Regolazione genica negli eucarioti

Principi di genetica - Robert J. Brooker
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Soluzioni ai problemi del Capitolo 15
Domande concettuali
C1.
1. La struttura DNA-cromatina. Questo livello comprende l’amplificazione genica, un aumento del
numero di copie; riarrangiamenti di geni, come nel caso dei geni delle immunoglobuline; la
metilazione del DNA, che inibisce la trascrizione; le regioni di controllo di specifici loci, che
agiscono localmente sulla conformazione della cromatina.
2. La trascrizione. Questo livello comprende i fattori di regolazione della trascrizione/gli elementi di
controllo, ossia le interazioni che possono attivare o inibire la trascrizione.
3. Il livello dell’RNA. Questo include la sua maturazione, la regolazione dello splicing, la stabilità
dell’RNA, la regolazione dell’emivita della molecola e la traduzione dell’RNA attraverso le
proteine che legano RNA; la regolazione mediante miRNA.
4. Il livello della proteina. Questo comprende il feedback inibitorio, le piccole molecole che
modulano l’attività enzimatica, le modificazioni covalenti post-trascrizionali che cambiano la
struttura della proteina e influenzano la sua attività.
C2. Gli elementi di controllo sono sequenze relativamente brevi riconosciute da fattori di
trascrizione. Dopo che i fattori di trascrizione si sono legati agli elementi di controllo, l’efficienza
della trascrizione sarà influenzata sia attivandola che inibendola, in base all’azione della proteina di
regolazione. Gli elementi di controllo sono localizzati tipicamente nella regione a monte del
promotore, ma possono essere localizzati in qualunque altra posizione (ossia a monte o a valle) e
anche molto distanti dal promotore.
C3. La modulazione dei fattori di trascrizione si riferisce alle diverse modalità per cui può essere
regolata la funzione di questi fattori. Le tre vie principali sono mediate dal legame di effettori, dalle
interazioni proteina-proteina, e dalle modificazioni covalenti.
C4. L’attivazione trascrizionale avviene quando un fattore di trascrizione si lega a un elemento di
controllo e attiva la trascrizione. Queste proteine, definite transattivanti, possono interagire con
TFIID e/o Mediatore per promuovere l’assemblaggio dell’RNA polimerasi e dei fattori generali di
trascrizione alla regione del promotore. Essi possono inoltre alterare la struttura della cromatina, in
modo che l’RNA polimerasi e i fattori di trascrizione possano avere accesso al promotore.
L’inibizione della trascrizione avviene invece quando un repressore interagisce per esempio con
TFIID e/o Mediatore per inibire l’RNA polimerasi.
C5.
A. Vero
B. Falso
C. Vero
D. Falso, esso causa sovraregolazione.
C6.
A. Legame al DNA
B. Legame al DNA
C. Dimerizzazione proteica
C7. I recettori degli steroidi: il legame di un effettore e le interazioni proteina-proteina; la proteina
CREB: le modificazioni covalenti e le interazioni proteina-proteina.
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C8. Affinché il recettore dei glucocorticoidi si leghi all’elemento GRE, un ormone steroideo deve
anzitutto entrare nella cellula. Esso si lega quindi al recettore dei glucocorticoidi, il quale rilascia la
proteina HSP90. Questo evento rende esposto un segnale di localizzazione nucleare (NLS) del
recettore, che gli consente di formare un dimero e di traslocare nel nucleo. Una volta all’interno del
nucleo, il dimero si lega a una coppia di elementi GRE che attivano la trascrizione dei geni
adiacenti.
C9.
1. Potrebbe trovarsi nel dominio di legame al DNA, così che il recettore non riconoscerebbe gli
elementi GRE.
2. Potrebbe trovarsi nel dominio HSP90, così che HSP90 non sarebbe rilasciata quando si lega
l’ormone.
3. Potrebbe trovarsi nel dominio di dimerizzazione, così che il recettore non potrebbe formare il
dimero.
4. Potrebbe trovarsi nel dominio di localizzazione nucleare, così che il recettore non potrebbe
muoversi all’interno del nucleo.
5. Potrebbe trovarsi nel dominio che attiva l’RNA polimerasi, così che il recettore non potrebbe
attivare la trascrizione, anche se potrebbe legarsi agli elementi GRE.
C10. La fosforilazione della proteina CREB la fa agire da attivatore trascrizionale. La proteina non
fosforilata può ancora legarsi a CRE, ma non stimola la trascrizione.
