullulano, curdlano (legami beta 1->3); ciclodestrine; destrano (legami 1->6).
I legami tra le unità di glucosio sono molto variabili. Possono essere di tipo  e
 e in 1->4; 1->6; 1->3; o 1->1 (trealosio). Vari -glucani di origine vegetale
rafforzano il sistema immunitario).
6- Pullulanasi (o enzima deramificante);
7- Cellulasi (producendo cellodestrine, cellobiosio e/o glucosio
8- Elicasi che agiscono sui legami glicosidici  1->3 (da non confondere con
l’enzima implicato nel processo di replica del DNA)
9- Pectinasi
10- Chitinasi
11- ecc.
Si possono avere due tipi di CARBOIDRASI, a seconda che idrolizzano all’interno
(endo) o alle estremità (eso) delle molecole substrato.
Le endo-carboidrasi (es. l’-amilasi) catalizzano l’idrolisi dei legami glicosidici
interni, mentre le eso-carboidrasi (es. la -amilasi) catalizzano l’idrolisi dei
carboidrati rimuovendo unità di -maltosio* dalle estremità NON RIDUCENTI di
carboidrati complessi.
La sua azione termina in prossimità dei legami intercatena 1->6.
Quindi l’amilosio lineare viene completamente idrolizzato in maltosio,
mentre l’amilopectina ramificata, viene degradata solo in parte e si trasforma in
-maltosio e -destrine limite.
Le pectinasi sono state già trattate
• *Cellobiosio: -D-Glucosio (1 -> 4)  -D-Glucosio
•  -Maltosio: -D-Glucosio (1 -> 4)  -D-Glucosio
ENZIMI AMILOLITICI
L’amido, uno dei polimeri più abbondanti sulla Terra, è un polimero di molecole
di glucosio, legate mediante legami alfa-glicosidici:
Amilosio  glucano lineare con legami alfa-1,4
Amilopectina  glucano lineare con legami alfa-1,4 e ramificato con legami alfa1,6
Le amilasi (-amilasi, -amilasi, -amilasi o glucoamilasi o amiloglucosidasi) scindono le
catene dei costituenti dell’amido, introducendo una molecola d’acqua, a livello dei legami
glucosidici.
ENDOAMILASI (-amilasi)
PM 15-50k
Industria alimentare
Attaccano il polimero all’interno delle catene a qualsiasi punto.
Scindono il legame -1,4 e portano alla formazione di DESTRINE di diversa lunghezza
(eritrodestrine con PM elevato e le acrodestrine con PM più basso).
Es. la ptialina salivare, l’amilasi pancreatica, la takadiastasi (alfa-amilasi da A. orizae) e
diverse amilasi di microrganismi.
Le endoamilasi salivari e pancreatiche hanno una elevata attività, con pH ottimale
intorno a 7.
L’amilasi pancreatica può idrolizzare 4 milioni di volte il suo peso in amido.
ESOAMILASI
(presenti in vegetali o microrganismi)
Attaccano le estremità non riducenti delle catene di -D-glucosio e liberano
- molecole di maltosio, idrolizzando il penultimo legame glicosidico -1->4;
- molecole di glucosio, idrolizzando l’ultimo legame -1->4 o -1->6 o -1->3.
Nel primo caso abbiamo le -amilasi.
Nel secondo caso si hanno le glucoamilasi o -amilasi o amiloglucosidasi.
Un esempio di -amilasi disponibile commercialmente è quella prodotta da Aspergillus o
Rhizopus. Ha una bassa specificità e idrolizza legami -1,4 , ma anche (benchè a velocità
minore) -1,3 e -1,6.
Libera -glucosio.
Le glucoamilasi sono utilizzate nell’industria della lavorazione e trasformazione dell’amido
per preparare sciroppo di GLUCOSIO.
AMILASI COINVOLTE NELLA IDROLISI DEI CARBOIDRATI ALIMENTARI
Saliva e succo
pancreatico
Orletto a spazzola
Prodotti
finali
Substrato
Enzima
Substrato
Enzima
Amilosio
Amilasi
(salivare-pH
opt. 6,9;
pancreatica)
Maltotrioso,
Maltosio
Isomaltasi (50)*
Maltasi (25)
Saccarasi (25)
Glucosio
Amilopectina
Amilasi
-destrina limite
(ramificata)
Isomaltasi
(-destrinasi) (95)
Glucosio
Maltasi (5)
* Importanza
relativa per
Saccarosio
Saccarasi (100)
Glucosio e
fruttosio
Lattosio
Lattasi (100)
Galattosio
e glucosio
il substrato

-amilasi
-amilasi

8
-amilasi
-amilasi
Maltosaccaridi lineari con grado di
polimerizzazione (GP) 6-22 C
-amilasi
Sebbene le diverse amilasi catalizzino la stessa reazione – idrolisi del legame alfaglicosidico sullo stesso substrato– sono differenti sia per struttura che per
meccanismo di reazione.
