Articoli AIRInforma - L’ultima Frontiera dell’ingegneria Genetica: Cos’e’ e a Cosa Serve il Sistema Crispr/Cas
AIRInforma: Il portale di divulgazione di AIRIcerca - http://informa.airicerca.org - Pubblicato il 02-05-2016
L’ultima Frontiera dell’ingegneria Genetica:
Cos’e’ e a Cosa Serve il Sistema Crispr/Cas
di Elisa Dell’Aglio
Editors: Silvia Licciulli, Olivia Candini
Revisori Esperti: Matteo Bovolenta, Samanta Mariani, Mario Notari
Revisori Naive: Francesco Stermotich, Maria Rossana Caniglia, Nicola Ganci
Parole Chiave: Batteri, Biologia, Biologia Molecolare, Malattie Genetiche, OGM, Organismi Geneticamente
Modificati, Ricerca di Base, Ricerca in Vitro, Etica
Permalink: http://informa.airicerca.org/2016/05/02/ultima-frontiera-ingegneria-genetica-crispr-cas
Il sistema CRISPR/Cas consente di modificare in modo rapido ed
economico una precisa regione del DNA e ha catturato l’attenzione di
tutta la comunità biotecnologica per la sua versatilità e le sue
innumerevoli applicazioni. L’avvento di CRISPR/Cas apre però molti
nuovi interrogativi di natura bioetica. Questo articolo vuole fornire
un’introduzione generale al sistema e fare chiarezza sul suo utilizzo,
sulle potenziali applicazioni in diversi campi e sulle relative controversie
etiche.
Se non diversamente specificato, i contenuti di questo articolo sono distribuiti con Licenza Creative Commons Attribuzione - Non Commerciale - Non Opere Derivate (Alcuni diritti riservati - CC BY-NC-ND 4.0).
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menti di RNA “guida” noti come CRISPR, che
funzionano come delle sentinelle molecolari
riconoscendo, per appaiamento di basi, le
sequenze di DNA estraneo. Una volta riconosciuto
e agganciato il DNA estraneo, le CRISPR guidano
su di esso un enzima detto Cas (CRISPRassociated), una endonucleasi che, funzionando
come un paio di forbici, taglia il DNA intruso,
impedendone la replicazione. Le sequenze
CRISPR furono scoperte già nel 1987 da Ishino e
colleghi [1], ma il loro ruolo venne completamente
compreso solo trent’anni dopo, nel 2007 [2].
Da meccanismo immunitario naturale a potente
strumento biotecnologico
Per comprendere il funzionamento dei geni del
nostro corpo e di qualsiasi organismo è importante
studiare cosa accade quando se ne modifica
l’espressione. Per secoli gli scienziati si sono dovuti
accontentare di osservare gli effetti di mutazioni
spontanee o di usare sostanze che introducevano
errori casuali nel genoma di piante, animali o cellule
in coltura. Negli ultimi anni sono state messe a
punto nuove tecniche, dette di “genome editing”,
che permettono di apportare modifiche precise ai
geni che si vogliono studiare, velocizzando
enormemente i progressi nella ricerca biologica. In
futuro, queste tecniche potrebbero anche essere
impiegate per “correggere” alterazioni responsabili
di malattie geniche o modificare alcuni caratteri
vegetali. Tra esse, il sistema più recente e
promettente è noto come CRISPR/Cas.