C11.
A. Nessun effetto
B. Nessun effetto
C. Sarebbe inibita
D. Nessun effetto
C12.
A. L’ormone glucocorticoide alla fine viene degradato dalla cellula. Il legame al suo recettore è un
processo reversibile, che avviene con un certo valore di affinità. Se la concentrazione dell’ormone
cade al di sotto del valore di affinità l’ormone viene rilasciato dal recettore, che cambia
conformazione e non resta ulteriormente legato al DNA.
B. Una fosfatasi rimuoverà i gruppi fosfato dalla proteina CREB, la quale cesserà la sua funzione di
attivatore trascrizionale.
C13. E’ corretta la possibilità 2. Siccome sappiamo già che la proteina E e la proteina Id formano
eterodimeri con bHLH, ci attendiamo che le tre proteine abbiamo tutte un motivo a cerniera di
leucine, che favorisce la dimerizzazione. Inoltre abbiamo bisogno di spiegare perché la proteina Id
inibisca la trascrizione, mentre la proteina E la favorisce. Come si vede dalla possibilità 2, la
proteina Id non ha un dominio di legame al DNA. Perciò, essa forma un eterodimero con bHLH
miogenica, e l’eterodimero probabilmente non si legherà molto bene al DNA. Invece, quando la
proteina E forma l’eterodimero con bHLH, saranno disponibili due domini di legame al DNA e
dunque il legame avverrà appropriatamente (Nota: per una descrizione di queste proteine vai al
Capitolo 23).
C14. L’enhancer che si trova in A funzionerebbe, mentre quelli localizzati in B e in C no. La
sequenza riconosciuta dall’attivatore è 5'–GTAG–3' in un filamento, e 3'–CATC–5' in quello
opposto. Si tratta della stessa disposizione che si osserva in A. Invece in B e in C la disposizione è
5'–GATG–3' e 3'–CATC–5', quindi le due basi centrali (A e T) non sono nell’ordine corretto.
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C15. Ci sono quattro tipi di basi (A, T, G, C) e questa sequenza CRE contiene 8 bp, per cui in base
al semplice caso essa dovrebbe formarsi ogni 48 bp, ossia ogni 65 536 bp. Se dividiamo 3 miliardi
per questo numero ne risulta che ci attendiamo di osservare questa sequenza ogni 45 776 volte.
Questo valore è molto più grande rispetto al numero di geni che sono effettivamente attivati da
CREB. Le ragioni per cui CREB non attiva oltre 45 000 geni sono diverse, per esempio:
1. Un sito CRE funzionale prevede che due di queste sequenze si trovino vicine, perché CREB
funziona da omodimero.
2. I siti CRE casuali potrebbero essere lontani da una sequenza genica.
3. La conformazione della cromatina che contiene una sequenza CRE potrebbe non essere
accessibile a CREB.
C16.
Domini di transattivazione
Domini di
legame
all’ormone
Domini di
dimerizzazione
Domini di legame al DNA
Ecco un disegno ipotetico del recettore dei glucocorticoidi. Esso forma omodimeri. Il dimero qui
rappresentato mostra una simmetria speculare sull’asse verticale. In arancione viene mostrato
l’ormone. Sono indicate le posizioni dei vari domini funzionali.
C17. La mutazione potrebbe causare un difetto in:
1. Un recettore dell’adrenalina
2. Una proteina G
3. Adenilato ciclasi
4. Protein chinasi A
5. La proteina CREB
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6. La sequenza CRE del gene tirosina idrossilasi
Se altri geni fossero regolati in modo appropriato da CREB, potremmo concludere che la mutazione
probabilmente cade nel gene stesso della tirosina idrossilasi. Forse CRE è stata mutata e non
riconosce più la proteina CREB.
C18. La fibra di 30 nm è la forma predominante di cromatina all’interfase. Perché la trascrizione
abbia luogo. la cromatina deve essere convertita dalla conformazione chiusa a quella aperta. Questo
processo implica una diminuzione del livello di ripiegamento della cromatina, e può coinvolgere
modificazioni della localizzazione di proteine istoniche. Gli attivatori trascrizionali reclutano
l’istone acetiltransferasi e gli enzimi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti nella
regione, e avviene la conversione alla conformazione aperta.
