Risultati_GMO_CEQ-ISS 2015 [PDF

GENETICA MOLECOLARE ONCOLOGICA
Presentazione a cura di: dott.ssa Alessandra Viel
2014 Programma Pilota concluso nel 2015 con 21 laboratori partecipanti.
2015 primo turno: non ancora concluso, le valutazioni sono in fase di revisione.
20 laboratori partecipanti.
Schemi
•
Poliposi Adenomatosa del Colon (geni APC e MUTYH)
•
Tumore ereditario della mammella e dell’ovaio (geni BRCA1 e BRCA2)
•
Sindrome di Lynch (geni MLH1 e MSH2)
Obiettivi del CEQ
1. Verificare la qualità dei risultati rilasciati dai laboratori, interagendo con essi e, dove necessario,
supportandoli nel miglioramento.
2. Ottenere una refertazione chiara, uniforme e completa tra i laboratori nazionali che includa una
completa interpretazione del risultato in presenza di varianti patogenetiche, varianti a significato
incerto, ed esito negativo del test.
Organizzazione del CEQ
Ogni schema è costituito da due componenti: una relativa ai referti mandati dai laboratori secondo
indicazioni richieste (parte retrospettiva), ed una riguardante la risoluzione di esercizi proposti.
Parte retrospettiva (referti)
Per ogni schema è stato chiesto ai partecipanti l’invio di referti (anonimi) ed immagini di dati grezzi
relativi all’ultimo caso analizzato dell’anno 2015 secondo le seguenti istruzioni:
• Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta
• Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta
• Un caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta (senza dati
grezzi)
La richiesta ha riguardato probandi testati per la ricerca di mutazioni ignote
Qualora la classificazione della variante fosse variata nel periodo compreso tra la data di refertazione e la data di
inserimento dei casi nella piattaforma del CEQ, sarebbe stato necessario allegare anche il referto rettificato
Esercizi proposti
Sono stati inviati degli “esercizi” consistenti in 3 varianti per gene (=6 per schema), indicate con
nomenclatura HGVS, è stato chiesto ai partecipanti di indicare la nomenclatura proteica (secondo HGVS),
la sede (n. esone o per le varianti introniche l’esone più vicino) e l’interpretazione
Valutazione
La parte retrospettiva e gli esercizi proposti avranno DUE VALUTAZIONI SEPARATE basate sui criteri di
valutazione pre-definiti :
•Verifica della completezza e correttezza dei parametri di genotipizzazione, interpretazione e
refertazione per la parte retrospettiva dello schema
•Correttezza e completezza dell’interpretazione per gli esercizi inviati.
Per il primo turno di CEQ (differentemente dal turno pilota), sono state definite due categorie di
performance: SUFFICIENTE (con punteggi specifici) e INSUFFICIENTE.
LIMITATAMENTE alla sola parte retrospettiva non saranno attribuiti punteggi di valutazione e giudizio di performance
ai laboratori che:
-
non invieranno tutti i casi richiesti per lo schema;
invieranno i casi di anni precedenti a quello richiesto
Verranno comunque commentati tutti i parametri dei casi inviati
Criteri di valutazione - Parte retrospettiva
(Massimo punteggio ottenibile: 14 punti)
Il punteggio risultante dalla valutazione sarà calcolato per sottrazione dal punteggio massimo
attribuito ad ogni parametro
Analisi del genotipo (max 5 punti)
– Qualità del dato grezzo
– Nomenclatura HGVS
– Metodo di analisi
– Varianti/regioni del gene analizzate
– Informazioni circa la validità del test
Interpretazione (max 5 punti)
– Interpretazione assente o errata
– Significato patogenetico delle varianti rilevate espresso chiaramente
– Rimando ad ulteriori analisi, se analisi non conclusiva
– Rimando alla consulenza genetica
Referto (max 4 punti)
– Formato e contenuto
Errori critici
In ogni caso, viene assegnato un giudizio di performance insufficiente al laboratorio
quando, anche per un solo caso, si verifica una delle seguenti condizioni (errori critici):
1. Genotipo non corretto, per non corrispondenza con il dato grezzo
2. Dati grezzi assenti o di scarsa qualità (non interpretabili)
3. Interpretazione del risultato in riferimento all’indicazione clinica assente o
classificazione errata della/e variante/i identificata/e:
-
Variante patogenetica (C5) classificata come a significato incerto (VUS = C3) o
neutra/probabilmente neutra (C1, C2)
-
Variante probabilmente patogenetica (C4) classificata come neutra/probabilmente neutra (C1,
C2)
-
VUS (C3) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4)
-
Variante neutra/probabilmente neutra (C1, C2) classificata come patogenetica/probabilmente
patogenetica (C5, C4)
La performance di un laboratorio sarà ritenuta insufficiente anche quando, pur non
verificandosi nessuna delle situazioni su menzionate, la qualità generale dei referti è tale
per cui non si raggiunge nella somma dei punteggi assegnati di genotipizzazione e
interpretazione un punteggio di 5/10
Human Mutation (2008) 29:1282–1291.