Da allora e in particolare da quando, nel 2012, il
sistema è stato reso personalizzabile dai gruppi di
ricerca di Jennifer Doudna e Emmanuelle
Charpentier [3], i biotecnologi stanno provando a
sfruttare questo sistema di difesa naturale per
introdurre modifiche specifiche nel genoma di
organismi molto più complessi dei batteri, come
animali e piante [4]. Per fare questo, si utilizza il
sistema CRISPR accoppiato ai sistemi di
riparazione del DNA presenti nella cellula, che,
dopo il taglio da parte di Cas, operano una ricucitu-
Dietro questo strano nome si cela originariamente
un meccanismo immunitario che alcuni organismi
unicellulari (come i batteri) utilizzano per difendersi
dai virus. Questi organismi contengono dei fram-
Figura 1 – Rappresentazione schematica di come si può sfruttare il sistema CRISPR-Cas per modificare il genoma di un
organismo. Nel caso più semplice (in alto) dopo il taglio effettuato dall’enzima Cas il DNA è riparato mediante meccanismi cellulari
imprecisi che possono portare a delezioni, inserzioni e/o sostituzione di nucleotidi con conseguente perdita di funzionalità del gene
(“knock-out”). Nel secondo caso (in basso), insieme all’enzima Cas e alla sequenza CRISPR si introduce nella cellula anche una
molecola di DNA contenente la sequenza desiderata. Questa molecola servirà da “stampo” per modificare il DNA delle cellule in
modo preciso (mediante il processo della ricombinazione omologa).
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gomento, tra articoli scientifici originali e review.
ra secondo diversi meccanismi. Alcuni di questi
meccanismi sono per natura imprecisi e
introducono “errori” nella sequenza, cosicché a
volte il gene modificato diventa non più funzionale.
Il sistema CRISPR/Cas sta anche a poco a poco
soppiantando metodi più obsoleti per studiare
le cause genetiche e il decorso di malattie, come
vari tipi di cancro (su modelli cellulari e animali),
nonché l’efficacia di farmaci [7]. Le maggiori
probabilità di successo sono attese per la cura di
malattie del sistema immunitario. Le cellule
immunitarie, infatti, si possono isolare, modificare in
vitro e reintrodurre nel paziente una volta “corrette”.
Questa strategia ha già permesso di generare in
vitro linfociti T resistenti all’HIV [8].
Questa modalità può essere sfruttata per eliminare
l’espressione di un gene di cui si vuole studiare la
funzione. Un altro meccanismo di riparazione,
chiamato “ricombinazione omologa”, agisce con
precisione, permettendo di riparare il taglio e di
inserire sequenze desiderate. Grazie a questa
strategia, è possibile non solo studiare l’effetto
dell’introduzione di determinate mutazioni ma
anche, ad esempio, correggere le mutazioni che
causano malattie genetiche.
In ambito vegetale, il sistema CRISPR/Cas mostra
sorprendenti potenzialità. Non solo si rivela uno
strumento importante per la ricerca di base, ma
permette anche di generare piante con migliori
caratteristiche nutrizionali o resistenti a
patogeni, come nel caso di una recente varietà di
pomodoro resistente all’oidio in corso di
perfezionamento nei laboratori del Sainsbury
Laboratory a Norwich (Gran Bretagna) [9]. Sebbene
tutto ciò sia già in parte possibile con incroci
tradizionali, il sistema CRISPR/Cas è molto più
specifico e permette di ottenere i risultati in pochi
mesi anziché anni. Inoltre, rispetto alle tecniche di
Il sistema è già stato utilizzato con successo per
risolvere controversie scientifiche di lunga data [5] e
comprendere il ruolo di molti geni a funzione
sconosciuta [6]. Si tratta di una vera e propria
rivoluzione in ambito biotecnologico, che ha
suscitato un interesse crescente, come dimostrato
anche dalla rapida impennata nelle pubblicazioni:
se il primo articolo scientifico che propone l’uso
delle CRISPR per l’ingegneria genetica è stato pubblicato nel 2012, oggi il portale scientifico Pubmed
conta già migliaia di referenze bibliografiche sull’ar-
Figura 2 – Rappresentazione semplificata delle modifiche al DNA introdotte in una pianta OGM generata con tecniche tradizionali o
mediante applicazione della tecnica CRISPR-Cas.
