ANTICORPI
MONOCLONALI (mAb)
TECNOLOGIA DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI
ISOLAMENTO
DEI LINFOCITI B
FUSIONE CON CELLULE
TRASFORMATE
(CELLULE MIELOMATOSE)
CELLULE IBRIDE
IMMORTALI
TECNICA DEGLI IBRIDOMI
DI KOHLER E MILTEIN
Linfociti
splenici
di
un
animale
immunizzato sono mescolati con una linea
di cellule di mieloma in presenza polietilen
glicol (PEG)
Le
cellule
mielomatose
sono
geneticamente
prive
dell’enzima
ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi (HGPRT)
TECNICA DEGLI IBRIDOMI
DI KOHLER E MILTEIN
Le cellule ibride ereditano:
la specificità antigenica dalla cellula B
l’immortalità dalla cellula tumorale
TECNICA DEGLI IBRIDOMI
DI KOHLER E MILTEIN
Linfociti splenici di un animale immunizzato sono
mescolati con una linea di cellule di mieloma in presenza
di un reagente fusogenico, in genere polietilen glicol
(PEG)
Le cellule di mieloma sono geneticamente prive
dell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi
(HGPRT) per cui sono incapaci di biosintetizzare, a
partire dall’ipoxantina, le purine guanina e adenina
Le cellule ibride ereditano la specificità antigenica
dalla cellula B normale e l’immortalità dalla cellula
tumorale
Nella miscela di fusione si troveranno:
cellule mielomatose
cellule spleniche
cellule di fusione mieloma-milza
cellule di fusione mieloma-mieloma
cellule di fusione milza-milza
La miscela di fusione è posta in un mezzo
contenente hypoxanthine-aminopterin-thymidine
(HAT) (ipoxantina, aminopterina e timidina)
L’aminopterina è una tossina potente che
blocca la via metabolica principale delle purine
catalizzata dalla diidrofolato-riduttasi
La timidina è aggiunta per superare il
blocco causato dall’inibizione della diidrofolatoriduttasi
Le cellule spleniche
muoiono in coltura
dopo 1-2 settimane
Le cellule mielomatose
muoiono in HAT
Le cellule ibride
sopravvivono
poiché
possiedono l’immortalità
cellule mielomatose
utilizzano vie
metaboliche alternative
cellule spleniche
Le cellule di ibridoma
capacità tipica delle cellule
spleniche di produrre Ab
Ogni pozzetto viene testato per la
produzione dell’Ab desiderato
ELISA
Le cellule positive vengono clonate
diluendole a meno di una
cellula/pozzetto in piastre da 96
pozzetti
Nel sovranatante del clone
MoAb secreti
Schema riassuntivo
Iniezione
dell’Ag purificato
Isolamento delle
cellule della milza
Cellule di mieloma
Fusione
delle cellule
Selezione delle cellule
di ibridoma in mezzo HAT
Inseminazione di singole
cellule nei micropozzetti
Cellule in coltura
Gli Ab vengono secreti nel
mezzo di coltura
Saggio del mezzo di coltura
per la ricerca di MoAb che
reagiscono con l’Ag
Congelamento di
uno stock di cellule
Isolamento di MoAb
dal mezzo di coltura