STRUTTURA 3D delle - e -AMILASI
Sia le - che le -amilasi hanno una struttura a TIM-barrel* [il classico
(/)8-barrel fold]. (es. TIM= trioso-P-isomerasi)
Il dominio catalitico consiste in una struttura a botte formata da 8 foglietti 
paralleli, circondati da 8 -eliche, collegate da regioni loop di varia lunghezza
(le botti non sono identiche nei dettagli).
Colorazione dal blue (N-terminale) al rosso (Cterminale)
Dominio B
* Barrel= barile
STRUTTURA della GLUCOAMILASI
La struttura 3D delle glucoamilasi (-amilasi) consiste di 6 -eliche parallele,
circondate da altre 6 -eliche, parallele tra loro ma antiparallele rispetto alle
prime [(/)6-barrel fold], collegate anch’esse da regioni loop di varia
lunghezza.
Barrel= barile
In base alle differenze e alle similarità delle strutture primarie, gli enzimi
amilolitici sono stati classificati nella famiglia delle idrolasi glicosidiche (GH, EC
3.2.1.-):
1. -amilasi – clan GH-H (famiglie GH13, GH70 e GH77)
2. -amilasi – famiglia GH14
3. glucoamilasi – famiglia GH15.
Questa classificazione riflette anche le
differenze nel meccanismo di reazione tra i tre
tipi di amilasi.
http://www.cazy.org/
Clan GH-H: famiglie GH13, GH70 e GH77
Comprende non solo idrolasi (EC 3), ma anche
transferasi (EC 2) e isomerasi (EC 5= es. TIM):
GH13, GH70 e GH77 rappresentano la famiglia
delle -amilasi.
Le caratteristiche catalitiche comuni ai circa 30
enzimi del clan GH-H sono:
1. Dominio catalitico TIM-barrel [(/)8barrel fold], con un lungo loop che unisce
il filamento 3 con l’elica 3, noto come
dominio B;
2. Stesso meccanismo di reazione, in cui l’aspartato del filamento 4 funge
da base (nucleofilo) e il glutammato 5 funge da donatore di protoni
(catalisi acido-base), con l’aiuto di un terzo residuo di aspartato 7,
essenziale per il legame con il substrato.
3. Utilizzano un meccanismo che mantiene la conformazione anomerica del
legame -glicosidico.
Presentano strutture primarie
molto diverse, sono conservati
dagli 8 ai 10 residui, essenziali
per l’attività enzimatica
E 
H 3 e 7
D 4 e 7
Base
nucleofilo
Famiglia delle -amilasi GH13
Comprende più di 30 enzimi e più di 2000 sequenze e rappresenta la più
importante famiglia del clan GH-H.
Famiglia delle -amilasi GH14 e delle glucoamilasi GH15
Entrambe utilizzano un meccanismo di inversione della conformazione
anomerica del legame -glicosidico: i prodotti di reazione sono infatti anomeri.
-amilasi GH14
I residui coinvolti nella catalisi
sono Glu186 e Glu380, al C
terminale dei filamenti beta 4 e
beta
7,
rispettivamente.
Indispensabile anche il ruolo di
Asp101 e Leu383.
Glucoamilasi GH15
I residui di Glu179 e Glu400 sono i
residui chiave per l’attività
catalitica.
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
-amilasi
L’enzima più utilizzato per la degradazione industriale dell’amido è la aamilasi, una -1,4-glucanoidrolasi.
L’enzima (EC 3.2.1.1) contiene una
caratteristica tasca di legame per il
substrato, che può accogliere da 4 a 10
unità di glucosio della molecola di
substrato, sebbene ogni sito di legame
ha affinità per una sola unità di glucosio
della catena polisaccaridica di amido.
Le differenze, strutturali e cinetiche, tra le varie -amilasi sono determinate da:
1. numero di siti di legame per il substrato
2. posizione del dominio catalitico
3. lunghezza del frammento oligosaccaridico rilasciato in seguito all’idrolisi
4. natura del prodotto finale
5. Capacità di rompere un legame -1,4 in prossimità di una ramificazione 1,6
6. temperatura ottimale di reazione (varia tra i 25 e i 95°C)
7. presenza di ioni Ca2+
Le -amilasi catalizzano la rottura del legame -1,4-glicosidico nella porzione
interna della molecola di amido, causando una rapida diminuzione del peso
molecolare.