C19. La metilazione del DNA è l’aggiunta di un gruppo metilico a una base del DNA. In molte
specie eucariotiche questo avviene sulla citosina in una sequenza CG. Dopo la metilazione de novo
questa viene trasmessa da madre a figlia. Siccome la replicazione del DNA è semiconservativa, il
DNA neosintetizzato contiene un solo filamento metilato. La DNA metiltransferasi riconosce le
doppie eliche emimetilate e aggiunge il gruppo metilico in modo da mantenere lo schema di
metilazione originale.
C20. Forse la metiltransferasi è responsabile della metilazione e dell’inibizione di un gene che porta
la cellula a differenziarsi in cellula del muscolo. La metiltransferasi viene inattivata dalla
mutazione.
C21. Si tratta di una stringa di 1000-2000 coppie nucleotidiche che contengono un numero elevato
di siti CpG. Le isole CpG sono spesso nelle vicinanze dei promotori. Quando l’isola è metilata la
trascrizione è inibita. Questo può essere dovuto all’incapacità degli attivatori di riconoscere i
promotori metilati e/o agli effetti delle proteine che legano metil-CpG, che possono promuovere la
conformazione chiusa della cromatina.
C22. La funzione dei fattori di splicing è quella di influenzare la scelta dei siti di splicing nell’RNA.
In certi tipi cellulari, la concentrazione di particolari fattori di splicing è maggiore che in altri
tessuti. L’elevata concentrazione di questi fattori e la regolazione della loro attività può promuovere
la scelta di determinati siti di splicing e quindi causare uno splicing tessuto-specifico.
C23. Come si vede nella Figura 15.10, la caratteristica unica dell’mRNA dell’α tropomiosina
sintetizzato nel muscolo liscio è che esso contiene l’esone 2. I fattori di splicing specifici del
muscolo liscio possono riconoscere la giunzione di splicing all’estremità 3’ dell’introne 1 e al 5’
dell’introne 2, promuovendo una forma di splicing che include l’esone 2 nel trascritto maturo.
Inoltre, siccome le cellule del muscolo liscio non possiedono l’esone 3 nell’mRNA dell’α
tropomiosina, deve esistere un soppressore dello splicing che si lega al 3’ dell’introne 2,
promuovendo l’esclusione dell’esone 3.
C24. Per un mRNA con vita breve uno svantaggio è che la cellula usa probabilmente molta energia
per produrlo. Se una cellula ha bisogno di una proteina codificata da un mRNA con vita breve, il
gene deve essere trascritto continuativamente a causa della rapida degradazione dell’mRNA. Il
vantaggio è che la cellula interrompe rapidamente la sintesi proteica. Con molecole di mRNA a vita
più lunga, è necessario un periodo di tempo maggiore per spegnere la sintesi proteica dopo che è
terminata la trascrizione.
C25. L’interferenza dell’RNA è il fenomeno per cui in presenza di molecole di RNA a doppio
filamento si ottiene il silenziamento di un mRNA complementare. Perché ciò avvenga la doppia
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elica di RNA deve essere maturata da dicer in piccoli frammenti (i microRNA o miRNA). Questi si
associano con un complesso chiamato RISC e si legano all’mRNA complementare, portando alla
sua degradazione oppure a inibirne la traduzione.
C26. Anzitutto il miRNA a doppio filamento può derivare dalla trascrizione di un gene, sottoforma
di pre-miRNA. Secondo, può essere prodotto da un virus. Terzo, l’inserzione multipla dello stesso
gene in un genoma può portare alla trascrizione di entrambi i filamenti di DNA e quindi alla
produzione di RNA a doppio filamento.
C27. Condizioni quali infezione virale, mancanza di nutrienti, shock termico, esposizione a metalli
pesanti, causano la fosforilazione di eIF2α. Bloccare la sintesi proteica può impedire la
proliferazione del virus. In mancanza di nutrienti, si preservano le risorse. Durante lo shock termico
le proteine potrebbero subire un ripiegamento scorretto, da cui il vantaggio di aver bloccato la
sintesi proteica. Infine, poiché gli ioni metalli sono tossici e possono indurre danno al DNA, è
vantaggioso che l’organismo pluricellulare arresti la divisione cellulare in queste condizioni.
C28. Se la stabilità dell’mRNA è bassa, questo significa che viene degradato più velocemente.
