RICERCA La tecnica CRISPR In questo articolo: bioetica CRISPR gene editing Il taglia e cuci della genetica che preoccupa gli esperti La diffusione rapidissima di CRISPR, una tecnica di editing genetico che permette con relativa semplicità di modificare le caratteristiche di un gene direttamente nella cellula, ha messo in allarme gli esperti di etica. Nella ricerca sul cancro, però, si è rivelata una vera rivoluzione I a cura di DANIELA OVADIA n quattro anni la ricerca genetica ha subito una vera e propria rivoluzione tecnologica. Merito di CRISPR, una tecnica che consente di modificare il genoma di una cellula in modo rapido, relativamente semplice e poco costoso. Non che prima del suo avvento fosse impossibile farlo, ma le altre tecniche disponibili sono tutte più complesse. Dieci anni fa, per esempio, sono stati messi a punto alcuni enzimi, le nucleasi a dita di zinco, capaci di tagliare e incollare sequenze di DNA in modo efficiente e preciso, ma al costo di quasi 5.000 dollari a dose e con limiti tecnici legati alla difficoltà di adattarli esattamente all’obiettivo che si vuole centrare lungo la doppia elica. CRISPR è diverso: utilizza un enzima chiamato Cas9, trasportato da un frammento di RNA capace di raggiungere esattamente il bersaglio previsto, sfruttando la presenza di alcune zone di sequenze ripetute. Giunto a destinazione, l’enzima esegue l’equivalente biologico del comando tagliaincolla di un software di scrittura ed elimina, o sostituisce, la sequenza bersaglio. Molto spesso i laboratori devono comprare solo la molecola di RNA guida, con una notevole riduzione dei costi. 16 | FONDAMENTALE | APRILE 2016 I LIMITI DELLA DEMOCRAZIA “Con questa tecnica abbiamo reso democratico il gene editing, cioè la capacità di modificare il genoma di una cellula o di aggiungere ed eliminare geni a piacimento” spiega Jennifer Doudna, biochimica dell’Università di Berkeley, California, una delle pioniere della metodologia. “È così facile e poco costoso che qualunque laboratorio minimamente attrezzato può farlo”. Un progresso innegabile che ha suscitato, però, alcuni timori, in primo luogo negli stessi scienziati: con uno strumento di questo tipo diventa più semplice cambiare le caratteristiche dei nostri geni, eliminare quelli malfunzionanti ed eventualmente rimpiazzarli. Tutto bene? Non proprio, perché se la tecnica viene applicata agli embrioni, e in particolare a quelli uma- ni, può sollevare dubbi etici. Gli esperti di CRISPR si sono riuniti a Washington nel mese di dicembre scorso per discutere le promesse del gene editing, ma anche i limiti che gli stessi scienziati sentono di dover mettere all’uso di uno strumento tanto versatile. Senza riuscire però a trovare un accordo: se secondo alcuni la soglia da non varcare è la modificazione del genoma di una cellula embrionale umana, perché darebbe origine a un individuo dalle caratteristiche “non naturali”, altri scienziati hanno ricordato quanto sia importante, in alcune malattie ereditarie, poter sostituire il gene malfunzionante con una copia sana fin nell’embrione, per permettere la nascita di un bambino senza problemi. A fronte delle perplessità di alcuni esperti, vi sono Paesi, tra cui la Gran Bretagna, È più facile modificare i caratteri ereditari SPERIMENTAZIONI ZANZARE BARRIERA L a facilità con cui CRISPR consente di modificare il genoma di un organismo offre nuove opportunità nella cura di alcune malattie trasmesse da insetti, come la malaria. Modificando l’assetto genetico della zanzara che trasporta il plasmide, gli scienziati sperano di impedire che questo possa trovare ospitalità ed essere trasmesso attraverso la classica puntura. Per ottenere il risultato è necessario immettere nell’ambiente un certo numero di insetti con modificazioni dei geni, tali da renderli inutili alla trasmissione della malattia, ma capaci comunque di accoppiarsi e riprodursi con le zanzare “classiche”. In tal modo la versione “modificata” prenderà lentamente il sopravvento riducendo, fino a scomparire, le possibilità di sopravvivenza del plasmide malarico. Un progetto ambizioso ma non semplice da realizzare perché spesso gli insetti modificati non sono capaci di riprodursi o non sono in grado di sopravvivere nell’ambiente naturale. che hanno autorizzato l’uso di CRISPR in embrioni umani, in particolare per uno studio, condotto dalla biologa Kathy Niakan del Francis Crick Institute di Londra, che si prefigge di modificare alcuni geni chiave per lo sviluppo, al fine di capire perché molte gravidanze non riescono a