Casi studio di piante con contento di sostanze nutraceu2che

Casi studio di piante con contento di sostanze nutraceu.che o<enute mediante ingegneria gene.ca Antonella Leone Dipar.mento di Farmacia Università di Salerno Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. •  amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete •  barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale GOLDEN RICE: Il riso dorato
Vitamina A
La vitamina A (retinolo) è essenziale alla
crescita umana.
Il nostro corpo non produce vitamina A, e la
possiamo incamerare dalla dieta per due vie:
- 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il
vitamina A nell’intestino.
- Assunzione diretta da alimenti animali e supplementi.
Tutti i carotenoidi che contendono anelli β possono essere convertiti in retinolo,
e una delle più importanti pro-vitamine è il β-carotene
Conversione del beta-­‐
carotene in vitamina A nell’uomo Deficenza in vitamina A
400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in
particolare in Asia e Africa.
circa 2.5 milioni delle morti annue riguardano bambini sotto i 5 anni
VAD rende I bambini particolarmente suscettibili
ad infezioni.
0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa
della VAD
Il ricorso a supplementi in
vitamina A è riuscito a
ridurre I problemi del 50%
nelle aree soggette, ma
ciò risulta molto oneroso e
non utilizzabile in tutte le
aree.
Punto di patyenza
E1
PP
IPP
PP
E2
DMAPP
GGPP-sintasi
PP
due molecole di GGPP
GGPP
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
Sono espressi questi geni nell‘endosperma del riso ??
Biosintesi del
carotenodi
Fitoene
Carotene
Licopene
α Carotene
Luteina
Luteina- 5-6 eposside
β carotene
Zeaxantina
Anteraxantina
Violaxantina
Neoxantina
Biosintesi di terpeni in pinata CYTOPLASM MVA pathway MITOCHONDRIA Ubiquinones FPP Ace.l-­‐Coa AACT x2 Acetoacetyl-­‐CoA HMGS HMG-­‐CoA PMK PMD Cytokinins Thiamine DXR MEP CMS CDP-­‐ME CMK MCS ME-­‐cPP HDS HMBPP MVPP IDS DMAPP IDI IPP IPP IDI DMAPP x3 GGPP x1 x3 x2 FPS Sesquiterpenes DXS DXP CDP-­‐MEP MVP GGPS PLASTID G3P+Pyruvate DMAPP MVA MVK Pyridoxol FPS IPP MHGR MEP pathway FPP Phytosterols Brassinosteroids GPS GPP Monoterpenes Chlorophylls Carotenoids Tocopherols ABA Phylloquinones Plastoquinones Gibberelins Polyprenoids Isoprene GGPS GGPP Diterpenes E1
PP
IPP
Endosperma riso
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
GGPP, il precursore generale dei terpeni, è sintetizzato nell‘endosperma di
cariossidi di riso: il gene GGPP sintasi è espresso ...ma non sono espressi gli a
E1
PP
IPP
Wild-type rice endosperm
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
Difficile esprimere sei geni nella cariosside di riso !!!
I batteri sono più „smart“
transformed
E. coli
Erwinia carotovora operone
crtE
ORF2
ORF3
ORF4
crtX
crtY
crtI
crtB
ORF6
CrtI sostituisce 4 geni vegetali
crtZ
ORF12
Carotene Desaturasi
Cianobatteri e Piante
Batteri
15-cis-Phytoene
E4
E5
15-cis-Phytoen
PDS
Ζ-ISO ??
9, 15, 9‘-tri-cis-z-Carotene
gene CRTI
E6
ZDS
9, 9‘-di-cis-z-Carotene
E7
CRTISO
7, 9, 9‘, 7‘-tetra-cis-Lycopene
all-trans-Lycopene
all-trans-Lycopin
Il gene batterico CrtI costituisce una scorciatoia
B
Plant Desaturation pathway
CrtI
shortcut
A
E1
PP
IPP
Wild-type rice endosperm
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
DMAPP
PP
GGPP
E3
Phytoene
CrtI
Neurosporene
Lycopene
E8
β-Carotene
α, β-Lycopene Cyclase
α-Carotene
Tre geni invece di sei!!!!
