Presentazione di PowerPoint - e

Proteine di interesse terapeutico
• Proteine come farmaci (es. insulina, anticorpi, ormoni,
anticoagulanti, fattori della coagulazione)
• Proteine come antigeni per la produzione di vaccini (es.
HBsAg)
La produzione
industriale di proteine
terapeutiche richiede
l’uso della tecnologia
del DNA ricombinante
per ottenere le elevate
quantità di proteina
necessarie
Caratteristiche dei sistemi di produzione di
proteine terapeutiche
Biosintesi dell’insulina nelle cellule b del pancreas
Catena A
Catena B
21 aa
30 aa
Unite da due ponti S-S
ESONE 1
ESONE 2
PREPROINSULINA
Peptide segnale
PROINSULINA
C
B
A
INSULINA
Nell’apparato di Golgi un
enzima rimuove 33 aa
che costituiscono il
peptide C
PRODUZIONE DI INSULINA
RICOMBINANTE IN BATTERI
- Plasmidi separati codificano per la catena
A e B in ceppi di E. coli separati
- Le catene A e B sono prodotte sotto il
controllo del promotore lac come proteine di
fusione con la regione N-terminale di LacZ
- Le sequenze LacZ sono eliminate con
trattamento con bromuro di cianogeno
(scinde legami Met-X)
- Le catene A e B sono mescolate assieme e
tramite un processo chimico in condizioni
ossidanti si formano i ponti S-S e viene
purificata la forma nativa
Produzione di insulina ricombinante nel lievito
Saccharomyces cerevisiae (via della proinsulina)
Pro-insulina fusa al peptide segnale dell’a-factor per produrre insulina
secreta. Processamento mediato dalla proteasi Kex2, mini-peptide C,
catena B mancante di Thr30 (che viene aggiunta in un secondo
momento mediante transpeptidazione).
Espressione costitutiva sotto il controllo del promotore TPI (triosofosfato isomerasi)
Schema del processo
industriale di
produzione
dell’insulina
ricombinante
mediante la via della
proinsulina.
Analoghi dell’insulina approvati per l’uso come farmaci
Proprietà farmacocinetiche degli analoghi dell’insulina
Eritropoietina
L’eritropoietina (EPO) è un ormone
che stimola la produzione di globuli
rossi. E’ una glicoproteina di 165 aa
con 4 catene di carboidrati (3 N- e 1
O-glicosilazione). La N-glicosilazione
è necessaria per la secrezione e la
stabilità dell’EPO nel plasma. La Oglicosilazione non sembra avere
influenza sull’attività biologica
dell’EPO.
EPO ricombinante prodotta in CHO e
in lievito
Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris
Espressione sotto il controllo
del promotore AOX1, segnale di
secrezione a-factor, induzione
per 40 ore, resa 50 mg/L (12-13
copie del vettore integrate nel
genoma)
Harvested
Fermentation Broth
Centrifugation
Produzione di eritropoietina
umana in Pichia pastoris
Microfiltration
Ultrafiltration #1
Blue-dye Chromatography
Hydroxyapatite Chromatography
* Cation Exchange Chromatography #1
Ultrafiltration #2
PEGylation
Cation Exchange Chromatography #2
Ultrafiltration #3
Sterile Filtration
Final Product
*This step was only applied at scales larger than 40 liters
Struttura degli anticorpi
In base al tipo di
catena pesante:
IgG, IgE, IgD
monomeriche
IgA dimeriche
IgM pentameriche
Ponti disolfuro
Glicosilazione
Risposta immunitaria e
organizzazione genica delle IgG
Anticorpi monoclonali
Linee cellulari stabilizzate
- linfociti + cellule di mieloma HGPRTin presenza di un agente di fusione
-crescita su terreno selettivo HAT
(ipoxantina, aminopterina, timina)
-L’aminopterina è un antibiotico che
inibisce la sintesi de novo degli acidi
nucleici. Ipoxantina e timina
permettono di sopravvivere a cellule
HGPRT+, che possono usare le vie di
recupero
HGPRT è un enzima della via di
recupero delle purine.