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origine a una nuova vita, ma in futuro altri scienziati
potrebbero voler tentare di applicare la tecnica
anche su embrioni normali. Lo studio riporta
quindi
alla
luce
il
grosso
dilemma
dell’eugenetica, ovvero se sia lecito effettuare
modifiche genetiche sull’uomo (anche se solo a
scopo terapeutico o di ricerca di base) e se studi di
tale genere debbano essere incoraggiati e resi
pubblici. Secondo quanto dichiarato dagli stessi
autori del discusso articolo, le prestigiose riviste
Nature e Science avrebbero rifiutato la
pubblicazione della ricerca proprio per ragioni
etiche.
biologia molecolare utilizzate finora, non necessita
dell’introduzione di porzioni di DNA proveniente da
altre specie, come geni per resistenze ad antibiotici
o erbicidi. La stessa proteina Cas viene introdotta
solo per il tempo necessario a correggere il genoma
della pianta, ma può essere successivamente
eliminata senza lasciare traccia, grazie degli incroci
mirati con la pianta selvatica [10].
CRISPR/Cas su embrioni umani: un difficile
conflitto etico
Nonostante tutti questi promettenti risultati, a far
conoscere il sistema CRISPR/Cas al grande
pubblico è stato uno studio molto controverso
apparso nell’aprile 2015 sulla rivista Protein&Cell. I
ricercatori, un’équipe cinese diretta dal Prof. Junjiu
Huang, hanno provato a utilizzare la tecnica per
correggere la mutazione genica della beta
talassemia
(nota
anche
come
anemia
mediterranea) in embrioni umani non vitali,
ovvero destinati alla ricerca e non in grado di
svilupparsi [11]. Le conclusioni dello studio erano
positive, in quanto alcuni degli embrioni sottoposti a
taglio CRISPR/Cas e ricombinazione omologa
avevano sostituito il gene corretto a quello mutato
ed erano quindi “guariti”. I numeri, però, erano
impietosi: solo 28 embrioni su 54 avevano subito il
taglio di Cas e solo in quattro embrioni alcune
cellule avevano effettuato la ricombinazione
omologa riparatrice.
OGM oppure no?
In ambito agronomico, il metodo CRISPR/Cas
scatena meno problemi etici ma sta complicando
l’aspro dibattito sugli OGM. Le mutazioni introdotte
da questa tecnica possono infatti essere così
piccole e localizzate da diventare indistinguibili da
quelle “naturali”, dovute cioè a fattori di stress come
un eccessivo irraggiamento solare.
Queste mutazioni sarebbero sufficienti per
classificare tali piante come OGM? Per ora, gli Stati
Uniti sembrano propendere per il no, mentre in
Europa si va in direzione del sì, in quanto per
l’Unione Europea un OGM è definito tale non in
base alle caratteristiche finali del prodotto ma in
base alla tecnologia scelta per generarlo. Nella
Direttiva 2001/18/CE del Parlamento europeo e del
Consiglio del 12 marzo 2001 si legge infatti che
OGM è ogni organismo “il cui materiale genetico è
stato modificato in modo diverso da quanto avviene
in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione
genetica naturale”.
Si era anche osservato un alto numero di mutazioni
indesiderate potenzialmente pericolose. Questi
problemi sono dovuti al fatto che l’enzima Cas a
volte non è in grado di distinguere tra la sequenzabersaglio, che non può eccedere le 20 paia di basi,
e un frammento di DNA molto simile. Più il genoma
è lungo, più è alta la probabilità di trovarvi più copie
della sequenza bersaglio o sequenze simili (il
genoma degli organismi unicellulari che usano
CRISPR/Cas a scopi difensivi è in media 1000 volte
più piccolo di quello di piante e animali).
Le norme vigenti sono però state adottate in
un’epoca in cui il sistema CRISPR/Cas era ancora
sconosciuto e quindi non era stato preso in
considerazione. Se, come previsto, i centri di
ricerca pubblici e privati genereranno, a breve,
piante di interesse commerciale con questo sistema
sarà necessario colmare il vuoto legislativo sia in
Europa sia nel resto del mondo, in modo da
disciplinare la produzione e l’immissione sul
mercato di questi prodotti.