Possono essere divise in:
1. -amilasi che provocano liquefazione  substrato con più di 15 unità di
glucosio
2. -amilasi che provocano saccarificazione  (processo industriale che
consiste in una idrolisi amilasica dell’amido gelatinizzato*, che fornisce
essenzialmente maltosio).
L’idrolisi prolungata dell’amilosio produce maltosio, maltotriosio e catene
oligosaccaridiche di varia lunghezza, cui generalmente segue un secondo stadio
della reazione che produce glucosio dal maltotriosio.
* Gelatinizzazione: perdita della struttura semicristallina del granulo di amido in
seguito a trattamento idrotermico ( >50°C).
Le -amilasi vengono utilizzate in un gran numero di processi industriali, che
avvengono sotto diverse condizioni fisiche e chimiche.
Ogni enzima è specifico per ciascuna applicazione
Generalmente, enzimi termostabili vengono preferiti, visto che le alte
temperature:
 favoriscono la gelatinizzazione (perdita della struttura semicristallina del
granulo di amido in seguito a trattamento idrotermico.)
 abbassano mediamente la viscosità
 accelerano la velocità della reazione
 abbassano il rischio di contaminazioni batteriche
 inattivano gli enzimi dei prodotti alimentari, che potrebbero portare alla
formazione di prodotti indesiderati durante la reazione.
L’-amilasi termostabile più utilizzata è quella prodotta dal Bacillus
licheniformis  rimane attiva per diverse ore alla temperatura di 90°C
Pyrococcus woesei  40-130°C (optimum 100°C, pH 5.5)
Pyrococcus furiosus  40-130°C (optimum 100°C, pH 6.5-7.5)
Tuttavia, per i processi industriali, le -amilasi dovrebbero rimanere attive ad
un pH intorno a 4.0
Nessuna delle -amilasi termostabili ha una stabilità a tale pH, quindi studi di
ingegneria proteica stanno cercando di favorire questa proprietà.
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
Enzimi deramificanti
Ci sono due principali gruppi di enzimi endo-deramificanti, che tagliano il legame
 -1,6-glicosidico di amilopectina, glicogeno, pullulani e relativi oligosaccaridi:
Pullulanasi (EC 3.2.1.41)  attaccano il legame -1,6, liberando oligosaccaridi
lineari di glucosio -1,4.
Neopullulanasi e amilopullulanasi (EC 3.2.1.135 e 3.2.1.1/41) attive verso
entrambi i legami (-1,4 e -1,6)
Le pullulanasi sono piuttosto termostabili:
Klebsiella pneumoniae, Bacillus acidopullulyticus  50-60°C
Thermus caldophilus  75°C - fino a 90°C, pH 5.5
La maggior parte delle amilopullulanasi viene estratta da batteri termofili:
Bacillus subtilis
Thermoanaerobium brockii
Clostridium thermosulphuricum
Thermus acquaticus
Pyrococcus woeser  105°C, pH 6.0
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
Eso-idrolasi
-amilasi (EC 3.2.1.2)
glucoamilasi (EC 3.2.1.3)
Entrambe agiscono alle estremità non riducenti di amilosio, amilopectina e
glicogeno, producendo carboidrati di basso peso molecolare in
conformazione -anomerica.
Il principale prodotto finale dell’idrolisi catalizzata dalla -amilasi è il
maltosio; la glucoamilasi produce glucosio.
Strutturalmente, questi due enzimi fanno parte rispettivamente delle famiglie
GH14 e GH15, ma, mentre le -amilasi presentano una struttura (/)8-barrel
fold, le glucoamilasi hanno una struttura (/)6-barrel fold.
Tutte le -amilasi non sono in grado di tagliare i
legami -1,6 e i prodotti finali sono rappresentati
da maltosio e destrine “-limite” ( polimeri
prodotti dall’idrolisi dell’amilopectina con amilasi, che non può idrolizzare i punti di
ramificazione -1, 6)
Quando quindi la degradazione dell’amilopectina è completa, solo il 50-60%
risulta convertito in maltosio. Solo nel caso dell’amilosio, che non presenta o
che presenta poche ramificazioni, la resa è del 75-90%.
L’accumulo di destrine -limit non è desiderabile perché aumenta la viscosità
degli sciroppi di maltosio.