Produzione di anticorpi nel
lievito Pichia pastoris
Ceppo ingegnerizzato per
produrre oligosaccaridi del tipo
Man5GlcNAc2
Espressione sotto il controllo
del promotore AOX1
Resa 1.26 g/l dopo 146 ore di
coltura con biomassa circa 400
g/l peso fresco di cellule (8.6
mg/l/ora)
Utilizzo di anticorpi in terapia
• Campi di applicazione clinica
–
–
–
–
Malattie cardiovascolari
Malattie infiammatorie e autoimmuni
Immunosoppressione
Neoplasie ematologiche ed epiteliali
• Uso in terapia anticancro: proprietà dell’antigene bersaglio
– Espressione stabile e omogenea nelle cellule tumorali, trascurabile in
cellule sane
– Elevata densità di espressione
– Mancanza di forme circolanti
– Capacità di attivare i processi di morte cellulare
• Anticorpi chimerici (80% umani): i domini costanti della molecola
murina sono stati sostituiti con le loro rispettive controparti umane
prendendo le sequenze geniche della catena leggera k e della catena
pesante delle IgG1, le Ig più efficienti ad attivare il complemento e la
citotossicità delle cellule effettrici
• Anticorpi umanizzati (95% umani): le CDR murine sono state inserite
in anticorpi umani
Murino
Chimerico
Umanizzato
Anticorpi: come uccidono le cellule tumorali
Azione diretta
• Citotossicità complementomediata
quando proteine del complemento
legano la Fc dell’anticorpo che si è
legato alla cellula bersaglio, la
cellula va incontro a lisi
• Citotossicità cellulare anticorpodipendente
la Fc dell’anticorpo legato alla
cellula bersaglio è riconosciuta da
suoi recettori su cellule effettrici ed
avviene lisi cellulo-mediata o
fagocitosi della cellula tumorale
• Apoptosi
Agisce in questo modo Rituximab
Azione indiretta
• Inibizione della crescita
• Alterazioni del ciclo cellulare
La trasduzione del segnale è inibita
perché l’anticorpo si lega al
recettore per un fattore di crescita
sulla cellula tumorale in modo da
bloccare il legame del ligando
endogeno portando all’inibizione
della fosforilazione di recettori
tirosin-chinasici e di eventi di
segnalazione a valle della cascata
regolativa.
Sfruttano questi meccanismi
Trastuzumab, Cetuximab e
Bevacizumab
Rituximab
Anticorpo chimerico diretto diretto contro CD20. E’ stato il primo anticorpo
monoclonale ad avere successo nella terapia per il linfoma non-Hodgkin e ad
ottenere le licenza dalla FDA nel 1997.
CD20 è una proteina trans-membrana con le seguenti proprietà:
• è espressa a livelli elevati sul 95% delle cellule B affette da linfoma, ma non
su altre cellule del corpo
• è espressa sui linfociti B sani ma non sui loro precursori immaturi
(permettendo la ricostituzione di un compartimento di cellule B dopo la
terapia) e sulle plasmacellule (permettendo una produzione continua di
immunoglobuline)
• dopo il legame con l’ anticorpo non va in circolo nel plasma e non viene
internalizzata
• è essenziale per il differenziamento e la proliferazione dei linfociti B
L’attivazione del complemento è fondamentale nell’efficacia dell’anticorpo
ma è molto importante anche l’induzione dell’apoptosi mediante influsso di
calcio.
Trastuzumab (Herceptin)
Anticorpo IgG1 umanizzato diretto contro HER2
• HER2 è un proto-oncogene che codifica il recettore tirosin-chinasico del
fattore di crescita epidermico umano
• Il recettore HER2 è una proteina transmembrana che si trova su numerosi
tessuti epiteliali e che viene iper-espressa nel 20-30% dei casi di tumore al
seno (>2 milioni di copie contro 20000-50000 nelle cellule epiteliali normali).
