(Microsoft PowerPoint - Produzione Anticorpi Monoclonali [modalit
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ANTICORPI MONOCLONALI (mAb) TECNOLOGIA DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI ISOLAMENTO DEI LINFOCITI B FUSIONE CON CELLULE TRASFORMATE (CELLULE MIELOMATOSE) CELLULE IBRIDE IMMORTALI TECNICA DEGLI IBRIDOMI DI KOHLER E MILTEIN Linfociti splenici di un animale immunizzato sono mescolati con una linea di cellule di mieloma in presenza polietilen glicol (PEG) Le cellule mielomatose sono geneticamente prive dell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi (HGPRT) TECNICA DEGLI IBRIDOMI DI KOHLER E MILTEIN Le cellule ibride ereditano: la specificità antigenica dalla cellula B l’immortalità dalla cellula tumorale TECNICA DEGLI IBRIDOMI DI KOHLER E MILTEIN Linfociti splenici di un animale immunizzato sono mescolati con una linea di cellule di mieloma in presenza di un reagente fusogenico, in genere polietilen glicol (PEG) Le cellule di mieloma sono geneticamente prive dell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi (HGPRT) per cui sono incapaci di biosintetizzare, a partire dall’ipoxantina, le purine guanina e adenina Le cellule ibride ereditano la specificità antigenica dalla cellula B normale e l’immortalità dalla cellula tumorale Nella miscela di fusione si troveranno: cellule mielomatose cellule spleniche cellule di fusione mieloma-milza cellule di fusione mieloma-mieloma cellule di fusione milza-milza La miscela di fusione è posta in un mezzo contenente hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) (ipoxantina, aminopterina e timidina) L’aminopterina è una tossina potente che blocca la via metabolica principale delle purine catalizzata dalla diidrofolato-riduttasi La timidina è aggiunta per superare il blocco causato dall’inibizione della diidrofolatoriduttasi Le cellule spleniche muoiono in coltura dopo 1-2 settimane Le cellule mielomatose muoiono in HAT Le cellule ibride sopravvivono poiché possiedono l’immortalità cellule mielomatose utilizzano vie metaboliche alternative cellule spleniche Le cellule di ibridoma capacità tipica delle cellule spleniche di produrre Ab Ogni pozzetto viene testato per la produzione dell’Ab desiderato ELISA Le cellule positive vengono clonate diluendole a meno di una cellula/pozzetto in piastre da 96 pozzetti Nel sovranatante del clone MoAb secreti Schema riassuntivo Iniezione dell’Ag purificato Isolamento delle cellule della milza Cellule di mieloma Fusione delle cellule Selezione delle cellule di ibridoma in mezzo HAT Inseminazione di singole cellule nei micropozzetti Cellule in coltura Gli Ab vengono secreti nel mezzo di coltura Saggio del mezzo di coltura per la ricerca di MoAb che reagiscono con l’Ag Congelamento di uno stock di cellule Isolamento di MoAb dal mezzo di coltura