Le -amilasi sono presenti in molte piante superiori e in microrganismi quali
Pseudomonas, Bacillus e Streptococcus, ma non resistono a temperature
superiori ai 60°C.
Le glucoamilasi tagliano preferenzialmente i legami
-1,4, ma possono tagliare anche quelli -1,6 e -1,3
le glucoamilasi sono capaci di degradare
completamente l’amido in glucosio
A concentrazioni medie di glucosio del 30-35% durante la reazione, le
glucoamilasi possono anche catalizzare la reazione inversa e formare
maltosio, isomaltosio e altri sottoprodotti, abbassando quindi la resa del
processo.
Fonti:
- Piante
- Animali
- Microrganismi (Saccharomices, Endomycopsis, Aspergillus, Penicillium,
Mucor, Clostridium)
45-60°C (come le -amilasi, sono rare tra i microrganismi termofili)
pH 4.5-5.0
APPLICAZIONI
1- Preparazione di idrolizzati di amido
La reazione di degradazione dell’amido avviene in 2 step.
i) Liquefazione
Il 30-40% dei granuli di amido è gelatinizzato*, ad una temperatura di 90-115°C.
L’aggiunta di endoamilasi termostabili (EC 3.2.1.1) in questa fase del processo
protegge dal rapido aumento della viscosità della soluzione di amido, causata dal
rilascio di amilosio durante il rigonfiamento dei granuli.
L’idrolisi enzimatica dell’amilosio da parte dell’-amilasi procede fino a quando
la lunghezza della catena del prodotto di reazione contiene circa 10-20 unità di
glucosio: a questo punto, infatti, il frammento di amido prodotto non riesce più
a legare bene l’enzima.
Si produce quindi una miscela di malto-oligosaccaridi che contengono legami 1,6 che l’ -amilasi non è stata in grado di rompere.
* Perdita della struttura semicristallina del granulo di amido in seguito a trattamento
idrotermico. La gelatinizzazione riguarda soprattutto l’amilosio che tende a venir espulso
dal granulo. Aumenta notevolmente la suscettibilità all’idrolisi da parte di amilasi ed è
accompagnata da un aumento della viscosità.
II)SACCARIFICAZIONE
Questo processo avviene a temperature più basse (55-60°C) e
porta all’idrolisi degli oligosaccaridi con formazione di glucosio o
maltosio in reazioni catalizzate dalle glucoamilasi (EC 3.2.1.3) o
dalle beta-amilasi (3.2.1.2), rispettivamente.
La resa della reazione può essere aumentata (fino al 94%)
aggiungendo pullulanasi (EC 3.2.1.41) o altri enzimi deramificanti
l’uso delle pullulanasi aumenta la resa fino al 94%.
Segue-> Preparazione di idrolizzati d’amido
Ca2+
aumenta la
stabilità dell’enzima
v
105-90°C
DE= destrosio
equivalente
(Destrosio= glucosio)
Per l’amido: DE=1
Per il maltosio: DE=ca.50
Per il glucosio puro: DE=100
Segue-> preparazione di idrolizzati di amido
1
-amilasi termostabili
(B. lichenifromis  90°C, pH 5.5-6.0)
2
-amilasi e glucoamilasi  non termostabili
3
Segue-> preparazione di idrolizzati di amido
4,5 è il pH della sospensione di amido. Quindi bisogna prima aggiustare il pH a 6
(con NaOH) perché a questo valore sono attive le -amilasi.
Successivamente la temperatura deve essere abbassata ed il pH portato a 4 (con
HCl) per favorire l’azione delle beta-amilasi e glucoamilasi .
La necessità di aggiustare pH e temperatura, rendono il processo più costoso e
rendono necessario un ulteriore passaggio cromatografico sul prodotto finale per
eliminare l’NaCl formatosi.
Allora una importante innovazione di questo processo potrebbe essere
rappresentato dalla degradazione dell’amido in un unico step, disponendo di:
1.
-amilasi più stabili termicamente, che richiedano un pH più basso e non
richiedano l’utilizzo di sali di calcio per la propria attività
2.
Tutti gli enzimi della fase di saccarificazione attivi a condizioni compatibili con
quelle dell’-amilasi  -glucosidasi (EC 3.2.1.20)  idrolisi del legame -1,4
all’estremità non-riducente e -1,6, con formazione di glucosio come prodotto
finale.
2- Isomerizzazione del glucosio
L’isomerizzazione del glucosio derivato dall’amido in fruttosio conferisce una
maggiore dolcezza agli sciroppi comunemente utilizzati per i prodotti alimentari
e le bevande (saccarosio 1; fruttosio 1,35-1,7; glucosio e galattosio 0,75;
maltosio 0,4).