Perciò, la bassa stabilità risulta in bassa concentrazione di mRNA. La lunghezza della coda di poliA
è un fattore che influenza la stabilità. Una coda più lunga rende l’mRNA più stabile. Certi mRNA
possiedono inoltre delle sequenze che influenzano la loro vita media. Per esempio, gli elementi
ricchi in AU si trovano in diversi mRNA a vita breve. Questi elementi sono riconosciuti da proteine
cellulari che conducono l’mRNA a una rapida degradazione.
Domande sperimentali
S1. Un sito sensibile alla DNasi I viene tagliato più spesso di altri siti cromosomici in presenza
dell’enzima. Ciò significa che per conformazione esso è molto accessibile al taglio enzimatico.
Quando un gene diviene trascrizionalmente attivo esso sarà anche più suscettibile alla DNasi I
perché in questa regione il DNA assume la conformazione aperta.
S2. La nucleasi S1 taglia il DNA a singolo filamento ma non quello a doppia elica. Se un gene nella
conformazione aperta viene digerito dalla DNasi I, esso non potrà ibridare con la sonda
complementare. In questo caso la sonda a singolo filamento sarà digerita dalla nucleasi S1. Invece,
se il gene si trova nella conformazione chiusa ed è resistente all’azione della DNasi I, la sonda potrà
ibridare e non verrà digerita da S1. Perciò, la capacità della nucleasi S1 di degradare la sonda ci
riferisce se il gene è stato o non è stato precedentemente digerito dalla DNasi I. Il passaggio di
precipitazione serve a separare i frammenti di DNA dai nucleotidi liberi. Se la sonda marcata è
legata al filamento complementare di DNA, essa sarà protetta dalla degradazione con S1 e verrà
ritrovata nel pellet. Ciò avviene quando il gene della globina si trova nella conformazione chiusa.
Al contrario, se la sonda marcata non si lega al DNA complementare essa sarà degradata in
nucleotidi liberi che restano nel sovranatante. Questo è ciò che avviene se il gene della globina è
nella conformazione aperta.
S3. Questi risultati indicano che i fibroblasti mantengono la metilazione perché dopo la replicazione
possono riconoscere il DNA emimetilato e completare la metilazione. Però le cellule non vanno
incontro a metilazione de novo in quanto se il DNA non era metilato nella cellula figlia esso resterà
tale.
S4. Se la banda di DNA è di 3800 bp, questo significa che non è metilata, perché è stata tagliata da
NotI che non è attivo sul DNA non metilato. Se il frammento è di 5300 bp allora assumiamo che il
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DNA non è stato tagliato da NotI in quanto metilato. Ora consideriamo la corsia 4. Quando il gene
viene isolato dalla radice, esso non è metilato perché la banda è di 3800 bp. Questo suggerisce che il
gene T sia espresso nella radice. Negli altri campioni il DNA forma la banda da 5300 bp, cosa che
indica che esso è metilato. Questo profilo di metilazione è coerente con la funzione nota del gene T:
ci saremmo attesi di trovarlo espresso nelle cellule della radice, dato che la sua funzione è quella di
assorbire il fosfato dal suolo.
S5. Sulla base di questi risultati gli enhancer risultano presenti in A, D ed E. Quando vengono deleti
il livello di trascrizione diminuisce. Nella regione B c’è anche un silenziatore, perché la delezione
di questa regione aumenta il tasso di trascrizione. In C non sembrano esserci elementi di controllo,
perlomeno non elementi attivi nel muscolo. La regione F contiene il promotore centrale e la sua
delezione inibisce la trascrizione.
S6.
A. Sulla base della transfezione delle cellule di rene si ritiene che la regione B contenga un
silenziatore. Sulla base della transfezione delle cellule pancreatiche si ritiene che la regione A
contenga un enhancer.
B. Le cellule pancreatiche non esprimono il repressore che si lega al silenziatore della regione B.
C. Le cellule di rene esprimono il repressore che si lega alla regione B e reprime la trascrizione.
Esse esprimono il gene a valle solo se il silenziatore viene rimosso. Come si è detto in B, questo
repressore non è espresso nelle cellule pancreatiche.
S8. Quando essi hanno iniettato l’RNA antisenso di mex-3, hanno osservato livelli più bassi ma
misurabili dell’mRNA di questo gene. Tuttavia l’iniezione di entrambi i filamenti di senso e
antisenso che porterebbe alla formazione di una struttura a doppio filamento, causa la perdita
completa dell’mRNA di mex-3 dalle cellule, perché l’RNA a doppio filamento silenzia il gene.