Co-trasformazione con due vettori
Gt1p
35Sp
(1)
pZPsC
E3 (PSY)
aph IV
E,4,5,6,7 (tp-CrtI)
35Sp
Gt1p
(2)
pZLcyH
Gt1p
tp
aphIV
E8(ß-LCY)
promotore glutelina, proteina di riserva dell’endosperma di riso
peptide di transito ssRubisco
igromicina fosfotransferasi
‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into
(carotenoid-free) rice endosperm’.
Ye et al., Science 287,303-305 (2000).
Due T-DNA codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore selettivo)
sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation
LB
RB
pro
Narciso 1
ter
LB
pro
Narciso 2
Narciso 1 = phytoene synthase
Narciso 2 = lycopene ß-cyclase
ter
pro
pro
tp
Erwinia
Hyg resis
ter
ter
RB
con il proprio TP e il promotore specifico della
proteina di riserva gluetlina (GT1 promoter)
Erwinia = Erwinia double desaturase – con il TP aggiunto e sotto il controllo del
35SCaMV promoter
La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante (GOLDEN
RICE). La migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene
…Golden rice 1 4,8 – 7,1 µg/g beta carotene
Un secondo costrutto senza il gene per la licopene ciclasi !
aph IV
Gt1p
35Sp
pB19hpc
E3 (PSY) E4,5,6,7 (tp-CrtI)
0.018
0.016
Single transformant
hpc 2b
0.006
α-Carotene
Lutein
0.008
Zeaxanthin
0.012
0.010
non necessario esprimere
la licopene
ß-ciclasi
ß-Carotene
0.014
0.004
0.002
0.000
-0.002
0
20
40
60
80
100
Ye et al., 2000; Science 287:303
We just need to bridge a gap!!
E1
PP
PP
IPP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
Neurosporene
E6
ζ-Carotene Desaturase
Lycopene
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
DMAPP
Wild-type rice endosperm
PP
E3
GGPP
Phytoene
CrtI
E8
β-Carotene
Xanthophylls
α-Carotene
α, β-Lycopene Cyclase
Solo due geni sono necessari!!
Schaub et al. (2005), Plant Physiol. 138: 441
Produzione del ‘Golden Rice’
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y.,
Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of
Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23:482-487.
In molte pathways biosintetiche multi steps esistono degli steps limitanti.
Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di
PSY (gene codificante per la phytoene synthase) .
Dopo aver provato diversi gene PSY
provenienti da diverse fonti è stato
provato che la combinazione gene
del mais e del riso davano la migliore
combinazione
Produzione del ‘Golden Rice’
Golden Rice2 ottenuto accumula 37
µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ßcarotene circa 23 volte quello del
Golden Rice1.
pZPsC
pZLcyH
pSYN12424
Golden rice 1
37 mg per kg di
cariosside
Golden rice 1
1,6 mg/kg
cariosside
Figura 10.11. Contenuto in provitamina A nel golden rice. a) riso indica non modificato geneticamente e
normalmente privo di carotenoidi nella cariosside; b) golden rice 1 con un contenuto in carotenoidi medio di per kg di
cariosside; c) golden rice 2 con un contenuto in carotenoidi fino a 37 mg per kg di cariosside.
uno degli articoli che presenterete!
Ingegneria metabolica dei carotenoidi in piante diverse Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. •  amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete •  barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Aumento del contenuto in amminoacidi essenziali
Carenza di amminoacidi essenziali ¥ 
Lisina e metionina sono, rispettivamente, gli amminoacidi essenziali
limitanti delle carenti delle proteine di riserva dei semi cereali e dei
legumi
¥ 
Il basso contenuto in Lys e Met diminuisce il valore nutrizionale di
queste due colture del 50–75%, rispetto a diete con un contenuto
bilanciato di amminoacidi essenziali
¥ 
La carenza di questi aa causa deficienze non specifiche nell’uomo,
quali un più alto rischio a contrarre malattie, ritardo mentale e nello
sviluppo fisico di bambini/e
Sindrome conosciuta come PEM Protein-Energy Malnutrition (PEM)
¥ 
¥ 
La WHO stima che circa il 30% delle popoalzione dei Paesi in via di
sviluppo soffre per queste carenze
Via biosinte>ca semplificata della lisina, me>onina, treonina e isoleucina aspartato DHDP di-­‐idrodipicolinato glicina treonina OPH O-­‐fosfo-­‐omoserina ASD aspartato semialdeide AK apartato chinasi DHDP sintasi lisina TS treonina sintasi me>onina SAMS adenosin-­‐me>onina isoleucina CGS cista>onina γ
sintasi MGL me>onina γ liasi LKR/SDH enzima bifunzionale
degradativo
Lys-ketoglutarate reductase/
saccharopine dehydrogenase
SAMS S-­‐adenosin-­‐me>onina sintasi Carenza di amminoacidi essenziali il gene batterico feedbackinsensitive DHDPS gene (isolato
da Corynebacterium glutamicum) sovra-espresso sotto il controllo
di un promotore endosperma o
embrione-specifico (b32 del
gene dell’albumina
dell’endosperma)!