L’ iper-espressione di solito è dovuta ad una amplificazione del gene
• Trastuzumab lega con alta affinità HER2 ed induce l’internalizzazione del suo
recettore e quindi il blocco della trasduzione del segnale
• I tumori con iper-espressione di HER2 vengono identificati o mediante
analisi immunoistochimica (positività a HER2-3) o con la FISH (evidenzia la
presenza di amplificazione genica)
• È stato il primo anticorpo monoclonale contro tumori solidi ad essere
approvato dalla FDA. E’ riconosciuto come agente singolo nella terapia di
seconda linea nei tumori al seno HER2+ metastatici
Cetuximab
Anticorpo monoclonale chimerico IgG1 diretto contro il recettore dell’ EGF che
blocca il ciclo cellulare a livello G0/G1, attraverso l’espressione di p27. Induce
inoltre apoptosi attraverso l’espressione di fattori pro-apoptotici (Bax, caspasi
3, 8 e 9) o tramite l’inattivazione di fattori anti-apoptotici (Bcl-2) e inibizione
della produzione di fattori proangiogenici
•EGFr è una proteina transmembrana di 170 kDa con un dominio intracellulare
tirosin-chinasico
•È iper-espressa in molti tumori epiteliali
•Cetuximab compete con il ligando endogeno di EGFr per il legame al suo
dominio extracellulare. Una volta legato, il complesso viene internalizzato ma
senza l’attivazione della funzione tirosin-chinasica, quindi si blocca il pathway
cellulare. Inoltre, induce anche down-regulation del recettore sulla superficie
cellulare.
•È stato approvato dalla FDA nel febbraio 2004 per il trattamento del cancro
colorettale metastatico EGFr+
Bevacizumab
È un anticorpo monoclonale umanizzato che inibisce la segnalazione angiogenica
legando VEGF in modo da prevenire la sua interazione con VEGFr1 e VEGFr2.
Ha ricevuto l’ approvazione della FDA nel 2004 come trattamento di prima linea per il
cancro colorettale metastatizzato in associazione con 5-FU
•VEGF è un fattore di crescita proangiogenico che regola la proliferazione e la
permeabilità vascolare ed è un fattore antiapoptotico per i nuovi vasi sanguigni
•Agisce tramite due recettori, VEGFr1 e VEFGr2, che sono espressi sull’endotelio
vascolare. La loro espressione in genere aumenta in risposta a ipossia, oncogeni e
citochine.
g-carbossilazione delle proteine
La cascata della coagulazione del sangue
• Disordini genetici della coagulazione:
– emofilia A (fattore VIII)
– emofilia B (fattore IX)
• La World Federation of Haemophilia stima che nel mondo ci
siano 400.000 emofiliaci.
• La produzione dei fattori della coagulazione necessari per
questi pazienti attraverso la tecnologia del DNA ricombinante
permette di superare i problemi di contaminazioni virali che
rendono meno sicuri i derivati del plasma.
Fattore VIII
Il fattore VIII è una proteina di 2332 aa che ha una struttura a domini
A1-A2-B-A3-C1-C2. Il dominio B viene inizialmente rimosso e nel
plasma il fattore VIII è associato al fattore di von Willebrandt (vWF),
che lo stabilizza. Il dominio C2 è coinvolto nel legame a vWF e alle
membrane.
Fattore VIII ricombinante
• Espresso in cellule di mammifero BHK e CHO a livelli bassi: secrezione
poco efficiente. Costi molto elevati (oltre 100.000 $/anno per
paziente)
• Produzione di fattore VIII ibrido uomo/maiale (sequenze FVIII di
maiale in domini A1 e A3 aumentano livelli di espressione
migliorando la velocità di secrezione) in un sistema lentivirale sotto il
controllo del promotore EF-1a in cellule BHK
• Livelli di espressione: 9 pg/cellula/giorno cioè circa 7.3 mg in 2.5 l
raccolto dal giorno 3 al giorno 7 di coltura
• Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico su
SulfoPropyl-Sepharose: 4.9 mg di fattore VIII con elevata purezza
Fattore VIII ricombinante
Espressione del Fattore IX in cellule CHO
Fattore IX (415 aa) espresso
in CHO a 180 mg/ml (forma
attiva solo 1.5 mg/ml).
I livelli di espressione
aumentano se viene coespressa la furina (proteasi
che rimuove un peptide
segnale necessario per la gcarbossilazione).
Approvato con il nome
BeneFIX nel 1998.
Fattore VIIa
ricombinante
Il fattore VII è espresso in cellule BHK
come proteina a singola catena.
L’attivazione (proteolisi R152-I153) è
spontanea. Purificazione mediante
cromatografia a scambio ionico,
cromatografia di affinità su anticorpo
monoclonale contro il dominio Gla e
altre due cromatografie a scambio
ionico.
Il fattore VIIa è indicato nei pazienti
con emofilia A o B che hanno
sviluppato anticorpi inibitori contro i
fattori VIII o IX.