VUS
Criteri di valutazione - Esercizi
(Massimo punteggio ottenibile: 30 punti)
Il punteggio risultante dalla valutazione sarà calcolato per sottrazione dal punteggio massimo
attribuito ad ogni esercizio (5 punti ogni esercizio).
In ogni caso, viene assegnato un giudizio di performance insufficiente al laboratorio quando, anche per
un solo esercizio, si verifica una delle seguenti condizioni (errori critici):
1. Interpretazione ASSENTE
2. Classificazione ERRATA della/e variante/i identificata/e:
-
Variante patogenetica (C5) classificata come a significato incerto (VUS = C3) o
neutra/probabilmente neutra (C1, C2)
-
Variante probabilmente patogenetica (C4) classificata come neutra/probabilmente neutra (C1,
C2)
-
VUS (C3) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4)
-
Variante neutra/probabilmente neutra (C1, C2) classificata come patogenetica/probabilmente
patogenetica (C5, C4)
GENETICA MOLECOLARE ONCOLOGICA
I Turno
20 Laboratori partecipanti
n.
• Poliposi Adenomatosa del Colon: 9
laboratori
1
• Tumore Ereditario della Mammella e
dell'Ovaio: 16 laboratori
• Sindrome di Lynch: 12 laboratori
Parte retrospettiva
Referti richiesti: 111
Referti valutati: 105
(6 referti non inviati per mancanza di casi)
Poliposi
Adenomatosa
Familiare del Colon
Tumore Ereditario
della Mammella e
dell'Ovaio
Sindrome di
Lynch
x
2
x
x
3
x
x
4
x
x
x
x
5
x
6
7
x
8
x
x
9
x
x
x
10
x
x
x
11
x
x
x
x
12
13
x
x
14
x
15
x
16
x
17
x
Esercizi
18
x
Esercizi valutati: 222
x
x
x
x
19
x
x
20
x
Poliposi Adenomatosa Familiare del Colon
parte retrospettiva
Sono stati chiesti gli ultimi casi analizzati nell’anno 2015 di uno dei due geni - APC o MUTYH - secondo
le seguenti istruzioni:
1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta
2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta
3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta
• 6 laboratori su 9 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio di
performance sufficiente
• 1 laboratorio non ha presentato un referto del caso VUS, non avrà quindi un
giudizio di performance, saranno comunque commentati gli altri casi
• 1 laboratorio ha presentato un referto del caso Patogenetico del 2014, inoltre nel
caso VUS ha sottomesso un caso C1, non avrà quindi un giudizio di performance
• 1 laboratorio otterrà un giudizio di performance insufficiente per errore di
interpretazione
Interpretazione errata
il laboratorio non considera il carattere recessivo del gene MUTYH
Il test è dichiarato Positivo, ma manca un’interpretazione clinica del risultato.
