07/01/2015
Bioconversioni o Biocatalisi
Cosa
sono ?
Modificazioni chimiche
di composti organici
operate da enzimi e da
microrganismi.
Usarli
perché…
•Catalizzatori più efficienti
rispetto alla catalisi chimica
•Basso impatto ambientale
•Si possono combinare
•Ampio spettro di substrato
•Catalizzatori multifunzionali
•Enantio, regio-selettività
Bioconversioni e Biocatalisi
Svantaggi-Limitazioni
•Condizioni controllate
-sensibili alle variazioni di pH, Temperatura, ecc
•Ridotta efficienza in solventi organici
-utilizzati per solubilizzare substrati apolari
•Enantioselettività
-quando serve l’enantiomero non prodotto
•Inibizione da prodotto
-diminuzione delle rese del processo
Stereoisomeria e Proprietà
H2NCOCH 2
NH2
CO2H
F
H
(S) – Asparagina
Sapore amaro
O
HOOC
CH2CONH22
F
H
NH2
(R)- Asparagina
Sapore dolce
O
(S)-Carvone
Aroma Cumino
(R)-Carvone
Aroma Menta
H
H
Me
F3C
O
Me
O
O
N
CO2BuS
(S)-Fluazifop butyl
Non attivo
CF3C
N
(R)-Fluazifop butyl
Erbicida
Settore
Agrochimico
OH
ButR
N
O
BuOOCS
OH
Cl
Settore
Alimentare
N
N
(2R,3R)-Paclobutrazol
Fungicida
R But
N
N
ClD
N
(2S,3S)-Paclobutrazol
Regolatore della crescita delle piante
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Stereoisomeria e Proprietà
NH
NH
OH
OH
OH
Et
Et E
H
(S,S)-Ethambutol
Tubercolostatico
H
O
O
D
NH
(S)-Thalidomide
Sedativo
Anti-emetico
(R)-Thalidomide
Teratogenico
N
NH
O
O
OH
HO
OH
HO
NHCOCHCl 22
O2N
Cl2CHCONH 2
(R,R)-Cloramfenicolo Antibatterico
NO22
(S,S)-Cloramfenicolo
OH
Non attivo
HO
H
O
OHD
H O
O
D
O
O
H
Settore
Farmaceutico
(R,R)-Ethambutol
Causa cecità
NH
H
H
N
Et
NH
E Et
H
CH2NHPr'R
R
(S)-Propranolol
Agente b-bloccante
O
Pr'NHCH 2
(R)-Propranolol
100 volte meno attivo dell’isomero (S)
Bioconversioni e Biocatalisi
Biocatalizzatore
Forma
Vantaggi
•Possibilità di reazioni indesiderate
•Substrati insolubili
•Necessità di estrazione
•Facile realizzazione del processo
•Solubilizzazione dei substrati
•Facile recupero degli enzimi
•Bassa attività
Immobilizzati
•Facile recupero degli enzimi
•Uniformità nelle conversioni
•Ridotto rischio di contaminazioni
•Parziale
perdita
dell’attività
durante l’immobilizzazione
•Elevato
costo
dell’immobilizzazione
Cellule in crescita
•Elevata attività
•Possibilità di catalizzare reazioni
multienzimatiche o richiedenti cofattori
•Grande quantità di biomassa
•Prodotti secondari
•Composizione
chimica
meno
definita
•Difficoltà nel controllo del processo
Cellule non proliferanti
•Semplicità del sistema
•Pochi prodotti secondari
•Possibilità di catalizzare reazioni
multienzimatiche o richiedenti cofattori
•Bassa attività
•Composizione
definita
chimica
meno
Cellule immobilizzate
•Possibilità di riciclo di cellule
Possibilità di catalizzare reazioni
multienzimatiche o richiedenti cofattori
•Modificazioni graduali nelle condizioni
di reazione consentono adattamenti a
nuovi livelli in processi continui
•Bassa attività
•Composizione
definita
chimica
meno
Sospesi
organici
Cellule intere
Svantaggi
•Alta attività enzimatica
sciolti in acqua
Enzimi isolati
in
solventi
Produzione di “fine chemicals” tramite
biocatalisi
CN
Nitrile Idratasi
H2O
NH 2
O
acrilnitrile
acrilamide
30.000 tons/year
HO
OH
HO
OH
OH
OH
OH
O
fruttosio
250.000 tons/year
OH
O HO
OH
O
OH
OH
lattosio
250.000 liters/day
OH
OH
glucosio
HO
OH
O
Glucosio Isomerasi
O
HO
HO
b-galattosidasi
OH
HO
HO
OH
OH
O
+
OH
OH
glucosio
O
HO
OH
OH
galattosio
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Sviluppo di un processo di BIOCATALISI
• Isolamento di microrganismi con attività metaboliche “interessanti”
• Studio e caratterizzazione dei geni e delle attività coinvolte
• Sviluppo del Biocatalizzatore:
ricerca Ospite (GRAS, Generally Recognized As Safe)
sviluppo ed ottimizzazione del sistema di espressione dell’attività catalitica (Biologia Molecolare)
caratterizzazione dell’attività catalitica (specificità di substrato)