!
Una sequenza “invertita e ripetuta”
corrispondente alla sequenza
parziale del cDNA del gene !
LKR/SDH inserita in un introne di una
cassetta di espressione che contiene
il cDNA del gene CordapA!
!
L’espressione di questo transgene
genera un RNA double-strand del
mRNA del gene LKR/SDH Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine
biosynthesis and catabolism in corn with a
single bifunctional expression/silencing
transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13–
21. Tecnologia RNAi per l’inibizione dell’espressione di un gene Carenza di amminoacidi essenziali Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine biosynthesis and catabolism in corn with a single bifunctional
expression/silencing transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13–21. ‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a
nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’
Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)
La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per
produrre alimenti, mangimi, amido e alcool.
Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina
La proteina AmA1 presenta una serie di vantaggi :
(i) rispetto ad altre proteine di riserva dei semi, ha una
composizione amminoacidica molto equilbrata, superiore a
alla composizionale ottimale consigliata dalla WHO;
(ii) è una proteina non allergenica
(iii) rispetto ad altre proteine di riserva dei semi, AmA1 è
codificata da un singolo gene à aspetto utile per la
trasformazione genetica
‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a
nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’
Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)
La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per
produrre alimenti, mangimi, amido e alcool.
Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina
Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la
produzione di albumina in nei semi presentano un buon bilanciamento
aminoacidico
2 costrutti
alternativi.
Promotore
constitutivo o
tuberospecifico
(
p35S CaMV
AmA1
pGBSS
AmA1
Nos 3’
Nos 3’
pSB8
pSB8G
l’espressione nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si
utilizza il promotore GBSS (granule-bound starch synthase )
piuttosto chi il 35S
‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a
nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’
Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)
Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche
contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato
Contenuto proteico totale incrementato del 35-45%
8-
Fold
increase
4-
1D E S G H R T A P Y V M C I L F K
Amino acid
Le piante producono il doppio rispetto al wild-type
L’albunia di Amaranthus non è allergenica :
- già utilizzata come farina in Messico e Sud America
- test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche
Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. •  amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete •  barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Inulina u 
u Oligosaccaride di riserva tipico delle Asteraceae (Composite).
u Polimero solubile di fruttosio, non digeribile dall’uomo
u Capacità di favorire la digestione e ridurre la produzione di gas intestinali
u Capacità di elevare la percentuale di Bifidobacteria nella flora microbica
intestinaleà diminuzione della carica batterica di batteri nocivi
u Aumentato assorbimento di calcio, ferro e magnesio
u Non aumenta la glicemia à adatta anche all'alimentazione dei diabetici
u Possibile effetto positivo sulla concentrazione di colesterolo e trigliceridi
nel siero
u Possibile effetto protettivo nei confronti del cancro al colon
u Ha un leggero sapore dolce, ma non viene assorbito àdieta diabetici
TipoII
u Il valore energetico è circa la metà di un carboidrato digeribile 1 - 2 kcal/gr
Inulina n o m = numero di unità di fruIosio G = glucosio, F = fruIosio Piante che sinte>zzano inulina • 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Asparago Banana Cicoria Aglio Porro Carciofo di Gerusalemme Cipolla Grano Via biosinte>ca dell’inulina L’enzima 1-­‐SST catalizza la reazione a par>re da due molecole di saccarosio con la formazione di β-­‐D-­‐glucosio e 1F-­‐beta-­‐D-­‐fruIosil saccarosio (la molecola più piccola che può essere classificata come inulina 1-­‐kestoaldoso saccarosio
La sintesi avviene nel vacuolo 1-­‐SST β-­‐D-­‐glucosio 1,6-­‐kestotetraosio β-­‐D-­‐glucosio 1-­‐FFT saccarosio
1-­‐saccarosio-­‐
saccarosio -­‐
fruIosil-­‐
transferasi 1,6-­‐kestotrioso 1,2-­‐β-­‐
fruIano1F fruIosil-­‐
transferasi 1,1-­‐kestotetraosio β-­‐D-­‐
glucosio 6-­‐kestotrioso saccarosio
saccarosio
6G-­‐kestotrioso L’allungamento del polimero di inulina con>nuta grazie all’aggiunta di molecole successive di fruIosio, derivate sempre dal saccarosio, ad opera dell’enzima 1-­‐FFT potato inulin molecule La sintesi dei fruttani avviene nei vacuoli cell.