Nel riportare i risultati dello studio, la stampa
italiana e internazionale ha spesso usato toni
allarmanti dovuti alla bassa efficacia della tecnica e
all’alto rischio di errore. Di certo è ancora presto
per pensare a delle applicazioni terapeutiche a
livello embrionale ma i numeri dello studio di
Huang e colleghi non scoraggiano gli esperti, i
quali sono comunque pienamente coscienti dei
difetti attuali del sistema CRISPR/Cas e hanno già
proposto
molte
promettenti
strategie
di
miglioramento.
Contemporaneamente,
una
sempre più ampia conoscenza dei genomi permette
di scegliere con maggiore accortezza la sequenza
bersaglio.
Alcune compagnie stanno già cercando di
approfittare
il
più
possibile
dell’attuale
inadeguatezza nelle regolamentazioni per acquisire
notorietà e guadagnare mercato. È il caso di Cibus,
un’industria biotecnologica statunitense con filiale in
Olanda che utilizza un sistema di modifica genetica
mirato detto “Rapid Trait Development System”, di
fatto molto simile a CRISPR/Cas. L’azienda ha già
immesso sul mercato americano una varietà di
manioca resistente a un erbicida e sul suo sito
internet
sponsorizza
i
propri
prodotti
sottolineandone l’accettabilità anche in Paesi
contrari agli OGM, in quanto “non transgenici”.
Sul piano bioetico, però, anche alcuni scienziati
hanno reagito con preoccupazione all’articolo di
Huang e colleghi. In questo caso, gli embrioni
umani usati non avrebbero potuto svilupparsi e dare
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[6] Swiech, Lukasz, et al. “In vivo interrogation of gene function
in the mammalian brain using CRISPR-Cas9.” Nature
biotechnology 33.1 (2015): 102-106.
[7] Sánchez-Rivera, Francisco J., and Tyler Jacks. “Applications
of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology.” Nature Reviews
Cancer (2015).
[8] Schumann, Kathrin, et al. “Generation of knock-in primary
human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.” Proceedings of
the National Academy of Sciences (2015): 201512503.
[9] Vladimir Nekrasov. “Tomelo- rapid generation of a tomato
resistant to the powdery mildew by genome editing.”
CRISPR/Cas Workshop, 7-8 September 2015, John Innes
Centre, Norwich (GB).
[10] Belhaj, Khaoula, et al. “Editing plant genomes with
CRISPR/Cas9.” Current opinion in biotechnology 32 (2015): 7684.
[11] Liang, Puping, et al. “CRISPR/Cas9-mediated gene editing
in human tripronuclear zygotes.” Protein & cell (2015): 1-10.
[12] Gantz, Valentino M., and Ethan Bier. “The mutagenic chain
reaction: A method for converting heterozygous to homozygous
mutations.” Science 348.6233 (2015): 442-444.
[13] Gantz, Valentino M., et al. “Highly efficient Cas9-mediated
gene drive for population modification of the malaria vector
mosquito Anopheles stephensi.” Proceedings of the National
Academy of Sciences 112.49 (2015): E6736-E6743.
Interrogativi ecologici
L’utilizzo più controverso di CRISPR/Cas è forse
quello in cui il sistema è “autoreplicante” [12]. In
questo caso, una copia del gene Cas e della sua
sequenza guida si inseriscono all’interno del
genoma della cellula bersaglio. Ad ogni
generazione successiva, il meccanismo può quindi
riattivarsi e riprodurre la mutazione nel 100% della
progenie. I vantaggi sarebbero enormi, non solo
nella biotecnologia vegetale ma anche, e forse
soprattutto, per il controllo degli insetti.
Ciò consentirebbe, ad esempio, di mutare le
zanzare in modo da renderle immuni al plasmodio
portatore della malaria (come è già stato fatto con
successo in laboratorio [13]), e debellare così la
malattia, oppure rendere completamente innocui
insetti pericolosi per le coltivazioni. Allo stesso
modo si potrebbe agire su altri vettori di malattie
come il virus Zika. La scarsa prevedibilità delle
conseguenze ecologiche suggerisce però di
procedere in questo settore con molta cautela.