Manca un rimando alla consulenza genetica
Poliposi Adenomatosa Familiare del Colon
Esercizi proposti
Conseguenza a livello
proteico (nomenclatura
internazionale)
Sede della variante
Interpretazione della variante a
scopo clinico ed
(N. Esone/Introne)
eventuali commenti (come
comparirebbero sul referto)
c.3920T>A
p.(Ile1307Lys)
15G
VUS è la variante degli Ashkenazi su
cui c'è molta letteratura
c.7514G>A
p.(Arg2505Gln)
15T
VUS in InSight
c.1262_1263delGGinsAA
p.(Trp421*)
9
PAT in InSight
c.1437_1439del
p.(Glu480del)
14
PAT in InSight
c.544C>T
p.(Arg182Cys)
7
VUS in InSight
c.1276C>T
p.(Arg426Cys)
13
VUS in InSight
Variante
(nomenclatura HGVS a
livello di DNA)
Gene APC
Gene MUTYH
Valutazione preliminare
Gene APC
Gene MUTYH
Lab
c.3920T>A
c.7514G>A
c.1262_1263delGGin
sAA
c.1437_1439del
c.544C>T
c.1276C>T
1
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
2
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
3
corretto
corretto
corretto
corretto
C3>C5
corretto
4
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
5
C3>C1,2
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
6
corretto
C3>C1,2
corretto
corretto
corretto
corretto
7
C3>C1,2
corretto
corretto
corretto
corretto
C3>C1,2
8
corretto
C3>C1,2
corretto
corretto
corretto
corretto
9
C3>C1,2
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
C3>C5: variante a significato incerto interpretata come variante patogenetica
C3>C1,2: variante a significato incerto interpretata come variante a scarso o nullo significato,
errore non critico ma penalizzabile
Tumore ereditario della mammella e dell’ovaio
parte retrospettiva
Sono stati chiesti referti degli ultimi casi analizzati nell’ anno 2015 di uno dei due geni - BRCA1 o
BRCA2 - secondo le seguenti istruzioni:
1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta
2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta
3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta
• 12 laboratori su 16 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio di
performance sufficiente
• 1 laboratorio non ha presentato un referto del caso VUS, non avrà quindi un giudizio
di performance, ma riceverà dei commenti circa gli altri casi. Inoltre nel caso
“normale” interpreta una variante C3 come C1 (BRCA1 p.Arg1028Cys)
• 1 laboratorio otterrà un giudizio di performance insufficiente per errore di
genotipizzazione sui dati grezzi del caso VUS
INOLTRE…
• 1 laboratorio nel caso
Patogenetico ha indicato una
mutazione BRCA2 come
BRCA1, inoltre tutte le varianti
polimorfiche (C1) trovate sono
indicate come C2 o non note in
tutti e tre i casi presentati.
• Lo stesso laboratorio nel caso
VUS ha sottomesso un caso C1
riportandolo come C3
• 1 laboratorio otterrà un giudizio
di performance insufficiente
per errore di genotipizzazione
(errore di nomenclatura grave)
il genotipo, così come descritto
(c.8475delGA...) non corrisponde al dato
grezzo (c.8247_8248delGA). La
annotazione risulta un mix tra
nomenclatura database BIC e
nomenclatura HGVS
Errore che potrebbe avere ripercussioni
sull'attendibilità del test
Tumore ereditario della mammella e dell’ovaio
Esercizi proposti
Variante
(nomenclatura HGVS a
livello di DNA)
Conseguenza a
livello proteico
(nomenclatura
internazionale)
Sede della variante
Interpretazione della variante a
scopo clinico ed
(N. Esone/Introne)
eventuali commenti (come
comparirebbero sul referto)
C5
c.5062_5064delGTT
Gene BRCA1
p.Val1688del
17
Malacrida et al_JCO 2008
C3
c.5017_5019delCAC
p.His1673del
17
c.5194-1G>C (IVS191G>C)
p.?
19
anche se localizzata in un dominio
funzionalmente importante
C4
no dati in vitrp
C2
c.6953G>A
Gene BRCA2
p.Arg2318Gln
13
Chenevix-Trench et al_Cancer Res
2006
C5
c.9154C>T
p.Arg3052Trp
24
c.10095_10095delinsGAAT
TATATCT
p.Ser3366Asnfs*4
27
Guidugli_Cancer Res 2013
C1
downstream Lys3326
Valutazione preliminare
Gene BRCA1
Lab
Gene BRCA2
c.5062_5064delGTT c.5017_5019delCAC c.5194-1G>C (IVS19-1G>C)
c.6953G>A
c.9154C>T
c.10095_10095delinsGAATTATAT
CT
1
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
2
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
3
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
4
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
5
corretto
corretto
C4>C5
corretto
corretto
corretto
6
due interpretazioni
corretto
non interpretata
7
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
8
C5>C3
corretto
C4>C3
corretto
C5>C3
corretto
9
C5>C3
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
10
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
11
corretto
C3>C4
corretto
corretto
corretto
corretto
12
C5>C3
corretto
corretto
corretto
C5>C4
C1>C3
13
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
14
corretto
corretto
C4>C3
corretto
corretto
corretto
15
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
16
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
non interpretata non interpretata