Vijn I , and Smeekens S Plant Physiol. 1999;120:351-360
©1999 by American Society of Plant Biologists
RB 35S-­‐CaMV 1-­‐SST nos-­‐ter neomycin phosphotransferase II (NPTII) kanamycin resistance gene P nos-­‐5 nptII LB nos-­‐ter pBIN19 RB LB 35S-­‐CaMV 1-­‐FFT nos-­‐ter P nos-­‐5 nptII nos-­‐ter pBIN19 1-­‐SST 1-­‐FFT 1-­‐saccarosio-­‐saccarosio -­‐fru<osil-­‐transferasi 1,2-­‐β-­‐fru<ano 1F fru<osil-­‐transferasi con il pep.de di transito vacuolare Piante di patata trasformate con u 1-­‐SST 2 
3 
4 
5–7
sucrose, !
1-kestose, !
nystose, !
oligofructans piante trasformate piante NT Piante di patata trasformate con u 1-­‐SST DPà degree of polimeriza>on Piante di patata trasformate con u 1-­‐SST + 1-­‐FFT !
Conclusione !
!
aumento del contenuto in Inulin (5% del peso secco dei tuberi
delle piante transgeniche !
Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. •  amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete •  barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Gli acidi grassi Omega-3 and Omega-6 hanno
proprietà nutrizionali e terapeutiche
Omega-­‐3 acido α-­‐linolenico (C18:3 ω-­‐3) EPA (C20:5 ω-­‐3 ) DHA (C22:6 ω-­‐3) Omega-6
o  Acido linoleico
coniugato (CLA)
Perchè gli omega-3 e omega-6
sono benefici per la salute?
Omega-­‐3 • 
prevenzione delle malattie
cardiovascolari
CLA (Conjugated LA) (omega6) • 
aumenta la formazione ossea
• 
miglioramento del sistema
immunitario
• 
attività antiossidante
• 
riduzione dell’infiammazione
• 
migliora le funzioni immunitarie
• 
sviluppo cerebrale dei neonati
• 
• 
sviluppo della retina nei neonati
proprietà anti-diabetiche
(diabete di tipo 2)
• 
migliora l’apprendimento
• 
riduzione della massa grassa
• 
protezione della vista
• 
attività anti-aterosclerosi
• 
ritarda “invecchiamento” mentale… • 
proprietà anticancerogena
Koletzko et al. (2008) - World Association of
Perinatal Medicine Dietary Guidelines Working
Group (2008) J Perinat Med. 36(1) 5-14
J. Am. Coll. Nutr. (2000)
Acidi grassi poliinsaturi:
differenze strutturali e metaboliche
Classe n-6
Classe n-3
H 3C
H 3C
COOH
COOH
Acido Linoleico
Acido α-linoleico
H 3C
H 3C
Acido Arachidonico
H 3C
COOH
COOH
Acido Docosapentaenoico
COOH
Acido Eicosapentaenoico (EPA)
H 3C
COOH
Acido Docosaesaenoico (DHA)
Biosintesi dei principali acidi grassi a catena lunga appartenenti alle famiglie
ω-3 e ω-6
ALA
Enzimi chiamati elongasi e
GLA
desaturasi sono coinvolti nella
biosintesi sia degli acidi grassi ω-3
sia ω-6 e convertono gli acidi
grassi LA e ALA in acidi grassi a
lunga catena
SDA
SDA
Omega-­‐3 Canola and Soybean oil Scientific Progress
n  Multi-gene
Non-­‐transgenic ω-­‐3 90
80
Fatty Acid (wt%)
expression
n  Soybean transformation
n  Omega-3 oil production
100
70
60
50
40
30
Canola
Soybean
Steari-­‐
New
biodonic available
acid Omega-3
18:4 Other polyunsaturates
Monounsaturates
20
10
0
Saturates
Control Biotech
Control
Biotechin CVD
Omega-3
Deficiency
Implicated
Echium oil, derived from the seeds of Echium Plantagineum, is enriched in stearidonic acid (SDA; 18:4 ω-­‐3), which is the immediate product of Δ-­‐6 desatura.on of 18:3 ω-­‐3 to 18:4 Contenuto in LCP-­‐UFA in salmone e in differen. piante transgeniche Aumento della biosintesi di metaboliti