Autore: Elisa Dell'Aglio
Sin dai primi anni dell’università, Elisa si è dedicata alla
comprensione dei meccanismi che permettono alla piante di
adattarsi alle condizioni ambientali anche senza potersi
muovere. Le sue prime ricerche, condotte presso il
Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi a
Torino, vertevano sulle relazioni simbiotiche che i vegetali
stabiliscono con funghi del suolo per facilitare l’assorbimento
radicale di fosfato e composti azotati. Con una borsa di
dottorato internazionale, nel 2010 si è poi trasferita in
Francia (Commissariat à l’Energie Atomique et aux Energies
Alternatives di Grenoble), dove ha messo a punto tecniche
biofisiche per lo studio delle interazioni proteiche e la
regolazione di enzimi fotosintetici. Dopo un Master in
Traduzione tecnico-scientifica e uno stage presso la
redazione del mensile Le Scienze, attualmente lavora
all’Università di Ginevra come Post-Doc. Il suo progetto
verte sui meccanismi che regolano la produzione di vitamine
nelle piante in risposta a stress ambientali, utilizzando anche
le più avanzate tecniche di genome editing come il sitema
CRISPR/Cas.
Una sfida non solo scientifica
A meno di cinque anni dal primo studio
biotecnologico che ne fece uso, CRISPR/Cas sta
rivoluzionando l’ingegneria genetica e nel prossimo
futuro promette di essere la base per importanti
innovazioni in ambito terapeutico, alimentare ed
ecologico. Al contempo, sta però anche
smantellando la frontiera tra terapie e eugenetica e
quella tra OGM e alimenti tradizionali, aprendo così
nuovi interrogativi, anche di tipo ecologico.
I ricercatori, in particolare coloro che sono stati
protagonisti della scoperta di CRISP/Cas, sono
coscienti delle difficoltà e stanno cercando di creare
i giusti spazi per discutere in maniera chiara e
aperta delle nuove sfide di CRISPR/Cas (l’ultimo
congresso sull’argomento si è tenuto a Washington
D.C. lo scorso dicembre). Gli sviluppi di questa
nuova tecnologia non dipenderanno, quindi,
soltanto dai risultati sperimentali ma anche
dall’esito di un urgente dialogo tra scienza e
società, a cui siamo tutti invitati.
Info sui Revisori di questo articolo
Matteo Bovolenta è Ricercatore presso il Dipartimento
di Scienze della vita e Biotecnologie dell’Università di
Ferrara.
Samanta Mariani è Post-doc al Centre
Inflammation Research all’Università di Edinburgo.
Mario Notari è Post-doc al Centro
Rigenerativa di Barcellona (CMRB).
Francesco Stermotich è Dottorando presso il
dipartimento di Islamic & Middle Eastern Studies,
Università di Edinburgo.
Maria Rossana Caniglia lavora come Dottore di
ricerca in Conservazione dei Beni Architettonici e
Ambientali, Università degli studi Mediterranea di
Reggio Calabria.
Nicola Ganci, Laureato in Storia e Master in
Giornalismo, si occupa di enogastronomia e
copywriting.
Bibliografia
[1] Ishino, Yoshizumi, et al. “Nucleotide sequence of the iap
gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion
in Escherichia coli, and identification of the gene
product.” Journal of bacteriology 169.12 (1987): 5429-5433.
[2] Barrangou, Rodolphe, et al. “CRISPR provides acquired
resistance against viruses in prokaryotes.” Science 315.5819
(2007): 1709-1712.
[3] Jinek, Martin, et al. “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA
Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.” Science,
337.6096 (2012), 816-821.
[4] Gilbert, Luke A., et al. “CRISPR-mediated modular RNAguided regulation of transcription in eukaryotes.” Cell 154.2
(2013): 442-451.
[5] Gao, Yangbin, et al. “Auxin binding protein 1 (ABP1) is not
required for either auxin signaling or Arabidopsis development.”
Proceedings of the National Academy of Sciences 112.7 (2015):
2275-2280.
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