C1>C3
C5>C3 variante patogenetica interpretata come variante a significato incerto, in tutti i casi i
laboratori hanno controllato solamente BIC dove viene ancora riportata come VUS
C3>C4 variante a significato incerto interpretata come probabilmente patogenetico
Sindrome di Lynch
parte retrospettiva
Sono stati chiesti i referti degli ultimi casi analizzati nell’ anno 2015 di uno dei due geni - MLH1 o
MSH2 - secondo le seguenti istruzioni:
1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta
2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta
3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta
• 3 laboratori su 12 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio
di performance sufficiente
• 4 laboratori non hanno presentato un referto (2 casi patogenetici, due casi
VUS), non avranno quindi un giudizio di performance, ma riceveranno
commenti circa gli altri casi
• 2 laboratori hanno presentato dei referti di casi con mutazione in MSH6, non
avranno quindi un giudizio di performance, ma riceveranno commenti circa gli
altri casi
• 3 laboratori hanno ottenuto un giudizio di performance insufficiente per non
aver usato la tecnica MLPA per la ricerca di grandi delezioni e non aver
riportato l’eventuale rimando a tale esame, nei casi VUS e normali
Sindrome di Lynch
Esercizi proposti
Conseguenza a livello
proteico
(nomenclatura
(nomenclatura HGVS a
internazionale)
livello di DNA)
Variante
Gene MLH1
Gene MSH2
Sede della variante
Interpretazione della variante
a scopo clinico ed
(N. Esone/Introne)
eventuali commenti (come
comparirebbero sul referto)
c.1852_1853delAAins
GC
p.(Lys618Ala)
16
Class 1
c.1852_1854del
p.(Lys618del)
16
Class 5
c.454-?_545+?dup
p.(?)
6
Class 3
c.2635-3C>T
p.(?)
16 (intr 15)
Class 3
c.1077-2A>T
p.(?)
7 (intr 6)
Class 4
c.1046C>G
p.(Pro349Arg)
6
Class 5
Valutazione preliminare
Gene MLH1
Gene MSH2
Lab
c.1852_1853delAAinsGC
c.1852_1854del
c.454-?_545+?dup
c.2635-3C>T
c.1077-2A>T
c.1046C>G
1
corretto
corretto
C3>C5
corretto
C4>C5
corretto
2
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
3
corretto
corretto
interpretazione
assente
C3>C5
corretto
corretto
4
corretto
corretto
C3>C5
corretto
corretto
corretto
5
corretto
corretto
C3>C5
corretto
corretto
corretto
6
corretto
corretto
C3>C5
C3>C2
corretto
corretto
7
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
8
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
9
corretto
corretto
C3>C5
corretto
corretto
corretto
10
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
11
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
12
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
corretto
C3>C5 variante a significato incerto interpretata come variante patogenetica
c.454-?_545+?dup
Classe 3
LOVD-InSiGHT rules
Class 5 – Pathogenic …..
• Large genomic deletions
• Large genomic duplications shown by laboratory studies to result in a frameshift before the last splice junction
Class 3 – Uncertain ……
• Variants that have insufficient evidence (molecular or otherwise) to classify, which may include large genomic duplications
not yet shown by laboratory studies to result in a frameshift before the last splice junction, …..
MLPA - Casi presentati
Fatta esclusione di tutti i casi “patogenetici” è importante l’utilizzo di MLPA (o seconda
tecnica alternativa) o almeno il rimando alla necessità di proseguire l'analisi con
ulteriori test per valutare la presenza di grandi delezioni o duplicazioni *
Indice di importanza:
BRCA1 e 2
~5%
Penalizzazione
o commento
APC
~10%
Grossa
penalizzazione
MLH1 e MSH2
~20%
Errore critico
*gene MUTYH: Non rilevante, eccetto nel caso sia presente una sola variante patogenetica in eterozigosi
Per lo schema della Poliposi Adenomatosa del Colon
Tra i 17 casi valutati tra VUS e WT, 12 riguardavano l’analisi del gene APC
• 4 casi (3 laboratori): utilizzano l’MLPA
• 2 casi (2 laboratori): non eseguono la seconda tecnica, ma ne rimandano la necessità
• 6 casi (3 laboratori): non eseguono la seconda tecnica e non viene riportata la necessità di
proseguire l'analisi con ulteriori test
Per lo schema della Sindrome di Lynch
Su 22 casi valutati tra VUS e WT:
• 9 casi (5 laboratori) utilizzano l’MLPA
• 4 casi (2 laboratori) non eseguono la seconda tecnica, ma ne rimandano la necessità
• 9 casi (5 laboratori) non eseguono la seconda tecnica e non viene riportata la
necessità di proseguire l'analisi con ulteriori test
• 1 caso (1 laboratorio) non è si è potuto valutare la necessità della seconda tecnica
per carenza di informazioni nel referto
In questo esempio nel
referto NON vengono
nemmeno riportati i
limiti del test (non
permette di evidenziare
delezioni o duplicazioni
dell’intero gene e di
interi esoni)
Non è corretto indicare "regioni
analizzate: tutte" andrebbero descritte
le regioni, inserendo anche l'analisi
delle giunzioni introne/esone.