Lo sciroppo di fruttosio viene generalmente preparato utilizzando un processo in
continuo catalizzato dalla glucosio isomerasi (EC 5.3.1.5) immobilizzata, ad una
temperatura di 55-60°C.
A queste condizioni, solo il 40-42% di glucosio viene convertito in fruttosio. La
resa del processo può essere aumentata alle alte temperature che spostano
l’equilibrio della reazione verso un aumento della concentrazione del fruttosio.
Questo però fa diminuire la vita media dell’enzima, estratto da un batterio
mesofilo, e aumenta la quantità di sottoprodotti che si formano in seguito alla
reazione di Maillard che interviene proprio ai valori di pH leggermente alcalini
necessari per l’attività della glucosio isomerasi.
Anche in questo caso è necessaria una gel-filtrazione per allontanare il glucosio
e altri grossi polisaccaridi presenti.
Questo passaggio può essere evitato utilizzando una glucosio-isomerasi
maggiormente termostabile, che sia attiva ad un pH più acido, in modo da
evitare indesiderate reazioni collaterali.
3- Produzione di trealosio
Gli sciroppi di amido o di maltosio possono essere
trasformati in trealosio, in una reazione catalizzata
da un enzima isolato da microrganismi termofili o
mesofili.
Il trealosio è un disaccaride stabile, non riducente,
formato da un legame -1,1 tra due molecole di
glucosio.
E’ coinvolto nella protezione delle strutture biologiche durante il congelamento,
essiccamento o la cottura. I cristalli amorfi di trealosio :
 intrappolano le molecole biologiche, senza modificarne la struttura nativa e
limitando di conseguenza i danni alle sostanze durante l’essiccamento
 sono permeabili all’acqua ma impermeabili agli esteri aromatici idrofobici:
questo limita la perdita di composti aromatici responsabili de sapori e questo
favorisce la produzione di cibi essiccati che mantengano lo stesso sapore del
prodotto fresco.
Il trealosio inoltre:
 è leggermente dolce
è solubile
 è stabile a pH bassi
 riduce l’attività dell’acqua
 ha bassa igroscopicità
 abbassa la temperatura di congelamento
 non caramellizza
 non subisce la reazione di Maillard
prezioso ingrediente alimentare
Viene utilizzato per:
bevande, cioccolata e caramelle, prodotti da forno, latticini, derivati della
frutta……..
Gli enzimi utilizzati per la produzione di trealosio dall’amido sono:
1. maltooligosil-trealosio sintasi  converte il legame alfa-1,4 terminale
dell’estremità riducente del maltooligosaccaride nel legame alfa-1,1 del
trealosio
2.maltooligosil-trealosio trealo-idrolasi  rimuove il trealosio durante
l’idrolisi del legame alfa-1,4 tra la seconda e la terza unità di glucosio,
ripetendo questa operazione fino a quando la catena oligosaccaridica
rimanente consiste di 2, massimo 3 unità di glucosio.
Il maltooligosaccaride di partenza viene prodotto trattando l’amido
liquefatto con enzimi deramificanti.
4- Sintesi di ciclodestrine
Gli enzimi amilolitici (batterici) vengono utilizzati anche per la produzione di
ciclodestrine.
1.
-amilasi e pullulanasi  oligosaccaridi non ramificati
2.
Ciclomaltodestrina glucanotransferasi  taglio degli oligosaccaridi lineari
per ottenere oligosaccaridi di 8 unità. Questo enzima è estremamente
termostabile (fino a 100°C) e possiede anche un’attività -amilasica e
questo consente la produzione di ciclodestrine senza l’aggiunta delle alfaamilasi per la liquefazione preliminare.
A causa della struttura elicoidale di questi
oligosaccaridi, le due estremità di ciascuna
molecola sono molto vicine e di conseguenza
possono facilmente unirsi a formare la struttura
caratteristica delle ciclodestrine.
Il prodotto finale è una miscela di
-, - e -ciclodestrine a 6, 7 o 8
residui di glucosio, rispettivamente
con legami  -1,4.
Le ciclodestrine hanno una
struttura conica in cui i gruppi
ossidrilici sono localizzati sulla
superficie, mentre l’interno è
apolare e può facilmente formare
complessi
con
molecole
idrofobiche .
Es.
1. Rimozione dell’amaro dai succhi
di agrumi
2. Protezione
dei
lipidi
dall’ossidazione
3. Rimozione del colesterolo dalle
uova
Incapsulamento di principi aromatici