11 lezione
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ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E’ una tecnica fondamentale per: •l’analisi (elettroforesi analitica) •la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa) catodo anodo - + RNA e DNA sono carichi negativamente Effetto “setaccio” in un gel uniforme - + ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO L’agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di Dgalattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb Concentrazione di agarosio 0.8% : 0.5 – 20 kb 2% : 0.1 – 3 kb Risoluzione Come si prepara un gel d’agarosio Si scioglie l’ l’agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100° 100°C Alla soluzione d’ d’agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr) EtBr) ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 100V tampone elettroforetico 0,2A Polo Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2% ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 100V 0,2A Polo Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità velocità diversa. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità velocità diversa. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità velocità diversa. Etidio Bromuro (EtBr): colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E’ utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l’intensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione. Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi) Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso “interpolare” la lunghezza delle molecole A e B A = 2.5 kb B = 6 kb Dai Geni ai Genomi -EdiSES- Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici) pBR322 plasmide circolare “rilassato” nick migra più lentamente rispetto ad un DNA lineare o superavvolto della stessa massa plasmide superavvolto Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno in maniera differente pBR322 pBR322 dopo digestione plasmide “linearizzato” ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI NB Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. NB L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea Separazione in gel d’agarosio di molecole di RNA in condizioni denaturanti 28S (3400 nt) 18S (1800 nt) Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, l’RNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari. La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide. ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Separazione Separazionedi di frammenti frammenti minori minori di di 11kb kb Permette Permette di di separare separare frammenti frammenti che che differiscono differiscono di di una una sola sola base base (determinazione (determinazione della della sequenza sequenza del del DNA) DNA) Formazione di un gel di poliacrilammide ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Spessore del gel 0,4-1,5 mm Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante. acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Risoluzione: 20 - 1000 nt 1000V Polo - Polo + 22 mA ON 1000V Separazione di RNA totale dopo PAGE 6% Polo - 5.8SL(circa 150 nt) 5.8SS 5S (circa 120 nt) Polo + pre-tRNAs/ tRNAs (circa 80 nt) 22 mA 1000V RNA circolare 22 mA RIASSUMENDO Acido nucleico dsDNA ssDNA oligo RNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.) piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.) Agarosio PAGE Condizioni denaturanti Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) • L'elettroforesi su gel di agarosio è utilizzata per separare DNA di 60 kb o di dimensioni inferiori. L'introduzione della PFGE e le successive varianti introdotte sulla tecnica di base permettono oggi la separazione di frammenti di DNA della lunghezza di 2 kb. Ciò consente la separazione in elettroforesi di cromosomi interi. • Il metodo consiste in una elettroforesi su gel di agarosio nella quale due campi elettrìci con differenti angolazioni vengono applicati alternativamente per periodi di tempo definiti (ad esempío 60s). • L'azione del primo campo elettrico causa uno stiramento lungo il piano orizzontale delle molecole avvolte e il loro movimento all'interno del gel. • L'interruzione di questo campo e l'applicazione del secondo campo elettrico fa sì che le molecole si muovano nella nuova direzione. • Per una molecola lineare a catena lunga esiste una relazione tra il cambiamento conformazionale indotto da un campo elettrico e la lunghezza della molecola stessa • le molecole più piccole si riallineeranno più velocemente nel nuovo campo elettrico e, quindi, continueranno a muoversi attraverso il gel. • Molecole più grosse, viceversa, impiegheranno più tempo per allinearsi. • In questo modo, variando continuamente la direzione del campo, si separano le molecole più piccole da quelle più grandi. Blotting di Acidi Nucleici: Southern e Northern Blot Permettono di studiare: Struttura ed organizzazione del genoma Regolazione dell’espressione genica 1. Elettroforesi su gel 2. Trasferimento (blotting) su membrana 3. Ibridazione con una sonda marcata radioattivamente Trasferimento di acidi nucleici (Blotting) • Southern • Northern Schema trasferimento Schema ibridazione Metodi di trasferimento • Capillare • Elettroblot Assemblaggio del blot capillare vaschetta tampone carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto Assemblaggio dell’elettroblot carta 3MM spugnette - tampone membrana nylon gel + Analisi di espressione con Northern blot
