ELETTROFORESI SU GEL
Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA
da una miscela complessa
E’ una tecnica fondamentale per:
•l’analisi (elettroforesi analitica)
•la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)
catodo
anodo
-
+
RNA e DNA sono
carichi negativamente
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
-
+
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
L’agarosio
è un polisaccaride
costituito da residui alternati di Dgalattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
Consente la separazioni di molecole di
grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb
Concentrazione
di agarosio
0.8% : 0.5 – 20 kb
2% : 0.1 –
3 kb
Risoluzione
Come si prepara un gel d’agarosio
Si scioglie l’
l’agarosio in
polvere in una soluzione
tampone a 100°
100°C
Alla soluzione d’
d’agarosio
si aggiunge Etidio Bromuro
(EtBr)
EtBr)
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
generatore di corrente
100V
tampone
elettroforetico
0,2A
Polo Polo +
scatola elettroforetica
gel di agarosio 1.2%
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità
velocità diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità
velocità diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità
velocità diversa.
Etidio Bromuro (EtBr):
colorante fluorescente
assorbe la luce UV a 300 nm
dando colore giallo-arancio
E’ utile sia per visualizzare,
sia per quantificare il
campione: l’intensità della
fluorescenza è, infatti,
proporzionale alla quantità
del campione.
Per frammenti lineari di DNA
e/o RNA la distanza di
migrazione è inversamente
proporzionale alle dimensioni
della molecola (ovvero alla
sua lunghezza in basi)
Conoscendo la distanza di
migrazione di frammenti di
dimensione nota (M) posso
“interpolare” la lunghezza
delle molecole A e B
A = 2.5 kb
B = 6 kb
Dai Geni ai Genomi
-EdiSES-
Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici)
pBR322
plasmide circolare
“rilassato”
nick
migra più lentamente
rispetto ad un DNA
lineare o superavvolto
della stessa massa
plasmide
superavvolto
Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno
in maniera differente
pBR322
pBR322
dopo digestione
plasmide
“linearizzato”
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI
DENATURANTI
NB
Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA)
tendono a formare complesse strutture secondarie,
pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente
influenzata dal modo in cui si ripiegano.
NB
L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deve
essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole
in forma lineare
Agenti denaturanti comunemente usati:
calore, formaldeide, formammide, urea
Separazione in gel d’agarosio di molecole di RNA
in condizioni denaturanti
28S (3400 nt)
18S (1800 nt)
Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel,
l’RNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da
appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari.
La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e aggiungendo
formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè
contiene formaldeide e formammide.
ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Separazione
Separazionedi
di frammenti
frammenti minori
minori di
di 11kb
kb
Permette
Permette di
di separare
separare frammenti
frammenti che
che differiscono
differiscono di
di
una
una sola
sola base
base (determinazione
(determinazione della
della sequenza
sequenza del
del
DNA)
DNA)
Formazione di un gel di poliacrilammide
ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Spessore del gel
0,4-1,5 mm
Il gel è composto da
acrilamide e bis acrilamide in
un rapporto caratteristico 29:1
che determina lo spessore dei
pori. Esso inoltre contiene urea
che funziona da denaturante.
acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea
Risoluzione: 20 - 1000 nt
1000V
Polo -
Polo +
22 mA
ON
1000V
Separazione di RNA totale
dopo PAGE 6%
Polo -
5.8SL(circa 150 nt)
5.8SS
5S (circa 120 nt)
Polo +
pre-tRNAs/
tRNAs (circa 80 nt)
22 mA
1000V
RNA
circolare
22 mA
RIASSUMENDO
Acido nucleico
dsDNA
ssDNA oligo
RNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.)
piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.)
Agarosio
PAGE
Condizioni
denaturanti
Pulsed field gel
electrophoresis (PFGE)
• L'elettroforesi su gel di agarosio è utilizzata per
separare DNA di 60 kb o di dimensioni inferiori.
L'introduzione della PFGE e le successive
varianti introdotte sulla tecnica di base
permettono oggi la separazione di frammenti di
DNA della lunghezza di 2 kb.
Ciò consente la separazione in elettroforesi di
cromosomi interi.
• Il metodo consiste in una elettroforesi su
gel di agarosio nella quale due campi
elettrìci con differenti angolazioni
vengono applicati alternativamente per
periodi di tempo definiti (ad esempío 60s).
• L'azione del primo campo elettrico causa
uno stiramento lungo il piano orizzontale
delle molecole avvolte e il loro movimento
all'interno del gel.
• L'interruzione di questo campo e
l'applicazione del secondo campo
elettrico fa sì che le molecole si muovano
nella nuova direzione.
• Per una molecola lineare a catena lunga esiste
una relazione tra il cambiamento
conformazionale indotto da un campo elettrico
e la lunghezza della molecola stessa
• le molecole più piccole si riallineeranno più
velocemente nel nuovo campo elettrico e,
quindi, continueranno a muoversi attraverso il
gel.
• Molecole più grosse, viceversa, impiegheranno
più tempo per allinearsi.
• In questo modo, variando continuamente la
direzione del campo, si separano le molecole più
piccole da quelle più grandi.
Blotting di Acidi Nucleici:
Southern e Northern Blot
Permettono di studiare:
Struttura ed organizzazione del genoma
Regolazione dell’espressione genica
1. Elettroforesi su gel
2. Trasferimento (blotting) su membrana
3. Ibridazione con una sonda marcata
radioattivamente
Trasferimento di acidi nucleici
(Blotting)
• Southern
• Northern
Schema trasferimento
Schema ibridazione
Metodi di trasferimento
• Capillare
• Elettroblot
Assemblaggio del blot capillare
vaschetta
tampone
carta 3MM
carta 3MM
}
membrana nylon
gel
supporto
Assemblaggio dell’elettroblot
carta 3MM
spugnette
-
tampone
membrana nylon
gel
+
Analisi di espressione con Northern blot