giungere al termine, offrendo una speranza alle donne infertili. IL RUOLO NEL CANCRO Le tecniche, però, non sono di per sé eticamente né buone né cattive: tutto dipende dall’uso che se ne fa e CRISPR può essere, per la ricerca sul cancro, uno strumento di svolta. “Oggi sappiamo che una cellula, per diventare tumorale, deve subire una serie di mutazioni a livello genetico ma non sappiamo quali, tra questi geni, siano davvero essenziali per il processo che porta alla malattia” spiega Silvia Deaglio, responsabile dell’Unità di ricerca genetica del sistema immunitario APRILE 2016 | FONDAMENTALE | 17 RICERCA La tecnica CRISPR MODIFICARE IL DNA La tecnica di editing del DNA chiamata CRISPR/Cas9 è una versione biologica della funzione copia-incolla presente nei nostri software di testo Come funziona Cellula Molecola guida Enzima taglia-DNA Filamento di DNA difettoso Nucleo Cromosoma Si inserisce nella cellula un enzima complesso che contiene: una molecola guida una copia del DNA non mutato Una molecola guida sintetica, disegnata specialmente per lo scopo, trova il filamento di DNA sul quale si vuole intervenire Un enzima taglia il pezzo di DNA su cui si vuole intervenire Filamento sano di DNA Il filamento di DNA difettoso viene sostituito con una copia sana un enzima in grado di tagliare il DNA presso la Human Genetics Foundation di Torino. “Per capirlo possiamo percorrere diverse strade ma la più lineare consiste nel creare cellule o modelli animali in cui disattiviamo, uno a uno, i geni che stiamo studiando e verifichiamo che cosa succede”. Questa tecnica, che si chiama knockout genico, richiede, con i sistemi tradizionali, molto tempo e molte risorse. “Per questo nel nostro laboratorio abbiamo introdotto CRISPR, velocizzando l’intero processo. Nello specifico, studiamo un gene frequenteente mutato nei malati di leucemia linfatica cronica ricre- ando nelle cellule la mutazione che si verifica nel paziente quando si ammala” spiega ancora Deaglio. La scelta di usare CRISPR non è solo legata a questioni di soldi o di tempi, ma anche di precisione. “Questa tecnica di gene editing è molto precisa e ci permette di ‘silenziare’ un gene nella sua posizione normale lungo la sequenza del DNA. Ciò significa che modifichiamo in modo naturale anche tutti quei meccanismi di controllo dell’attività del gene stesso, e di comunicazione con l’ambiente circostante, ricreando in modo quasi perfetto Il vantaggio di lavorare come fa la natura 18 | FONDAMENTALE | APRILE 2016 ciò che accade nella malattia. Le tecniche precedenti, invece, silenziano il gene in modo più brutale e meno preciso, quindi non ci permettono di studiare l’interazione tra questo e i suoi sistemi di regolazione”. MUTAZIONI INDOTTE Oltre a zittire un gene, si può anche sostituirlo con la versione mutata che si trova generalmente nei pazienti. Si tratta di una strategia utilizzata anche in passato, ma di nuovo CRISPR consente di essere molto più precisi. “Immaginiamo il filamento di DNA: con le vecchie tecniche il gene mutato poteva andare a posizionarsi dappertutto lungo la sua struttura, trovandosi a fianco di geni con i quali magari non interagisce mai in natura” spiega Deaglio. “Con CRISPR andiamo a mutare il gene nella sua posizione naturale, mantenendo i rapporti che ha con i suoi vicini”. Il risultato? Se si dimostra che quel gene ha un ruolo chiave nella trasformazione maligna della cellula, si possono costruire farmaci mirati diretti contro il bersaglio genetico principale. E non solo: CRISPR consente di modificare il genoma di un singolo organo nel modello animale, ricreando quello che accade in natura. L’individuo con un cancro al fegato presenta infatti certi geni mutati solo nell’organo malato e non in tutto l’organismo. Con le tecniche più vecchie, l’unico modo per indurre la malattia nel modello animale era provocare la mutazione nella fase embrionale dello sviluppo, col risultato che tutte le cellule del corpo risultavano mutate, non solo quelle dell’organo da studiare. “CRISPR è un salto tecnologico ma anche concettuale, che permette alla ricerca sul cancro di studiare le mutazioni genetiche nel loro luogo d’origine” conclude Deaglio. “Grazie a esso riusciremo a velocizzare lo studio della funzione di tutti i geni che sospettiamo essere coinvolti nella malattia. Perché è questo, oggi, il nostro problema: come in un giallo con troppi potenziali sospetti, facciamo fatica a capire chi ha compiuto il delitto. Ma ora abbiamo uno strumento di indagine di grande aiuto per trovare il vero responsabile”.