F. Ceroni
16/09/2010
XXIX Scuola Annuale di Bioingegneria. Bressanone, 13 - 17 settembre 2010
Francesca Ceroni
1) DNA ricombinante
Biotecnologie
tradizionali
2) PCR
3) Sequenziamento automatizzato
Biologia
Sintetica
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4) Approccio ingegneristico
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Overview
1) Programma Genetico
2) Clonaggio molecolare
3) Implementazione in cellule
4) Analisi della funzionalità
Il programma genetico
Un insieme di parti genetiche assemblate fra loro che introdotte nella
cellula realizzano un circuito genetico con una funzione di interesse.
funzione
Cellula
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Le componenti del programma genetico
- Geni
- Promotori
- Sequenze RBS
- Terminatori
- siRNA/miRNA/riboswitch
- Plasmide
Il plasmide
Cellula
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Costruzione delle parti biologiche
1) Costruzione de-novo attraverso sintesi chimica
2) Costruzione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)
Parte Biologica
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
95°C
Melting
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T di melting
dei primers
Annealing
72°C
Extending
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T di melting
dei primers
95°C
Melting
72°C
Annealing Extending
Primo Ciclo
Secondo Ciclo
Terzo Ciclo
Overview
1) Programma Genetico
2) Clonaggio molecolare
3) Implementazione in cellule
4) Analisi della funzionalità
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Clonaggio molecolare
Insieme dei passaggi sperimentali per la realizzazione del
programma genetico
Clonaggio molecolare
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Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
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Enzimi di Restrizione
Endonucleasi sito-specifiche in grado di tagliare una sequenza di DNA
Sticky ends
Blunt ends
Sito di Restrizione
Reazione di digestione
DNA + Enzima
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Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
Elettroforesi su gel
Si caricano i campioni nei pozzetti…
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…si applica il potenziale
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Verifica e analisi della corsa su gel
Transilluminatore
DNA ladder
Campioni
Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
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Reazione di ligazione
Ligasi
Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
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Trasformazione batterica: Shock Termico
Batteri - Ca2+ + ligazione
Ca2+
Ca2+
30 min in ghiaccio
Ca2+
Shock termico
Ca2+
1 min a 42°C
2 min in ghiaccio
cellula
1 h a 37°C in agitazione
Clonaggio molecolare
a) Reazione di Digestione
b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel
c) Reazione di Ligazione
d) Trasformazione di cellule batteriche
e) Selezione delle colonie
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Selezione delle colonie
Si piastrano i batteri
Si lascia O/N a 37°C
E’ necessario procedere
allo screening del prodotto
di ligazione
Overview
1) Programma Genetico
2) Clonaggio molecolare
3) Implementazione in cellule
4) Analisi della funzionalità
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Organismo di studio
Membrana plasmatica
Citoplasma
Nucleo
Citoplasma
DNA
Parete cellulare
DNA
Eucarioti
Procarioti
Implementazione del programma nelle cellule
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Overview
1) Programma Genetico
2) Clonaggio molecolare
3) Implementazione in cellule
4) Analisi della funzionalità
Proteine Fluorescenti come Reporter
GFP
λex 501 nm
Promotore
RBS
GFP
RBS
Gene 1
λem 511 nm
Utilizzo di Tag di degradazione
per lo studio del comportamento
Cellula
dinamico
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Microscopia in Fluorescenza
Cellule batteriche
Fluorescenza in singola cellula
Fluorescenza media
Analisi statica!
Analisi dinamica della risposta a livello di singola cellula
La microfluidica vuole consentire l’analisi del comportamento dinamico dei
circuiti genici a livello di singola cellula
Figura tratta da: Bennett M, Hasty J. (2009). Nature Reviews Genetics, 10(9):628-38.
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Quanto altro?
1) Sviluppo di nuove tecnologie per l’automazione
2) Cellula minima e Genoma minimo
Università di Bologna
Dip. di Elettronica, Informatica e Sistemistica (DEIS)
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ICM. Laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare
per lo Studio dei Bionanosistemi.
II Facoltà di Ingegneria Cesena
Prof. Emanuele Giordano
Dott.ssa Alice Pasini
Ing. Simone Furini
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Gel elettroforesi
+
EtBr
Trasformazione Batterica : Elettroporazione
Cuvetta
Elettrodi
Contatti
Batteri+ ligazione
www.wikipedia.org/wiki/elettroporazione
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Implementazione in cellule batteriche
Trasformazione
Implementazione in cellule eucariote
Trasfezione
Trasfezione
MetodiChimici
Fisici
Metodi
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Elettroporazione
Liposomi
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Citometria a Flusso
http://missinglink.ucsf.edu
Espressione Stabile
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Analisi dinamica della risposta a livello di singola cellula
Figura tratta da: Ryley, J. & Pereira-Smith, O. M.. Yeast 23, 1065–1073 (2006).
La Biologia Sintetica… una definizione?
è un nuovo approccio
per rendere più facile l’ingegnerizzazione della biologia (D.Endy)
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