secondari bioattivi
©2011 by American Society of Plant Biologists
Via biosintetica degli
antociani nelle piante
Molto complessa,
molti geni biosintetici
coinvolti
identificati fattori
di trascrizione che
controllano in
maniera coordinata
l’epressione di molti
geni di questa via
metabolica
Antirrhinum majus
delila fattore di trascrizione bHLH( basic-helixloop-helix)
Rosea1 fattore di trascrizione R2R3-MYB
E8 promotore frutto-specifico di un gene della biosintesi dell’etilene (ormone
della maturazione dei frutti climaterici)
WT
del/ros
del/ros
(line C)
(line N)
Analisi molecolare L’espressione della maggior parte dei geni della via biosintetica
degli antociani è attivata nei frutti di piante di pomodoro che sovra-esprimono i
TF Delila e Rosea di Antirrhinum majus
Analisi HPLC Antioxidant capacity of purple compared to red tomatoes
Red tomato –
supplemented
pellets
Purple tomato –
supplemented
pellets
p53-/p53- knockout mice
Life span, pathology
Diet
Number
of mice
Average
Lifespan
(days)
Std
Error
Maximum
Lifespan
(days)
Standard diet
24
142.0
8.7
211
Diet supplemented with 10%
red tomato powder
15
145.9
12.6
213
Diet supplemented with 10%
purple tomato powder
20
182.2
8.6
260
Effect of Chronic Consumption of Anthocyanins on the Sensitivity to ex Vivo IschemiaReperfusion Injury as Assessed by Infarct Size in Rats.Open symbols represent individual
values, and closed symbols are means ± 6 se, n = 10/group. *Different from anthocya...
Martin C et al. Plantcell 2011;23:1685-1699
©2011 by American Society of Plant Biologists
Acido clorogenico
Acido clorogenico
"   Anti-ossidante
"   Protezione contro la
perossidazione dei lipidi
"   Previene la carcinogenesi
rimuovendo radicali tossici
Via biosinte>ca dell’acido clorogenico Aumento di ca 2 volte il contenuto
in CGA nei frutti di pomodoro transgenico
I fitoestrogeni
I FITOESTROGENI
Sono sostanze naturali, prodotte dalle piante, che hanno un’azione
simile agli estrogeni, gli ormoni femminili.
La loro attività biologica, è in media 1000 volte più lieve rispetto agli
estrogeni endogeni prodotti dal corpo umano.
Principali classi
•  ISOFLAVONI
(legumi, soia, lenticchie, piselli,
fagioli)
•  LIGNANI
(cereali, frutta, vegetali)
•  CUMESTANI
(germogli di trifoglio, foraggio)
I RECETTORI ESTROGENICI
FITOESTROGENI
PREVENZIONE DI MALATTIE
CARDIOVASCOLARI
CANCRO AL SENO
OSTEOPOROSI
2
E’ possibile aumentare ulteriormente
il contenuto di isoflavoni nelle piante?
Ingegneria genetica e metabolica
IFS
INGEGNERIA METABOLICA DEGLI
ISOFLAVONOIDI
Isoflavone-sintasi
35S-CaMV
IFS
Biosintesi dei flavonoidi
Plasmide di A. tumefaciens
Piante non trasformate
genisteina
n
IFS1
Piante che sovraesprimono il
gene IFS1
Via biosinte.ca degli isoflavoni Sovra-­‐espressione del gene IFS in combinazione con altri geni della via biosinte.ca degli isoflavoni antisenso
Sintesi di genisteina in piante transgeniche di petunia, tabacco e la<uga Contenuto in genisteina in fruA di pomodoro che sovraesprimono il gene IFS ng /mg FW
Allergia ed allergeni alimentari
Allergia ed allergeni alimentari
Si stima che ca il 2% della
popolazione adulata e più
dell’8% dei bambini soffre di
allergie alimentari.