In questo secondo esempio, nelle informazioni tecniche allegate al referto è esplicitato
che NGS non vede delezioni/duplicazioni >100 bp.
MLPA non fatto, ma nel referto non viene riportata la necessità di proseguire l'analisi con
ulteriori test.
Terzo esempio: Utilizza NGS- Ion Torrent ma non ne vengono forniti i dettagli,
non riporta l’utilizzo del sequenziamento Sanger di conferma.
Non valutabile se MLPA necessario in associazione con tecnica NGS utilizzata
Next Generation Sequencing
•
NGS utilizzato da 10/20 laboratori partecipanti (50%)
•
L’utilizzo dell’ NGS va preceduto da percorsi di validazione dello specifico approccio utilizzato,
dai quali andrebbero derivati i parametri di specificità, sensibilità, ecc… (non ha alcun senso
riportare valori teorici che poco o nulla hanno a che vedere con lo specifico test utilizzato)
•
Oltre alla validazione e/o eventuale certificazione (CE-IVD) dell’approccio, o parte di esso, nel
referto vanno inoltre fornite anche alcune informazioni relative ad esempio a:
– Piattaforma
– Tecnica di arricchimento
– Kit commerciale
– Copertura del target
– Profondità minima di lettura
– Indicazione sommaria della pipeline bioinformatica
•
D’altro canto, almeno nella fase di transizione dell’NGS in ambito diagnostico, si sconsigliano
anche referti con lunghi allegati tecnici incomprensibili ai più.
•
È inoltre essenziale la conferma tramite una seconda metodica di eventuali varianti identificate
in NGS (il prossimo anno come da linee guida SIGU, ai laboratori che utilizzano questa metodica
verrà richiesto di presentare i dati di validazione mediante sequenziamento Sanger)
Database & Interpretazione
esercizi proposti
I laboratori non dovrebbero limitarsi a
riportare le classificazioni descritte nei
database, ma dovrebbero piuttosto avere
una capacità critica di interpretazione
della variante, soprattutto nelle
situazioni in cui le classificazioni di
differenti database non sono concordi.
Alcuni Database
UTILI per
l’interpretazione
BRCA1 e BRCA2
ARUP (http://arup.utah.edu/database/BRCA/)
Breast Information Core (BIC)
(http://research.nhgri.nih.gov/bic/)
BRCA share – BRCA1 (www.umd.be/BRCA1)
BRCA share – BRCA2 (www.umd.be/BRCA2)
LOVD–IARC (http://hciexlovd.hci.utah.edu/home.php)
Clin Var (www.ncbi.nih.gov/clinvar/)
ENIGMA (http://enigmaconsortium.org)
APC e MUTYH
MLH1 e MSH2
LOVD-InSiGHT (http://insightgroup.org/variants/database/)
UMD (http://www.umd.be/)
Clin Var (www.ncbi.nih.gov/clinvar/)
Partecipano al gruppo di lavoro di esperti:
Dott.ssa Liliana Varesco – IRCCS – AOU San Martino – IST - Genova
Dott. Paolo Radice – Fondazione IRCCS – Istituto Nazionale dei Tumori - Milano
Dott. Marco Montagna - Istituto Oncologico Veneto (IRCCS-IOV) - Padova
Dott.ssa Alessandra Viel – IRCCS - Centro Riferimento Oncologico - Aviano
Gruppo di lavoro ISS
• Responsabile dott.ssa Domenica Taruscio
•
•
•
•
•
•
•
Fabrizio Tosto
Federica Censi
Maria Chiara de Stefano
Giovanna Floridia
Marco Salvatore
Daniele Savino
Gianluca Ferrari