ricerca ed ottimizzazione delle condizioni colturali (composizione, parametri chimico-fisici)
scale-up
Pseudomonas fluorescens ST
O
COOH
CHO
TCA
Stirene
Monossigenasi
Stirene Ossido
Isomerasi
Fenilacetaldeide
Deidrogenasi
Clonaggio Geni del Sistema Stirene Monoossigenasi
Pseudomonas fluorescens ST DNA
3 Kb
E. coli JM109
pTAB19
PCR
1.9 Kb
f1 - ori
HindIII
SmaI
pUC18R
MCS
EcoRI
pTZ18R
T7 Promoter
Lac Promoter
Amp r
pBR322
ori
Espressione della Stirene Monoossigenasi
Analisi HPLC/GC
Analisi SDS-PAGE
(produzione di epossido)
T0 T1.5 T3 T0 T1.5 T3
SMO
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Retention time (min)
9
10
11
12
+ +
+ -
- -
3
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L’attività della SMO è completata dalla ProteinaB
(una flavoreduttasi)
O2
O
H20
SMO
Stirene
FAD
FADH2
Epossistirene
Proteina B
NAD+
NADH + H+
Processo di Bioconversione
•Crescita in terreno minimo per 16h (o.n.) a 37°C
•Induzione con IPTG 1mM (in crescita)
•Risospensione cellule O.D.600=2
•[Aggiunta co-solvente (ad es. Isoottano 30% v/v)]
•Aggiunta substrato
•Bioconversione per 3-24h a 30°C
•Analisi HPLC [GLC] dei brodi colturali
•Recupero/purificazione epossidi
•Analisi qualitativa dei prodotti (NMR, aD, massa..)
Un esempio “semplice”di bioconversione:
produzione di indaco
Prodotto di colore blu intenso, la cui domanda è aumentata
esponenzialmente con la produzione in grande scala dei
blue-jeans
Originalmente estratta da un fiore di origine tropicale
(pervinca), poi produzione chimica
Produzione industriale tramite microrganismi
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Un esempio “semplice”di bioconversione:
produzione di indaco
L’indolo viene prodotto in E .coli
come prodotto di degradazione
del triptofano
La stirene monoossigenasi da
Pseudomonas stutzeri catalizza
una reazione che porta alla
produzione di indaco
Batteri prototrofi come E. coli possono essere utilizzati per
la sintesi biocatalitica dei nucleotidi
Le pirimidine (ad es.) sono un punto di partenza per la
sintesi di diverse classi di farmaci
(antitumorali, antivirali, antiinfettivi)
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Ingegneria metabolica per la stimolazione di
produzione di UMP
Allosteric domain (AD)
For UMP inhibition
Da: Ecocyc (www.ecocyc.org)
Amplificazione del gene carBDCTD
Primer 1
Primer 2
•Tramite amplificazione con primer appositi, possiamo ottenere un
frammento del gene carB deleto per la parte CTD (dominio allosterico per
UMP)
•Il gene carBDCTD può essere clonato su un vettore di espressione ed
espresso nel ceppo privato del gene WT, oppure reinserito mediante
tecniche di sostituzione allelica al posto del gene carB WT
Biosintesi delle pirimidine
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Altri meccanismi di regolazione nella via di
biosintesi delle pirimidine
Turnbough C L , and Switzer R L Microbiol. Mol. Biol. Rev.
2008;72:266-300
Clonaggi successivi permettono l’overespressione
di più geni della stessa via metabolica
HindIII
XbaI
BamHI
EcoRI
pyrB
Plac
Ottimizzazione del processo a
livello genetico
UmpH
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Sostituzione allelica/inattivazione
Da dove arriva lred?
• Prima della strategia di inattivazione genica occorre
trasformare il ceppo di E. coli con un plasmide che porti
il gene lred (ricombinasi del batteriofago l)
Una volta effettuata la ricombinazione lred-dipendente, il plasmide
viene eliminato per controselezione:
1) Crescita a temperatura non permissiva per l’origine di replicazione
del plasmide
Il trasferimento di pathway
biosintetici comporta ovvi problemi
• Dimensione del pathway biosintetico (Mb)
• Riconoscimento dei promotori nel sistema
eterologo
• Bilanciamento tra l’espressione dei diversi
operoni facenti parte del pathway
• Conoscenza di tutti i componenti del
pathway biosintetico
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