Principali allergeni presente nelle piante
Oral Allergy Syndrome (OAS) una allergia che si manifesta solo nella bocca
Meccanismi della risposta allergica
Antigen
Presenting
Cells
es
cellule
denditriche
mastociti
produzione di istamine
Ingegneria genetica e riduzione di allergeni /fattori antinutrizionali Target
riso
allergeni
della farina
loglio
allergene
del polline
riduzione di asma
e febbre da fieno
lol p 5
antisenso
patata
glicoalcaloidi
riduzione
tossicità tubero
solanidina-glucosil
trasferasi
antisenso
anche per l’infanzia
Benefici
Prodotto genico
Specie
proteina allergenica
riduzione di
di 16 kDa
asma ed eczema
Tecnologia
antisenso
Il frutto di pomodoro può causare reazioni allergiche i soggetti sensibili:
u OAS
u Urticaria
u Rinite
Lyc e3 un allergene
prodotto nella buccia di
pomodoro
buccia polpa
LTPG1 e LTPG2-à Lipid transfer Protein aspecifiche
Clonaggio del cDNA
silenziamento genico
mediante RNAi
siero di pazienti
allergici
a pomodoro
Tecnologia RNAi per l’inibizione dell’espressione di un gene Vettore puC-RNAi
sense
antisense
Due diversi costrutti per LTPG1 e LTPG2
Analisi Northern
Analisi western
Ques> da> dimostrano una significa>va riduzione di istamina (10-­‐ 100-­‐volte) nei basofili di pazien> allergici con estrae proteici da pomodori silenzia> per la proteina Lec e3 concentrazione dell’allergene
che intervengono nelle reazioni di
ipersensibilità immediata provocando la
Rilascio di istamine nei basofili à
liberazione di istamina.
Sintesi di proteine di interesse farmaceutico
L’ Apo-lipoproteina A-I è la maggiore componente proteica delle
lipoproteine ad alta densità (HDL) nel plasma
questa lipoproteina promuove l’efflusso del colesterolo dai tessuti
verso il fegato per la secrezione.
Espressione di di questo peptide di 18 aa nel frutto di pomodoro sotto
il controllo di un promotore frutto-specifico
Nel vettore binario pBI121 il gene GUS è stato sostituito dalla
sequenza del peptide mimetico apoA-I 6Fsotto il controllo del
promotore frutto-specifico E8
E8 6F Piante transgeniche di promodoro che esprimono il peptide mimetico 6F
dell’apo-lipoproteina apoA-I.
Topi knock-out incapaci di rimuovere
lipoproteine di tipo LDL sviluppano
infiammazioni e aterosclerosi con dieta
ad alto contenuto in grassi
ApoA-I mimetics: tomatoes to the rescue
J. Lipid Res. 2013 54:(4) 878-880.
Questi topi alimentati con pomodori che
esprimono il peptide mimetico 6F hanno
• più bassi livelli di infiammazione
• livelli più alti di HDL
• bassi livelli di acido liso-fosfatidico, che
promuove e accelera la formazione di
placche nelle arterie
Sono in corso ricerche per aumentare
il contenuto di sostanze nutriceutiche
di molte piante alimentari
Sovra-­‐espressione del gene OsNAS in piante di riso ed aumento del contenuto in ferro e zinco nell’endosperma Nico>anamine (NA), un agente chelante è presente ubiquitariamente nelle piante superiori. Nelle graminacee è un precursore dei fitosiderofori, sostanze che sono rilasciate nel suolo dall’apparato radicale e che facilitano l’assorbimento del ferro dal suolo Il gene (OsNAS1), che codifica una nicotianamine
sintasi è stato fuso al promotore di una proteina
seme –specifica (la glutelina) ed usato per
trasformare piante di riso
Concentrazione di ferro e zinco in cariossidi di riso di piante che sovraesprimono il gene OsNAS Alcune piante transgeniche con qualità nutrizionali migliorate
Soia
Quantità di lisina
Quantità di acidi grassi poli-insaturi
Colza
Contenuto in acido erucico
Caffè
Contenuto in caffeina
Pomodoro
aumento di antiossidanti
(licopene etc)