BASI MOLECOLARI DELL'AZIONE DEL DOMINIO AUTOINIBITORIO DELLA Ca 2+ATPasi DEL PLASMALEMMA DELLE CELLULE VEGETALI
Laura Luoni, Silvia Meneghelli, M.Cristina Bonza e M.Ida De Michelis
Dipartimento di Biologia, Università di Milano
La Ca2+-ATPasi del plasmalemma (PM) delle cellule vegetali è un enzima la cui attività è
regolata dall'interazione diretta, Ca+2-dipendente, con la proteina citosolica calmodulina
(CaM). Il sito di legame della CaM nella Ca2+-ATPasi del PM delle cellule vegetali è
localizzato nell'estesa porzione N-terminale della proteina; in assenza di CaM, l'Nterminale agisce da repressore interno dell'attività dell'enzima.
Studi condotti sull'analogo enzima del PM delle cellule animali, che differisce da quello
vegetale per la localizzzazione del sito di legame della CaM che agisce da repressore
interno nella porzione C-terminale, hanno consentito l'identificazione di due sequenze
interne al corpo della molecola che interagiscono con il dominio autoinibitorio contenente
il sito di legame della CaM all'enzima. Uno dei due siti di interazione è costituito da una
breve sequenza di 8 aa localizzata all'interno della grande unità citoplasmatica, compresa
tra il 4° e il 5° dominio trasmembrana e contenente il sito di formazione dell'aspartilfosfato e il sito di legame dell'ATP; l'altro sito di interazione è costituito da una sequenza
di circa 80 aa localizzata nell'unità citoplasmatica che protrude fra il 2° e il 3° dominio
trasmembrana.
Grazie alla recente identificazione del primo gene codificante per una Ca2+-ATPasi del PM
di Arabidopsis thaliana (At-ACA8) è stato possibile individuare due sequenze
aminoacidiche analoghe a quelle dell'enzima animale e putativamente coinvolte
nell'interazione intramolecolare con il dominio autoinibitorio. La sequenza più corta,
denominata KAIL, è stata prodotta come peptide sintetico mentre quella più lunga,
denominata TM2-TM3, è stata sovraespressa in E. coli come proteina di fusione con la GST
e successivamente purificata per cromatografia di affinità su resina di glutatione sefarosio,
previo taglio proteolitico della GST. Sono attualmente in corso studi per analizzare l'effetto
dei putativi interattori intramolecolari sull'attività idrolitica della Ca 2+-ATPasi del PM
purificato da cellule in coltura di A. thaliana; inoltre, attraverso esperimenti di overlay, si
sta analizzando la loro interazione con l'enzima intero o porzioni di esso.
Altro. (fax: 02/50314815; tel: 02/50314824)
